细胞与原生质体培养课件

10植

物

细

胞

培

养10.1细胞培养的概念及种类10.1.1概念植物细胞培养（plantcellculture）是指对游离的植物细胞或细胞小聚体进行的离体无菌培养。CellcultureforUV-elicitationinaPetridish10.1.2种类

根据培养规模:小规模培养和大批量培养；根据培养方式:悬浮培养、单细胞培养等；根据要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞培养。CellculturesforUV-elicitation,onedaybeforeUVexposureBioreactorforcontinuous

cellsuspensionsShakerforsuspensioncultureCulturewheel

（3）特点：细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。

5L光照植物细胞培养罐600～800mg生长旺盛的愈伤组织250ml含30～40ml培养基的三角瓶中90～130r／min连续振荡培养2～3周用100～130目网过滤除去大的细胞团滤液离心收集游离细胞，弃上清液加入适当体积的培养基使细胞悬浮图10-1由培养的愈伤组织中游离单细胞由培养愈伤组织中游离单细胞（4）

单

细

胞

的

游

离由培养愈伤组织中游离单细胞研磨法分离植物单细胞程序（5）悬浮细胞培养方法分批培养：把植物细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界交换外，一切都是密闭的，当培养基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止。连续培养：利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。

在连续培养中，由于新鲜培养基的不断加入，同时旧培养基不断排出，因而，在培养物的容积保持恒定的条件下，培养液中的营养物质能够得到不断补充，使培养细胞能够稳定连续生长。①由完整的植物器官分离单细胞----

叶片是分离单细胞的最好材料

--机械法

--酶解法

撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞机械法:

第一种方法：用刀片刮叶片第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心酶解法:Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心②由培养组织分离单细胞茎段步骤：诱导产生愈伤组织；

愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；（3）植物单细胞培养方法

①看护培养（nurseculture），也称饲喂层培养（feederlayertechnique），是指用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长并增殖的一种单细胞培养方法。②平板培养：将悬浮培养的细胞接种到一薄层固体培养基中进行的培养称之为平板培养1.具一定密度的细胞悬浮液；2.冷却到35℃的琼脂培养基；3.悬浮细胞与35℃的液体琼脂培养基混合；4.倒入无菌培养皿中制成平板。5.在25℃条件下培养21d形成单细胞无性系

③微室培养：是指将含有单细胞的培养液小滴滴入无菌小室中，在无菌条件下，使细胞得以生长和增殖，形成单细胞无性系的培养方法。利用植物细胞大规模培养技术已能生产许多重要的药物和保健品。如长春花碱、紫杉醇、地高辛、东莨菪碱、山莨菪碱、奎宁等重要药物的细胞培养已进入了中试阶段或已进入了规模化生产，日本的紫草素、韩国的人参皂苷、德国的咪叠丁香、美国的紫杉醇、中国的白藜芦醇等已进入了产业化的生产和商品化阶段。香料、调料、食品添加剂、杀虫杀菌剂等一些化合物。从较多的研究资料来看，这些次生代谢物的生产仅仅停留在实验室阶段，培养细胞积累的次生代谢物的产量还很有限10.4.2植物细胞的生物转化生物转化就是利用生物系统把一个分子的一小部分或一部分转化成某一种分子。通过廉价前体生产有价值的、珍贵的植物产品。涉及到水解，加氢、羟基化作用及氧化和还原等步骤。最成功的例子就是β-甲基毛地黄的生物转化。这一化合物是通过甲基化由毛地黄毒苷制备的。毛地黄细胞培养，将这一化合物羟基化为β-甲基异羟基毛地黄苷——强心苷。这是经过12β羟基化作用而形成的，这种化合物被广泛的应用于医学，而至今这一化合物基本上还是由异羟基毛地黄毒苷的化学甲基化法来生产的。10.4.3植物细胞变异体的选择

及人工种子的生产细胞培养使人们在细胞水平上对植物进行改良及诱导游离植物单细胞胚胎发生成为可能，由此而产生植物细胞变异体的选择技术及人工种子开辟了植物细胞培养与利用的新领域。10.4.4重要的实验研究系统

这一重要的实验系统，已被成功地用于植物细胞的脱分化、再分化及植物原生质体细胞壁的再生、细胞的分裂、生长等研究。其生长动态的观察研究为揭示植物细胞生长、分化等相关机理提供了重要的细胞学、遗传学证据。11.1植物原生质体培养的概念植物原生质体（protoplast），就是具有细胞质膜而没有细胞壁的植物细胞。植物原生质体培养就是通过研究植物原生质体分离、培养的条件和发育机理，利用一定的技术和方法，从植物细胞中分离出原生质体，经过离体培养，使其分裂、增殖进而分化成完整植株的技术。

Fig1

PlantregenerationfromprotoplastsofK.blossfeldiana（长寿花）a.Axenicplantusedassourceofleafexplants;

b.leafexplantspreculture;

c.leaftissuebeforeandD.

afterenzymaticdigestion;toplastpurification;

f.

firstcelldivisions;

toplast-derivedcolonies;

h.

visiblesmallcalli;

i.

greencalli;J.

organogenicgreencalli;k.calliwithshoots;

l.rootedshoot;

m.plantacclimatization.Bar

=

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μm原生质体培养的操作实例7a:分离原生质体10天后第1次分裂7b,c:2和3周龄小细胞团7d,e:4和6周龄小愈伤组织7f:转到B5h培养基前8周龄小愈伤组织8a:转到B5H培养基上的小愈伤组织和体细胞胚诱导8b:转到Boi2y培养基上的球形胚8c:转到MS培养基上的子叶期胚以转化为小植株紫花苜蓿叶片原生质体分裂、克隆体的发育及通过体细胞胚再生小植株11.2原生质体分离（1）机械分离法1953年，Yotsuynagi在伊乐藻的叶细胞中发现，当把该叶细胞在一定浓度的氯化钙或硝酸钙溶液中质壁分离持续50d，细胞质还有典型的原生质流。如果把质壁分离的细胞切开，有时可能切掉细胞壁而不损伤其内部结构，从而获得机械法分离的原生质体。机械分离法缺点用机械法分离原生质体的主要缺点是：（1）原生质体的产量一般很低；（2）方法繁琐费力；（3）这种技术只能用于质壁分离会射出原生质体的那些细胞，而不能从分生组织细胞中分离原生质体。（2）酶分离法需要针对使用的材料，选择适合的分离酶种类和分离方法。用于酶法分离植物原生质体的酶类主要有纤维素酶、果胶酶、崩溃酶、半纤维素酶、和蜗牛酶等。纯化后的原生质体与机械法相比，酶法分离植物原生质体有以下优点：（1）容易分离出大量的完整原生质体；（2）只需细胞质发生轻微的渗透收缩，几乎能从所有植物组织或细胞中分离出原生质体；（3）细胞不会象机械法那样破碎。图11-1分离的马铃薯原生质体（右，Carlberg等，1983）和烟草原生质体（左，Poewr，1976）11.3原生质体培养的应用（1）体细胞杂交依据细胞膜的相似性，进行细胞融合，利用植物原生质体融合技术进行植物种、属、科间，甚至遗传关系更远的细胞融合已成为一个比较成熟的技术。图12-8植物原生质体融合程序植物原生质体的融合番茄+马铃薯1978年，Melchers等通过诱导番茄和马铃薯原生质体的融合得到了第一个属间细胞杂种再生植株“泡马豆”（pomato)。

培育出的“泡马豆”外型倾向于蕃茄，花叶果实具有杂种特点，遗憾的是地下部分没有长出科学家们想象中的大土豆。合成图片植物体细胞杂交过程中已取得的进展：如：白菜—甘蓝、烟草—海岛烟草、胡萝卜—羊角芹等种间或属间杂种。植物细胞融合的新品种柑橙原生质体电融合（2）遗传转化及细胞器转移以植物原生质体为受体，进行细胞器转移、核置换及摄入微生物等研究开创了植物细胞工程研究的新领域。1973年，Potrykus将正常的叶绿体导入到矮牵牛白化突变的原生质体中，发现0.5％的白化原生质体中摄入了1～20个正常叶绿体。（3）无性系变异的良好体系

研究证明，在所有植物组织和细胞培养中，原生质体培养是体细胞遗传变异最丰富的。Thomas等（1982）详细调查了由马铃薯原生质体获得的23个再生植株田间生长特性和块茎特征，结果它们与亲本植株都不相同，而且这些变异即有染色体水平上，也有基因水平上的。原生质体变异，是植物体细胞遗传变异的重要组成部分已在实践中被进一步的研究