实验九细菌鉴定中常用的生理生化反应反应观察部分

关于实验九细菌鉴定中常用的生理生化反应反应观察部分第一页，共三十二页，2022年，8月28日实验目的和内容了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法；通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样性；了解细菌在不同培养基中的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义；第二页，共三十二页，2022年，8月28日实验仪器,材料和用具实验仪器37℃恒温培养箱、20℃恒温培养箱（室温代替）。微生物材料大肠杆菌、枯草杆菌这二种菌种的斜面各1支。试剂甲基红试剂、V．P试剂、吲哚试剂、格里斯试剂(硝酸盐利用试验)、卢戈氏碘液(淀粉水解试验)第三页，共三十二页，2022年，8月28日实验仪器,材料和用具实验用具试管：每份每个试验2支试验，7个试验共14支。无菌平皿：每份2个杜氏小管：每份4个。接种环、酒精灯、试管架、记号笔。第四页，共三十二页，2022年，8月28日实验仪器,材料和用具培养基葡萄糖发酵培养基乳糖发酵培养基甲基红(葡萄糖蛋白胨水培养基)V.P试验(葡萄糖蛋白胨水培养基)柠檬酸盐利用试验（柠檬酸盐利用试验）吲哚试验(蛋白水培养基)淀粉培养基第五页，共三十二页，2022年，8月28日实验原理－－细菌生化试验糖(醇)类发酵试验不同的细菌含有发酵不同糖(醇)的酶，因而发酵糖(醇)的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)一6.8(紫色)]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。第六页，共三十二页，2022年，8月28日实验步骤糖(醇)类发酵试验编号在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，下同。接种取葡萄糖发酵培养基2支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种枯草杆菌。同样取2支乳糖发酵培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种枯草杆菌。在接种后，轻轻摇动试管，使其均匀，防止导致的德汉氏/杜氏小管进入气泡。将已接种好的培养基置37℃温箱中培养24h。观察结果：被检细菌若能发酵培养基中的糖时，则使培养基的pH降低，这时培养基中的指示剂呈酸性反应(为黄色)，若发酵培养基中的糖产酸产气，则培养基不仅显酸色反应，并且在培养基中倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有气体。气体占整个倒置小玻管的10％以上。若被检细菌不分解培养基中的糖，则培养基不发生变化。第七页，共三十二页，2022年，8月28日第八页，共三十二页，2022年，8月28日实验结果糖发酵实验Carbohydratefermentation第九页，共三十二页，2022年，8月28日IMViC试验吲哚试验甲基红试验伏-普（V.P）试验柠檬酸盐利用试验

(Indoltest)(Methylredtest)(Voges-Prokauertest)(Ciratetest）第十页，共三十二页，2022年，8月28日甲基红(Methylred)试验(简称MR试验)很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4.4(红色)～pH6.2(黄色)。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱羧，转化成醇等物，则培养基的pH仍在6.2以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。实验步骤第十一页，共三十二页，2022年，8月28日实验步骤甲基红试验(MR试验)将大肠杆菌和枯草杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h，加甲基红指示剂2滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。第十二页，共三十二页，2022年，8月28日MethylRedTest第十三页，共三十二页，2022年，8月28日第十四页，共三十二页，2022年，8月28日V.P试验测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，该物质在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸中的胍基作用生成红色化合物。第十五页，共三十二页，2022年，8月28日实验步骤伏-普二氏试验(V.P试验)

将被检菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h，取出，倒掉一半培养液，加入40％KOH5～10滴，然后再加入（总体积）等量的5％-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃水浴锅中保温15～30min，以加快反应速度。若培养物呈现红色，为伏－普反应阳性。第十六页，共三十二页，2022年，8月28日Voges-ProskauerTest第十七页，共三十二页，2022年，8月28日第十八页，共三十二页，2022年，8月28日实验原理－－有机酸盐及氨盐利用试验柠檬酸盐利用试验柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢铵是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂（PH＜6.0时呈黄色，PH在6.0~7.0时为绿色，PH＞7.6时呈蓝色）由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。第十九页，共三十二页，2022年，8月28日实验步骤柠檬酸盐利用试验取少量被检菌接种到柠檬酸盐培养基上，37℃培养24h后，观察结果。培养基变深蓝色者为阳性。培养基不变色，则继续培养7天，培养基仍不变色者为阴性。第二十页，共三十二页，2022年，8月28日CitrateTest第二十一页，共三十二页，2022年，8月28日实验原理靛基质(吲哚)试验某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质(吲哚)，靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质(红色化合物)。第二十二页，共三十二页，2022年，8月28日实验步骤靛基质(吲哚)试验将被检菌接种到胰蛋白胨水培养基中，37℃培养24h～48h后，加入10-20滴乙醚，振荡数次，静置1－3分钟，沿试管壁滴加2滴吲哚试剂于培养物液面，观察结果。出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。第二十三页，共三十二页，2022年，8月28日IndoleTest第二十四页，共三十二页，2022年，8月28日第二十五页，共三十二页，2022年，8月28日实验原理－－大分子物质代谢实验

淀粉水解试验细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶(淀粉酶)将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)，再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。第二十六页，共三十二页，2022年，8月28日实验步骤淀粉水解试验将配制好的淀粉培养基冷却到50℃左右，以无菌操作制成平板。用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边，再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边。置37℃温箱培养24h。滴加少量卢戈氏碘液于平板上，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的大小。第二十七页，共三十二页，2022年，8月28日第二十八页，共三十二页，2022年，8月28日第二十九页，共三十二页，2022年，8月28日3号管--甲基红试验:加甲基红指示剂2滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。4号管--伏-普二氏试验:倒掉一半培养液，加入40％KOH5～10滴，然后再加入（总体积）等量的5％-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃水浴锅中保温15～30min。若培养物呈现红色，为伏－普反应阳性。6号管--吲哚试验:加入10-20滴乙醚，振荡数次，静置1－3分钟，沿试管壁滴加2滴吲哚试剂于培养物液面，出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。平板--淀粉水解试验:滴加少量卢戈氏碘液于平板上，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围有无色透明圈出