高效液相色谱分析课件

高效液相色谱的使用及其维护高效液相色谱的使用及其维护一液相色谱的发展史

早在古罗马时期，人们就已经知道将一滴含有混合色素的溶液滴在一块布或一张纸上，并通过观察溶液的展开产生的一个个同心圆来分析染料和色素。100多年前，德国化学家就对古罗马的这种方法做了改进，后来就发展成为今天的纸上色谱技术。经过几十年的发展，到1941年就有人采用水分饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰基氨基酸，这成为分配色谱的首次应用。

1960年代末科克兰、哈伯、荷瓦斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法

(HPLC)正式建立。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。一液相色谱的发展史早在古罗马时期二HPLC的原理及特点

色谱法是利用物质在两相中吸附或分配系数的微小差异达到分离的目的。当两相做相对移动时，被测物质在两相间进行反复多次的分配，这样使原来微小的分配差异产生了很大的效果，达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。

必要条件：不同组分性质上的微小差别；

充分条件：不同组分在两相之间进行的上千次或上百万次质量交换。HPLC是在经典色谱法的基础上，在技术上，流动相改为高压输送;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。

二HPLC的原理及特点色二HPLC的原理及特点

特点

高压

高速

高效

高灵敏度

适应范围宽而与气象色谱相比，其最大得特点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质二HPLC的原理及特点特点三液相色谱的分类按固定相形态分类按作用原理分离按物理特征分类固定相名称原理名称特征名称液体液液色谱分配液液分配色谱平面状固定相平面色谱固体液固色谱吸附液固吸附色谱纸固定相纸色谱分子大小凝胶或尺寸排阻色谱薄层固定相薄层色谱离子交换能力离子交换色谱颗粒固定相填充填充色谱亲和力亲和色谱色谱柱中空空心柱色谱电渗及电泳淌度电泳流动相采用高压液体高压液相色谱三液相色谱的分类按固定相形态分类按作用原理分离按物理特征四固定相

液固色谱的固定相一般为硅胶、氧化铝等吸附剂。

溶质在柱中吸附剂上不断进行吸附-解吸循环，由于不同的被测物在吸附剂上吸附作用的差异而获得分离。溶质所带官能团的性质是决定其吸附作用的主要因素，若溶质分子官能团的极性增强或数目增多，在使用极性吸附剂时，分子和极性吸附剂的总的相互作用加强，其相对吸附作用也增强，保留时间加长。四固定相而目前在高效液相色谱的应用中，有80%以上是化学键合固定相的色谱。

化学键合相是利用化学反应将有机分子键合到担体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的。一般用硅胶作担体，采用键合反应有酯化键合（Si-O-C）、硅烷化键合（Si-O-Si-C）和硅氮键合（Si-N）。

正相键合色谱最常用的是键合氰基、氨基、二醇基等极性基团的键合相，采用极性固定相、非极性或弱极性流动相，适合于中等极性样品的分离。

反相键合色谱的固定相是非极性，通常拥有疏水的十八硅烷（ODS）或辛烷官能团。如键合C2，C4，C6，C8，C16，

C18，C22烷基和苯基等非极性基团的固定相。

而目前在高效液相色谱的应用中，有8五流动相流动相对样品有一定的溶解能力，保证组分不会沉淀在柱中或长

时间保留在柱中；溶剂要有一定的化学稳定性,不与固定相和样品组分起反应；溶剂的粘度要低，以便得到好的分离效果；降低柱压，延长泵的使用寿命；溶剂应与检测器兼容性好，不影响检测器正常工作；样品易于回收、易于得到纯品、毒性低等特征；保证该色谱系统的分离过程可重复进行；溶剂的沸点低，有利于制备色谱的样品回收，但不宜过低，否则易产生气泡。从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全。

五流动相

正相色谱中，流动相与固定相间的相互作用越强，溶质吸附就越弱，反之亦然。也就是说流动相强度增大，洗脱能力增强。一般采用乙烷、庚烷、异辛烷、苯和二甲苯等有机溶剂作为流动相，有时还加入一定量的四氢呋喃等极性溶剂，即采用多元流动相的分离模式。

反相色谱中，常用洗脱剂有水、乙腈、甲醇和四氢呋喃等。洗脱强度的强弱顺序为：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<丙醇<二氯甲烷。溶剂的极性随溶剂强度的增加而降低。

正相色谱中，流动相与固定相间的相互作用越强，溶六液相色谱柱

色谱柱的构造

高效液相色谱柱通常用能耐80MPa(816atm)，内径均匀的优质不锈钢制成，包括柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板、接头、螺丝等。

色谱柱的类型：分析型和制备型常规分析柱(常量柱)，内径2-5mm(常用4.6mm，国内有4mm和5mm)，长度200-250mm，填料通常为3-10μm。窄径柱，又称细管径柱、半微柱，内径1-2mm,柱长10-20cm;毛细管柱(又称微柱)，内径0.2-0.5mm；半制备柱，内径>5mm；实验室制备柱，内径20-40rnm，柱长10-30cm;生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。

六液相色谱柱色谱柱的构造

色谱柱的维护避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓；进样前检查色谱系统的各个接头看是否有漏液现象；不要把柱接头上得太紧，以免损坏接头螺纹；一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效；柱子不应放在有气流和阳光照射的地方，气流和阳光都会使柱子产生温度梯度而造成基线漂移；不要使其碰撞，以免柱床因震动产生空隙或通道。色谱柱的维护反相色谱柱应将柱内充满乙腈或甲醇来保存，通常用20倍柱体积（50-60ml）冲洗。柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间；柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（5-30mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。反相色谱柱应将柱内充满乙腈或甲醇来保存，通常用20倍柱体六HPLC的使用与维护流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。

流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。使用缓冲盐溶液为流动相时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，以免盐类堵塞柱子与管路；然

后用甲醇冲洗40分钟以上，以充分冲洗柱子。绝对禁止将缓冲溶液留在流路中静置过夜或更长时间；对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水缓慢冲洗20ml以上。不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用甲醇等有机溶剂，因为纯水易长霉。

六HPLC的使用与维护流动相必须用HPLC级的试剂，使每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器，再以水清洗。C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。堵塞导致压力太大，按柱子→预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。要注意柱子的PH值范围（2-8），不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。更换流动相时要先将流速降到零，不要在有流速的状态下将滤头置于空气中；另外更换时应先将滤头部分冲洗或放入烧杯中边振动边清洗，然后插入新的

流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。高效液相色谱分析课件每次开机时，流速与柱压要逐渐增加。尤其是用两种流动相时，可以考虑在低于预设流速的状态下平衡一段时间，因为两相混合会有一个高压，直接升到较高流速，泵会因压力过高而停止运行。每次开机时可以先冲洗一下管路或柱前部分，除去上次使用残留在管路中的流动相，这样可以防止残留液对柱子的污染，还可缩短平衡基线的时间。如果管路中有气泡要先用注射器抽除，以免气泡进入泵或柱子中。进样阀在进样过程中，必须是非常清洁的，否则得不到较好的结果。

在冲洗管路时进样阀切换到进样位置后，在此位置保持一段时间，使流动相充分冲洗样品定量管，这样可以保证有较高的精确度，而且不用另外再冲洗样品定量管每次开机时，流速与柱压要逐渐增加。尤其是用两种流动相时，可以七HPLC的使用常见问题

柱压过高，可能是流速定位过高、泵出口过滤器堵塞、柱头杂质堵塞或柱前过滤塞堵塞，应逐一检查确定堵塞的地方，再冲洗，有时需拆下过滤器超声清洗。

柱压波动，泵或柱中有气泡、高压系统有泄漏或单向阀被污染，部分堵塞。检查是否泄漏、单向阀是否有问题，若有则应及时清洗或更换单向阀。若有气泡，就purge10到15分钟。

泵不吸液，可能是泵中有气泡、流动相滤头被污染或单向阀堵塞

，使用注射器吸液，通常在输液前要进行流动相的清洗。若不行就通过排除气泡和清洗滤筛来解决问题。

进样后不出峰，可能检测器选择不当、试液浓度太低、检测器到记录仪之间输入信号断开或样品未能进入进样阀。

七HPLC的使用常见问题柱压过高，可能是流速定位过高、

出现负峰，用示差检测器时，样品的折光指数小于流动相溶剂的折光指数；或流动相不纯净；用UV检测器时，溶解样品的溶剂与流动相溶剂不能互溶或PH值不同，当光在两种互不相溶的溶剂界面产生折射，从而使光电池受到不同强度的光，光强度减弱，以至于低于参比而出现负峰。

样品前处理，最好使用流动相溶解样品，用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质；进样前清洗进样针和进样阀。

剩余流动相的处理，有机相要是高纯的，用完了剩下的密封起来就行了，时间不限；水相或者缓冲盐的，最多放48小时，再用不完就应废弃；有机相和水相混合的有机相超过50％的用剩下的可以4度保持，但最多一周。此外，流动相一定要贴标签注明出现负峰，用示差检测器时，样品的折光指数小于流动相溶剂的感谢您的关注感谢您的关注高效液相色谱的使用及其维护高效液相色谱的使用及其维护一液相色谱的发展史

早在古罗马时期，人们就已经知道将一滴含有混合色素的溶液滴在一块布或一张纸上，并通过观察溶液的展开产生的一个个同心圆来分析染料和色素。100多年前，德国化学家就对古罗马的这种方法做了改进，后来就发展成为今天的纸上色谱技术。经过几十年的发展，到1941年就有人采用水分饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰基氨基酸，这成为分配色谱的首次应用。

1960年代末科克兰、哈伯、荷瓦斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法

(HPLC)正式建立。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。一液相色谱的发展史早在古罗马时期二HPLC的原理及特点

色谱法是利用物质在两相中吸附或分配系数的微小差异达到分离的目的。当两相做相对移动时，被测物质在两相间进行反复多次的分配，这样使原来微小的分配差异产生了很大的效果，达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。

必要条件：不同组分性质上的微小差别；

充分条件：不同组分在两相之间进行的上千次或上百万次质量交换。HPLC是在经典色谱法的基础上，在技术上，流动相改为高压输送;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。

二HPLC的原理及特点色二HPLC的原理及特点

特点

高压

高速

高效

高灵敏度

适应范围宽而与气象色谱相比，其最大得特点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质二HPLC的原理及特点特点三液相色谱的分类按固定相形态分类按作用原理分离按物理特征分类固定相名称原理名称特征名称液体液液色谱分配液液分配色谱平面状固定相平面色谱固体液固色谱吸附液固吸附色谱纸固定相纸色谱分子大小凝胶或尺寸排阻色谱薄层固定相薄层色谱离子交换能力离子交换色谱颗粒固定相填充填充色谱亲和力亲和色谱色谱柱中空空心柱色谱电渗及电泳淌度电泳流动相采用高压液体高压液相色谱三液相色谱的分类按固定相形态分类按作用原理分离按物理特征四固定相

液固色谱的固定相一般为硅胶、氧化铝等吸附剂。

溶质在柱中吸附剂上不断进行吸附-解吸循环，由于不同的被测物在吸附剂上吸附作用的差异而获得分离。溶质所带官能团的性质是决定其吸附作用的主要因素，若溶质分子官能团的极性增强或数目增多，在使用极性吸附剂时，分子和极性吸附剂的总的相互作用加强，其相对吸附作用也增强，保留时间加长。四固定相而目前在高效液相色谱的应用中，有80%以上是化学键合固定相的色谱。

化学键合相是利用化学反应将有机分子键合到担体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的。一般用硅胶作担体，采用键合反应有酯化键合（Si-O-C）、硅烷化键合（Si-O-Si-C）和硅氮键合（Si-N）。

正相键合色谱最常用的是键合氰基、氨基、二醇基等极性基团的键合相，采用极性固定相、非极性或弱极性流动相，适合于中等极性样品的分离。

反相键合色谱的固定相是非极性，通常拥有疏水的十八硅烷（ODS）或辛烷官能团。如键合C2，C4，C6，C8，C16，

C18，C22烷基和苯基等非极性基团的固定相。

而目前在高效液相色谱的应用中，有8五流动相流动相对样品有一定的溶解能力，保证组分不会沉淀在柱中或长

时间保留在柱中；溶剂要有一定的化学稳定性,不与固定相和样品组分起反应；溶剂的粘度要低，以便得到好的分离效果；降低柱压，延长泵的使用寿命；溶剂应与检测器兼容性好，不影响检测器正常工作；样品易于回收、易于得到纯品、毒性低等特征；保证该色谱系统的分离过程可重复进行；溶剂的沸点低，有利于制备色谱的样品回收，但不宜过低，否则易产生气泡。从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全。

五流动相

正相色谱中，流动相与固定相间的相互作用越强，溶质吸附就越弱，反之亦然。也就是说流动相强度增大，洗脱能力增强。一般采用乙烷、庚烷、异辛烷、苯和二甲苯等有机溶剂作为流动相，有时还加入一定量的四氢呋喃等极性溶剂，即采用多元流动相的分离模式。

反相色谱中，常用洗脱剂有水、乙腈、甲醇和四氢呋喃等。洗脱强度的强弱顺序为：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<丙醇<二氯甲烷。溶剂的极性随溶剂强度的增加而降低。

正相色谱中，流动相与固定相间的相互作用越强，溶六液相色谱柱

色谱柱的构造

高效液相色谱柱通常用能耐80MPa(816atm)，内径均匀的优质不锈钢制成，包括柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板、接头、螺丝等。

色谱柱的类型：分析型和制备型常规分析柱(常量柱)，内径2-5mm(常用4.6mm，国内有4mm和5mm)，长度200-250mm，填料通常为3-10μm。窄径柱，又称细管径柱、半微柱，内径1-2mm,柱长10-20cm;毛细管柱(又称微柱)，内径0.2-0.5mm；半制备柱，内径>5mm；实验室制备柱，内径20-40rnm，柱长10-30cm;生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。

六液相色谱柱色谱柱的构造

色谱柱的维护避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓；进样前检查色谱系统的各个接头看是否有漏液现象；不要把柱接头上得太紧，以免损坏接头螺纹；一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效；柱子不应放在有气流和阳光照射的地方，气流和阳光都会使柱子产生温度梯度而造成基线漂移；不要使其碰撞，以免柱床因震动产生空隙或通道。色谱柱的维护反相色谱柱应将柱内充满乙腈或甲醇来保存，通常用20倍柱体积（50-60ml）冲洗。柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间；柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（5-30mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。反相色谱柱应将柱内充满乙腈或甲醇来保存，通常用20倍柱体六HPLC的使用与维护流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。

流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。使用缓冲盐溶液为流动相时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，以免盐类堵塞柱子与管路；然

后用甲醇冲洗40分钟以上，以充分冲洗柱子。绝对禁止将缓冲溶液留在流路中静置过夜或更长时间；对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水缓慢冲洗20ml以上。不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用甲醇等有机溶剂，因为纯水易长霉。

六HPLC的使用与维护流动相必须用HPLC级的试剂，使每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器，再以水清洗。C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。堵塞导致压力太大，按柱子→预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。要注意柱子的PH值范围（2-8），不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。更换流动相时要先将流速降到零，不要在有流速的状态下将滤头置于空气中；另外更换时应先将滤头部分冲洗或放入烧杯中边振动边清洗，然后插入新的

流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。高效液相色谱分析课件每次开机时，流速与柱压要逐渐增加。尤其是用两种流动相时，可以考虑在低于预设流速