实时荧光定量PCR技术的原理及应用注意事项适合菜鸟入门课件

汇报人：朱林林2011/03/25实时荧光定量PCR技术

1目录实时荧光定量PCR基本原理实时荧光定量PCR的实验设计实时荧光定量PCR两种相对定量方法比较实时荧光定量PCR误差分析及操作规范实验中污染的防控荧光定量PCR报告模板目录实时荧光定量PCR基本原理2实时荧光定量PCR基本原理实时荧光定量PCR基本原理3常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析。定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板进行定量分析。常规vs实时常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析。4优缺点比较优缺点比较5定量PCR三个基本概念(1)扩增曲线PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中荧光强度为纵坐标所做的曲线。定量PCR三个基本概念(1)扩增曲线6定量PCR三个基本概念(2)阈值的概念在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。定量PCR三个基本概念(2)阈值的概念7定量PCR三个基本概念(3)CT值PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环数。定量PCR三个基本概念(3)CT值8C(t)与初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线10410310610510210C(t)与初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小荧光强度9荧光定量PCR的定量原理浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（Ct值）就可分析样品中起始模板量。荧光定量PCR的定量原理浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据10荧光定量PCR的化学原理化学方法分类非特异性SYBRGreenI法特异性TaqMan探针法荧光定量PCR的化学原理化学方法分类11SYBRGreenI法原理：结合双链DNA分子小沟延伸结束，形成双链DNA，SYBRGreen结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度优点使用方便，无需复杂的设计成本较低缺点与非特异性产物结合，无模板特异性试验方法较难优化灵敏度低GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBRGreenI法原理：结合双链DNA分子小沟GTT12实时荧光定量PCR技术的原理及应用注意事项适合菜鸟入门课件13SYBRGreenI法溶解曲线分析SYBRGreenI法溶解曲线分析14荧光染料的特点及应用(1)、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；(2)、可做双链核酸的熔解曲线分析；(3)、SYBRGreenⅠ染料本身价格便宜，但是做荧光定量PCR时对引物设计的要求很高；对Taq酶要求较高，最好是HotStarTaq酶，或者操作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；(4)、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；(5)、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。(6)、对PCR反应的毒性，能抑制PCR反应，降低PCR反应的效率。荧光染料的特点及应用(1)、能够与所有的核酸双链结合，受激后15TaqMan探针法水解型报告基团，淬灭基团FRET（荧光谐振能量传递）识别特异性产物优点特异性高，可准确定量灵敏度高设计不同标记的探针，可进行多重检测缺点一个探针只适用于一个目标价格较高探针设计较繁琐TaqMan探针法水解型16实时荧光定量PCR技术的原理及应用注意事项适合菜鸟入门课件17TaqMan作用机理TaqMan作用机理18两种化学的比较两种化学的比较19实时荧光定量PCR的实验设计实时荧光定量PCR的实验设计20绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）相对定量：计算初始反应模板的相对含量绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（D21定量PCR--绝对定量标准品，标准曲线已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线样品与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值定量PCR--绝对定量标准品，标准曲线22定量PCR--相对定量相对定量的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）相对定量的问题样品材料不均一造成的差别内标基因内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差定量PCR--相对定量相对定量的目的23实时荧光定量PCR两种相对定量方法比较相对标准曲线法和2-ΔΔc(t)

法实时荧光定量PCR两种相对定相对标准曲线法和2-ΔΔc(t)24相对标准曲线法用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值用内标基因对目标基因均一化处理样本与未处理样本目标基因C(t)值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异相对标准曲线法用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线25适用范围目标基因与内标基因扩增效率差异较大扩增效率较低适用范围目标基因与内标基因扩增效率差异较大262-ΔΔc(t)

法前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内

1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：

ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：

ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、计算表达水平比率：

2–ΔΔCT=表达量的比值当有多个样品时（如时间点），各样品均一化后都与同一时间点相比2-ΔΔc(t)法前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近127一般步骤选定目标基因和内标基因设计一步法或两步法RT-PCR反应数据获得及处理目标基因C(t)值内标基因C(t)值计算2-ΔΔc(t)

作图一般步骤选定目标基因和内标基因28适用范围当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比较一致不做标准曲线，高通量检测适用范围当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比较一致29实时荧光定量PCR误差分析及操作规范实时荧光定量PCR误差分析301、误差分析（1）、实验方案本身的误差荧光染料法由于染料本身的特性，不可避免的会引起误差；

2-△△CT法由于也是一种近似的算法，所以不可避免的也会引起误差；

Taqman探针法误差相对较小；双标准曲线法误差相对较小。（2）、仪器设备引起的误差测量标准品核酸浓度时，分光光度计的误差，从光密度值到质量再到摩尔量，误差本身就很大；定量PCR仪的误差，耗材引起的误差，96空板封口膜透光性的差异等1、误差分析（1）、实验方案本身的误差31（3）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的误差（4）、操作引起的误差样品处理、选取、核酸提取、反转录、加样，操作过程中引起的误差。（3）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的误差322、操作规范荧光定量PCR是一项对操作要求很高的实验，同时又是花费很高的一项实验，这就要求必须最大程度的减少误差或避免错误。要想达到这个目标，我们必须从样品的选取开始到上样检测，每一步都要规范操作。2、操作规范荧光定量PCR是一项对操作要求很高的实验，同33（1）、样品的处理及选取处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。如测定一种药物到小白鼠免疫系统的影响，必须做到每次饲喂时此药品完全被小白鼠摄食；选取试验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污染其他组织，如选取脾脏组织时，尽可能的选取脾脏，不能混有结缔组织等，样品选取好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。（1）、样品的处理及选取34（2）、核酸提取加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保得到高质量的核酸，分光光度计检测核算质量，RNAOD260/280＝2.0左右，DNAOD260/280＝1.8左右，最好再做电泳检测；同一样品要提取2到3个RNA，所剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。（3）、得到的RNA立即反转录为cDNA，RNA样品最好不要存放，反转录所得cDNA要用看家基因检测。（2）、核酸提取35（4）、对于精度要求较高的定量PCR，最好先在样品的所有组织类型内做内参基因的稳定性分析，找出表达恒定基因作为内参。（5）、做定量PCR时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到PCR管中，分装时尽量采用排枪，加样时尽量最好采用排枪。（6）、体系中最好掺入ROX参比荧光，消除光程差和加样的偏差。（4）、对于精度要求较高的定量PCR，最好先在样品的所有组织36（7）、重复操作让重复操作最大的修正偏差。最有意义的重复是在提取样品RNA时就重复，同一个样品，分别提取3份RNA，3份RNA都做反转录，所得的3份cDNA都做定量PCR检测，这样的重复之所以最有意义是因为我们是把RNA提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样得出的平均值要比只在上机检测时对同一cDNA样品做三个重复要有意义的多。

同一个cDNA样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时的误差，排枪加样时，误差很小，加样时的误差可以通过设几个重复检测出来。（7）、重复操作37同一cDNA样品的三个重复同一cDNA样品的三个重复38模板浓度越低，染料法的误差越大。如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。模板浓度越低，染料法的误差越大。如图一系列梯度稀释的模板，理39实验中污染的防控实验中污染的防控401、荧光定量PCR实验中污染源的分析（1）、PCR产物引起的污染在检测过程中，荧光定量PCR产物都是封闭在PCR管中的，不存在开管检测，所以有污染的话，最有可能是因为电泳检测荧光定量PCR产物时引起的污染，只要将电泳室与PCR加样室隔离开，就能有效的避免PCR产物的污染。1、荧光定量PCR实验中污染源的分析（1）、PCR产物引起的41（2）、标准品引起的污染常用的标准品有含有目的基因的质粒、纯化后的PCR产物等，由于标准品的浓度是一系列从高到低梯度稀释的，所以在稀释过程中，有可能引起污染。（2）、标准品引起的污染42（3）、高浓度的样品引起的污染高浓度的阳性样品在加样过程中可能会形成气溶胶，造成污染。（3）、高浓度的样品引起的污染432、荧光定量PCR实验中污染的防控（1）、对于PCR产物引起的污染最简单有效地办法就是将电泳室与加样室彻底隔离开，做到每个房间都有专属的移液器，做到移液器专用；或者采用dU代替dT配合UNG酶，是解决PCR产物污染的有效办法，但是成本较高。2、荧光定量PCR实验中污染的防控（1）、对于PCR产物引起44（2）、对于标准品引起的污染目前只能是以预防，加标准品时最好采用专用移液器，不要和加样的移液器交叉使用，加标准品时最好在通风厨中进行，和加样的操作台隔离开。（2）、对于标准品引起的污染45（3）、对于样品间的检查污染样品间的交叉污染往往是因为高浓度的样品在加样室形成了气溶胶，因为样品的cDNA链较长，经常开紫外灯，把长链cDNA打断，能有效避免此类污染的发生，另外保持加样室空气流通也有助于防止此类污染。（3）、对于样品间的检查污染46（4）、对于未知污染源的顽固的污染的防控这类污染也经常出现，找不到明确的污染源，而且此类污染又非常顽固，对于这种情况，最好的办法就是不去管它，在采用绝对定量和双标准曲线法时，污染的初始模板量可由阴性对照检测出来，知道了污染的初始模板量后，我们可以把测得样品的初始模板量减去污染的初始模板量，在分析时就避免了污染造成的误差。（4）、对于未知污染源的顽固的污染的防控47图中最后一个样品为阴性对照，本来应该是一直线，但是仪器也检测到了荧光信号图中最后一个样品为阴性对照，本来应该是一直线，但是仪器也检测48电泳结果显示，该阴性对照确实有PCR产物出现电泳结果显示，该阴性对照确实有PCR产物出现49通过定量PCR检测，测得该阴性样品中含有227个初始模板。假如这个污染属于是顽固的未知污染，可以用正常样品测得的初始模板量减去227，来避免污染引起的误差通过定量PCR检测，测得该阴性样品中含有227个初始模板。假50荧光定量PCR报告模板荧光定量PCR报告模板51

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52目录实时荧光定量PCR基本原理实时荧光定量PCR的实验设计实时荧光定量PCR两种相对定量方法比较实时荧光定量PCR误差分析及操作规范实验中污染的防控荧光定量PCR报告模板目录实时荧光定量PCR基本原理53实时荧光定量PCR基本原理实时荧光定量PCR基本原理54常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析。定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板进行定量分析。常规vs实时常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析。55优缺点比较优缺点比较56定量PCR三个基本概念(1)扩增曲线PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中荧光强度为纵坐标所做的曲线。定量PCR三个基本概念(1)扩增曲线57定量PCR三个基本概念(2)阈值的概念在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。定量PCR三个基本概念(2)阈值的概念58定量PCR三个基本概念(3)CT值PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环数。定量PCR三个基本概念(3)CT值59C(t)与初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线10410310610510210C(t)与初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小荧光强度60荧光定量PCR的定量原理浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（Ct值）就可分析样品中起始模板量。荧光定量PCR的定量原理浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据61荧光定量PCR的化学原理化学方法分类非特异性SYBRGreenI法特异性TaqMan探针法荧光定量PCR的化学原理化学方法分类62SYBRGreenI法原理：结合双链DNA分子小沟延伸结束，形成双链DNA，SYBRGreen结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度优点使用方便，无需复杂的设计成本较低缺点与非特异性产物结合，无模板特异性试验方法较难优化灵敏度低GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBRGreenI法原理：结合双链DNA分子小沟GTT63实时荧光定量PCR技术的原理及应用注意事项适合菜鸟入门课件64SYBRGreenI法溶解曲线分析SYBRGreenI法溶解曲线分析65荧光染料的特点及应用(1)、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；(2)、可做双链核酸的熔解曲线分析；(3)、SYBRGreenⅠ染料本身价格便宜，但是做荧光定量PCR时对引物设计的要求很高；对Taq酶要求较高，最好是HotStarTaq酶，或者操作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；(4)、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；(5)、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。(6)、对PCR反应的毒性，能抑制PCR反应，降低PCR反应的效率。荧光染料的特点及应用(1)、能够与所有的核酸双链结合，受激后66TaqMan探针法水解型报告基团，淬灭基团FRET（荧光谐振能量传递）识别特异性产物优点特异性高，可准确定量灵敏度高设计不同标记的探针，可进行多重检测缺点一个探针只适用于一个目标价格较高探针设计较繁琐TaqMan探针法水解型67实时荧光定量PCR技术的原理及应用注意事项适合菜鸟入门课件68TaqMan作用机理TaqMan作用机理69两种化学的比较两种化学的比较70实时荧光定量PCR的实验设计实时荧光定量PCR的实验设计71绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）相对定量：计算初始反应模板的相对含量绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（D72定量PCR--绝对定量标准品，标准曲线已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线样品与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值定量PCR--绝对定量标准品，标准曲线73定量PCR--相对定量相对定量的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）相对定量的问题样品材料不均一造成的差别内标基因内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差定量PCR--相对定量相对定量的目的74实时荧光定量PCR两种相对定量方法比较相对标准曲线法和2-ΔΔc(t)

法实时荧光定量PCR两种相对定相对标准曲线法和2-ΔΔc(t)75相对标准曲线法用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值用内标基因对目标基因均一化处理样本与未处理样本目标基因C(t)值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异相对标准曲线法用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线76适用范围目标基因与内标基因扩增效率差异较大扩增效率较低适用范围目标基因与内标基因扩增效率差异较大772-ΔΔc(t)

法前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内

1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：

ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：

ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、计算表达水平比率：

2–ΔΔCT=表达量的比值当有多个样品时（如时间点），各样品均一化后都与同一时间点相比2-ΔΔc(t)法前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近178一般步骤选定目标基因和内标基因设计一步法或两步法RT-PCR反应数据获得及处理目标基因C(t)值内标基因C(t)值计算2-ΔΔc(t)

作图一般步骤选定目标基因和内标基因79适用范围当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比较一致不做标准曲线，高通量检测适用范围当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比较一致80实时荧光定量PCR误差分析及操作规范实时荧光定量PCR误差分析811、误差分析（1）、实验方案本身的误差荧光染料法由于染料本身的特性，不可避免的会引起误差；

2-△△CT法由于也是一种近似的算法，所以不可避免的也会引起误差；

Taqman探针法误差相对较小；双标准曲线法误差相对较小。（2）、仪器设备引起的误差测量标准品核酸浓度时，分光光度计的误差，从光密度值到质量再到摩尔量，误差本身就很大；定量PCR仪的误差，耗材引起的误差，96空板封口膜透光性的差异等1、误差分析（1）、实验方案本身的误差82（3）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的误差（4）、操作引起的误差样品处理、选取、核酸提取、反转录、加样，操作过程中引起的误差。（3）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的误差832、操作规范荧光定量PCR是一项对操作要求很高的实验，同时又是花费很高的一项实验，这就要求必须最大程度的减少误差或避免错误。要想达到这个目标，我们必须从样品的选取开始到上样检测，每一步都要规范操作。2、操作规范荧光定量PCR是一项对操作要求很高的实验，同84（1）、样品的处理及选取处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。如测定一种药物到小白鼠免疫系统的影响，必须做到每次饲喂时此药品完全被小白鼠摄食；选取试验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污染其他组织，如选取脾脏组织时，尽可能的选取脾脏，不能混有结缔组织等，样品选取好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。（1）、样品的处理及选取85（2）、核酸提取加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保得到高质量的核酸，分光光度计检测核算质量，RNAOD260/280＝2.0左右，DNAOD260/280＝1.8左右，最好再做电泳检测；同一样品要提取2到3个RNA，所剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。（3）、得到的RNA立即反转录为cDNA，RNA样品最好不要存放，反转录所得cDNA要用看家基因检测。（2）、核酸提取86（4）、对于精度要求较高的定量PCR，最好先在样品的所有组织类型内做内参基因的稳定性分析，找出表达恒定基因作为内参。（5）、做定量PCR时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到PCR管中，分装时尽量采用排枪，加样时尽量最好采用排枪。（6）、体系中最好掺入ROX参比荧光，消除光程差和加样的偏差。（4）、对于精度要求较高的定量PCR，最好先在样品的所有组织87（7）、重复操作让重复操作最大的修正偏差。最有意义的重复是在提取样品RNA时就重复，同一个样品，分别提取3份RNA，3份RNA都做反转录，所得的3份cDNA都做定量PCR检测，这样的重复之所以最有意义是因为我们是把RNA提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样得出的平均值要比只在上机检测时对同一cDNA样品做三个重复要有意义的多。

同一个cDNA样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时的误差，排枪加样时，误差很小，加样时的误差可以通过设几个重复检测出来。（7）、重复操作88同一cDNA样品的三个重复同一cDNA样品的三个重复89模板浓度越低，染料法的误差越大。如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。模板浓度越低，染料法的误差越大。如图一系列梯度稀释的模板，理90实验