海滨木巴戟种子超低温保存技术规程

T/CSMAXXXX－2018海滨木巴戟种子超低温保存技术规程范围本标准规定了海滨木巴戟[MorindacitrifoliaL.]种子超低温保存过程中的术语和定义、种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等技术要求。本标准适用于海滨木巴戟种子的超低温长期贮藏。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.6农作物种子检验规程水分测定GB/T3543.7农作物种子检验规程其他项目检验术语和定义下列术语和定义适用于本文件。海滨木巴戟MorindacitrifoliaL.为茜草科（Rubiaceae）巴戟天属（Morinda）灌木或小乔木，也称海巴戟、海巴戟天，生于热带地区海滨平地和疏林中，树冠幽雅，XX亚常种于庭园。果实可食，其果实、叶子、枝干、根部均可入药，具有抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、镇痛、降压、消炎和提高免疫力的作用。全株含蒽醌类化合物，波利尼西亚将其应用于医药已有2000多年的历史。收载于《世界药用植物速查辞典（2015）》。海滨木巴戟果实MorindacitrifoliaL.fruits聚合果浆果状，长卵形或球形，径约2.5cm；幼时绿色，熟时白色或黄色。有时最下部的小核果的宿存花萼扩大成叶状，核果卵形，扁平，边缘具翅；二室，上侧室大而空，下侧室狭，具1种子。海滨木巴戟种子MorindacitrifoliaL.seed海滨木巴戟的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子黑褐色，长圆形，小，扁，下部有翅；胚直，胚根下位，子叶长圆形；胚乳丰富，质脆。种子超低温保存seedofcryopreservation指将经过前处理的海滨木巴戟种子置于液氮（-196℃）中保存。种子的选择果实采收花果期全年，全果变奶黄或金黄色时，即可时采收，去除果肉，取出种子。种子选择挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于4℃冰箱中保存备用（存放时间不超过2个月）。种子前处理生活力检测参照《植物生理学实验指导》中的溴麝香草酚蓝（BTB）法测定种子生活力。待测种子在30℃~35℃温水中浸种2h，随后取吸胀种子50粒，整齐地埋于备好的琼脂凝胶中，注意要将胚埋入凝胶中。将培养皿置于35℃温箱中5h后观察结果。生活力计算在光下用放大镜对染色结果进行观察鉴定。凡种胚周围出现黄色晕圈的种子为有活力的种子，否则为无活力的种子。计算：生活力=有活力的种子数/总的种子数×100%待保存的海滨木巴戟种子生活力应≥90%。含水量范围用尼龙网袋包裹海滨木巴戟种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为19000:1，室温条件下干燥处理1~5h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由18%~25%降至10%~15%。参照GB/T3543.6中的高恒温烘干法（130℃烘干1h）测定种子含水量（W0），W0=（鲜重-绝干重）/鲜重×100%。种子保存量海滨木巴戟种子保存量不少于350粒，以便后期的活力检测使用。种子冷冻方式海滨木巴戟种子超低温保存的冷冻方式为直接冷冻法，即将待保存的海滨木巴戟种子放入5mL冻存管（每管50粒种子）中，迅速投入液氮中保存。恢复培养种子解冻处理液氮中至少冻存24h后，取出1个冻存管，立即放入40℃水浴中快速解冻2min。冻后种子生活力检测取出25粒解冻后的种子，参照5.1~5.2生活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力≥60%时视为保存成功。恢复培养将剩下25粒解冻后的海滨木巴戟种子，经50℃热水浸泡8h后，播种到带有无菌滤纸的带盖发芽盒中，温度28℃~35℃，湿度70%~85%条件下培养。附录BTB的配制和保存方法精密称取BTB0.5g，溶解于煮沸过的500mL纯水中。滤液若呈黄色，可加数滴氢氧化钠溶液，使之变为蓝色或蓝绿色，随后加入3.5g琼脂溶解，稍稍冷却即可趁热倒入9cm培养皿中，使之成一均匀的薄层，完全冷却后备用。参考文献[1]肖培根，刘昌孝，江纪武等.世界药用植物速查辞典[M].中国医药科技出版社.2015[2]中国科学院中国植物志委员会.中国植物志.第71（2）卷[M].科学出版社，2004（1999）：182[3]ChenTao，ZhuHua，ChenChia-jui.Rubiaceae[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.2011.19:220-230.[4]ReedBM.PlantCryopreservation‒APracticalGuide[M].Springer，2010:3[5]张志强，李永成.海巴戟天