重组体在原核细胞中的表达与调控课件

重组体在原核细胞中表达与调控重组体在原核细胞中表达与调控1基因表达概述基因表达：指基因携带的遗传信息，经过转录、翻译、加工修饰等复杂的生化反应，产生具有生物学功能的蛋白质过程，即DNA→RNA→蛋白质.基因表达调控转录水平调控转录产物加工mRNA从核到细胞质mRNA降解翻译水平基因表达概述基因表达：指基因携带的遗传信息，经过转录、翻译、2原核与真核生物基因组比较真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量级真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分（如线粒体DNA等），这就增加了基因表达调控的层次和复杂性细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽链形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多原核与真核生物基因组比较真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆3原核基因组的大部分序列都为编码基因，哺乳类基因组的中仅约10%的序列是编码蛋白质或rRNA、tRNA等的基因，其余约90%的序列功能至今还不清楚原核生物基因的蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子和内含子，在转录后经剪接去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列。绝大多数真核生物的蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因原核基因组的大部分序列都为编码基因，哺乳类基因组的中仅约104原核基因转录特点原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有3种），识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成原核生物无核膜，所以转录与翻译是耦联的；形成多核糖体，可在一条mRNA链上同时合成多条肽链，效率高mRNA可从两条链中任一条有意链上转录，转录方向与DNA方向相反（3’→5’），并且在mRNA还没有合成完时，翻译就开始基因表达调控在转录水平，两种方式：起始控制（启动子），终止控制（衰减子）原核具有SD序列，即同16S核糖体RNA3’末端碱基互补的序列操纵子结构原核基因转录特点原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有3种5外源基因在原核表达的条件通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白外源基因不能带有间隔序列（内含子），如cDNA或全合成的基因利用原核强启动子及其两侧的调控SD序列与起始子密码子ATG有合适的距离外源基因下游加上不依赖ρ因子的转录终止区正确的开放读码框架利用宿主调控系统，调节外源基因表达，防止产物毒害宿主外源基因在原核表达的条件通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并6外源基因在原核表达调控元件启动子：能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列Pribnowbox：-10区；TATAAT（与RNA聚合酶核心酶结合，解旋DNA，合成RNA）-35区：TTGACA（与σ因子结合）代表强启动子：乳糖启动子（Lac）；色氨酸启动子（Trp）；噬菌体左向启动子（λPL）；Trp-Lac杂合启动子（Tac）；T7噬菌体启动子外源基因在原核表达调控元件启动子：能被RNA聚合酶识别、结合7重组体在原核细胞中的表达与调控课件8乳糖操纵元凡能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的序列，不论其对基因转录的作用是减弱、阻止或增强、开放，都可称为操纵子。乳糖操纵元：转录负调控基因：操纵基因（O）；启动子（P）；3个结构基因（Z、Y、A）诱导剂：IPTG乳糖操纵元凡能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的9乳糖操纵元基因图和表达调控乳糖操纵元基因图和表达调控10重组体在原核细胞中的表达与调控课件11重组体在原核细胞中的表达与调控课件12色氨酸操纵元色氨酸是构成蛋白质的组分，一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸，细菌要生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸，但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵元（trpoperon）的调控。色氨酸操纵元色氨酸是构成蛋白质的组分，一13两种调控方式阻遏蛋白的负调控阻遏蛋白+色氨酸→有活性的阻遏蛋白+操纵基因→无活性的操纵基因衰减子依赖与色氨酸浓度或其他氨基酸浓度诱导物：β-吲哚丙烯酸两种调控方式阻遏蛋白的负调控14重组体在原核细胞中的表达与调控课件15PL和PR启动子λ噬菌体CI基因负调控温度敏感的启动子：32℃→42℃原理：在42℃时，CI蛋白失活工作方式宿主合成CI蛋白载体编码CI蛋白PL和PR启动子λ噬菌体CI基因负调控16核糖体结合位点（SD序列）在mRNA分子中起始密码子AUG上游8-13bp处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，由3-9bp组成，它可以与30S亚基中的16SrRNA3'端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，因此有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始。上述mRNA分子的序列特征1974年由J.Shine和L.Dalgarno发现，故称为SD顺序。核糖体结合位点（SD序列）在mRNA分子17重组体在原核细胞中的表达与调控课件18大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3'-端的互补性16SrRNA3‘……………HOAUUCCUCCAUAG.............................5'噬菌体MS2外壳蛋白

5‘...UCAACCGGAGUUUGAAGCAUG……..3'复制酶5'.....CAAACAUGAGGAUUACCCAUG......................3'噬菌体λCro5‘…..AUGUACUAAGGAGGUUGUAUG.......................3'galE5'...AGCCUAAUGGAGCGAAUUAUG.........................3'β-内酰胺酶5‘……UAUUGAAAAAGGAAGAGUAUG......................3'脂蛋白5'.......AUCUAGAGGGUAUUAAUAAUG......................3'核糖体蛋白质S125'.......AAAACCAGGAGCUAUUUAAUG..............3'RNA聚合酶β5'.......AGCGAGCUGAGGAACCCUAUG......................3'trpE5'.......CAAAAUUAGAGAAUAACAAUG......................3'大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3'-端的互补19终止子终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列两类终止子（按其作用是否需要ρ因子的协助）不依赖ρ因子（蛋白性终止因子）的终止子：在序列上有一些共通的特点，即有一段富含GC的反向重复序列，其后跟随一段富含AT的序列，因而转录生成的mRNA的序列中能形成发夹式结构，后继一连串U，正是RNA聚合酶转录生成的这段mRNA的结构阻止RNA聚合酶继续沿DNA移动、并使聚合酶从DNA链上脱落下来，终止转录。依赖ρ因子的终止子，即其终止转录的作用需要ρ因子的协同，或至少是受ρ因子的影响。抗终止因子：有的蛋白因子能作用于终止序列，减弱或取消终止子的作用

终止子终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转20rrnB强终止子rrnB强终止子21原核表达载体克隆载体：用于外源基因在宿主细胞中复制扩增（松弛型复制子）表达载体：适用与在宿主细胞中表达外源基因融合表达非融合表达原核表达载体克隆载体：用于外源基因在宿主细胞中复制扩增（松弛22组建表达载体条件强启动子两侧的调控序列选择标记正确的读码框架合适的核糖体结合位点（SD序列）SD序列与起始密码子ATG之间合适的距离质粒的稳定性被翻译出的蛋白的性质和稳定性合适的宿主细胞组建表达载体条件强启动子23融合型表达与天然表达融合型表达通常N-末端短的原核多肽（6His；GST；FLAG；MBP等），易亲和纯化具有真核抗原性抵御内源性蛋白酶降解可作为信号肽，进行细胞内定位天然型表达N-末端为Met接近与生物体内的天然蛋白可应用与本身生物易被宿主蛋白酶降解融合型表达与天然表达融合型表达24代表载体——pKK223来源于pBR322非融合型表达Tac启动子pUC8多克隆位点rrnBrRNA转录终止子宿主：LacI宿主（JM105）IPTG诱导代表载体——pKK223来源于pBR32225表达载体表达载体26代表载体——pINⅢ分泌型表达脂蛋白基因启动子（IPP）LacUV-5启动子和操纵基因Lac阻遏子基因大肠杆菌分泌蛋白基因——外膜蛋白基因（OmpA）片段三种密码子读码框架的多克隆位点产物分泌至细胞间隙或培养基代表载体——pINⅢ分泌型表达27重组体在原核细胞中的表达与调控课件28代表载体——pGEX融合型表达——融合谷胱肽巯基转移酶Tac启动子Lac操纵基因SD序列LacI阻遏蛋白基因亲和层析纯化融合蛋白凝血酶或Xa因子切割融合蛋白成完全天然蛋白代表载体——pGEX融合型表达——融合谷胱肽巯基转移酶29重组体在原核细胞中的表达与调控课件30外源基因的要求反转录制备cDNA人工合成基因PCR扩增目的基因外源基因的要求反转录制备cDNA31提高外源基因表达水平的措施提高外源基因表达水平的措施32提高翻译水平调整SD序列与起始密码子AUG之间距离点突变改造碱基，尤其是起始密码子紧随的几组密码子，原因是改善翻译起始和mRNA结构增强RNA的稳定性，如插入“重复性基因外回文顺序”使用原核偏爱密码子提高翻译水平调整SD序列与起始密码子AUG之间距离33减轻细胞代谢负荷诱导表达，使细菌生长与外源基因表达分开表达载体的诱导复制，如pCI101载体25℃→37℃，10个拷贝→1000拷贝表达分泌蛋白减轻细胞代谢负荷诱导表达，使细菌生长与外源基因表达分开34提高表达蛋白的稳定性表达融合蛋白采用突变菌株，保护外源蛋白不被降解（表达载体上克隆入pin基因，其编码蛋白酶抑制剂）表达分泌蛋白（条件：信号肽；分泌有关的氨基酸序列；转运机制）分泌取决于成熟蛋白的氨基酸序列和构象天然蛋白的形态（分泌或细胞内）提高表达蛋白的稳定性表达融合蛋白35重组体在原核细胞中表达与调控重组体在原核细胞中表达与调控36基因表达概述基因表达：指基因携带的遗传信息，经过转录、翻译、加工修饰等复杂的生化反应，产生具有生物学功能的蛋白质过程，即DNA→RNA→蛋白质.基因表达调控转录水平调控转录产物加工mRNA从核到细胞质mRNA降解翻译水平基因表达概述基因表达：指基因携带的遗传信息，经过转录、翻译、37原核与真核生物基因组比较真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量级真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分（如线粒体DNA等），这就增加了基因表达调控的层次和复杂性细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽链形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多原核与真核生物基因组比较真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆38原核基因组的大部分序列都为编码基因，哺乳类基因组的中仅约10%的序列是编码蛋白质或rRNA、tRNA等的基因，其余约90%的序列功能至今还不清楚原核生物基因的蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子和内含子，在转录后经剪接去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列。绝大多数真核生物的蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因原核基因组的大部分序列都为编码基因，哺乳类基因组的中仅约1039原核基因转录特点原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有3种），识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成原核生物无核膜，所以转录与翻译是耦联的；形成多核糖体，可在一条mRNA链上同时合成多条肽链，效率高mRNA可从两条链中任一条有意链上转录，转录方向与DNA方向相反（3’→5’），并且在mRNA还没有合成完时，翻译就开始基因表达调控在转录水平，两种方式：起始控制（启动子），终止控制（衰减子）原核具有SD序列，即同16S核糖体RNA3’末端碱基互补的序列操纵子结构原核基因转录特点原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有3种40外源基因在原核表达的条件通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白外源基因不能带有间隔序列（内含子），如cDNA或全合成的基因利用原核强启动子及其两侧的调控SD序列与起始子密码子ATG有合适的距离外源基因下游加上不依赖ρ因子的转录终止区正确的开放读码框架利用宿主调控系统，调节外源基因表达，防止产物毒害宿主外源基因在原核表达的条件通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并41外源基因在原核表达调控元件启动子：能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列Pribnowbox：-10区；TATAAT（与RNA聚合酶核心酶结合，解旋DNA，合成RNA）-35区：TTGACA（与σ因子结合）代表强启动子：乳糖启动子（Lac）；色氨酸启动子（Trp）；噬菌体左向启动子（λPL）；Trp-Lac杂合启动子（Tac）；T7噬菌体启动子外源基因在原核表达调控元件启动子：能被RNA聚合酶识别、结合42重组体在原核细胞中的表达与调控课件43乳糖操纵元凡能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的序列，不论其对基因转录的作用是减弱、阻止或增强、开放，都可称为操纵子。乳糖操纵元：转录负调控基因：操纵基因（O）；启动子（P）；3个结构基因（Z、Y、A）诱导剂：IPTG乳糖操纵元凡能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的44乳糖操纵元基因图和表达调控乳糖操纵元基因图和表达调控45重组体在原核细胞中的表达与调控课件46重组体在原核细胞中的表达与调控课件47色氨酸操纵元色氨酸是构成蛋白质的组分，一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸，细菌要生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸，但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵元（trpoperon）的调控。色氨酸操纵元色氨酸是构成蛋白质的组分，一48两种调控方式阻遏蛋白的负调控阻遏蛋白+色氨酸→有活性的阻遏蛋白+操纵基因→无活性的操纵基因衰减子依赖与色氨酸浓度或其他氨基酸浓度诱导物：β-吲哚丙烯酸两种调控方式阻遏蛋白的负调控49重组体在原核细胞中的表达与调控课件50PL和PR启动子λ噬菌体CI基因负调控温度敏感的启动子：32℃→42℃原理：在42℃时，CI蛋白失活工作方式宿主合成CI蛋白载体编码CI蛋白PL和PR启动子λ噬菌体CI基因负调控51核糖体结合位点（SD序列）在mRNA分子中起始密码子AUG上游8-13bp处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，由3-9bp组成，它可以与30S亚基中的16SrRNA3'端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，因此有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始。上述mRNA分子的序列特征1974年由J.Shine和L.Dalgarno发现，故称为SD顺序。核糖体结合位点（SD序列）在mRNA分子52重组体在原核细胞中的表达与调控课件53大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3'-端的互补性16SrRNA3‘……………HOAUUCCUCCAUAG.............................5'噬菌体MS2外壳蛋白

5‘...UCAACCGGAGUUUGAAGCAUG……..3'复制酶5'.....CAAACAUGAGGAUUACCCAUG......................3'噬菌体λCro5‘…..AUGUACUAAGGAGGUUGUAUG.......................3'galE5'...AGCCUAAUGGAGCGAAUUAUG.........................3'β-内酰胺酶5‘……UAUUGAAAAAGGAAGAGUAUG......................3'脂蛋白5'.......AUCUAGAGGGUAUUAAUAAUG......................3'核糖体蛋白质S125'.......AAAACCAGGAGCUAUUUAAUG..............3'RNA聚合酶β5'.......AGCGAGCUGAGGAACCCUAUG......................3'trpE5'.......CAAAAUUAGAGAAUAACAAUG......................3'大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3'-端的互补54终止子终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列两类终止子（按其作用是否需要ρ因子的协助）不依赖ρ因子（蛋白性终止因子）的终止子：在序列上有一些共通的特点，即有一段富含GC的反向重复序列，其后跟随一段富含AT的序列，因而转录生成的mRNA的序列中能形成发夹式结构，后继一连串U，正是RNA聚合酶转录生成的这段mRNA的结构阻止RNA聚合酶继续沿DNA移动、并使聚合酶从DNA链上脱落下来，终止转录。依赖ρ因子的终止子，即其终止转录的作用需要ρ因子的协同，或至少是受ρ因子的影响。抗终止因子：有的蛋白因子能作用于终止序列，减弱或取消终止子的作用

终止子终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转55rrnB强终止子rrnB强终止子56原核表达载体克隆载体：用于外源基因在宿主细胞中复制扩增（松弛型复制子）表达载体：适用与在宿主细胞中表达外源基因融合表达非融合表达原核表达载体克隆载体：用于外源基因在宿主细胞中复制扩增（松弛57组建表达载体条件强启动子两侧的调控序列选择标记正确的读码框架合适的核糖体结合位点（SD序列）SD序列与起始密码子ATG之间合适的距离质粒的稳定性被翻译出的蛋白的性质和稳定性合适的宿主细胞组建表达载体条件强启动子58融合型表达与天然表达融合型表达通常N-末端短的原核多肽（6His；GST；FLAG；MBP等），易亲和纯化具有真核抗原性抵御内源性蛋白酶降解可作为信号肽，进行细胞内定位天然型表达N-末端为Met