Odyssey 红外荧光扫描成像系统培训手册1

Odyssey红外荧光扫描成像系统培训手册二oo三年九月目录一、Odyssey红外成像系统技术特点二、系统安装条件三、Western实验所需试剂设备及样品四、培训程序及时间安排五、仪器及试剂系统介绍六、Western实验操作流程介绍七、软件使用培训八、常见问题处理九、注意事项一、Odyssey红外成像系统技术特点一般的荧光染料的激发和检测波长都位于可见光谱区，在此波长范围内，化学高分子物质（膜、胶、微孔塑料板等）也会发出荧光，因此易产生高背景的荧光干扰，从而不能有效用于膜上蛋白或者核酸的直接荧光成像。而在红外波长区这些大分子物质几乎不发出任何荧光信号，使得红外荧光染料在长波下检测时背景荧光很低，具有很好的信噪比，这一特点使得核酸和蛋白的膜上荧光检测成为可能。LI-COR根据红外荧光的这一特点开发出Odyssey红外成像系统，独特的采用2个红外激光作为激发光源，以扫描成像方式对样品进行检测。样品载体可以是膜、凝胶和微孔板。该系统配置的2个红外激光激发光源，激发光波长分别为680nm和780nm，配置的2个高灵敏度光敏二极管可以分别检测720nm和820nm的发射荧光，因而Odyssey可同时检测两种IRDyes染料的荧光信号。IRDyes染料的最大吸收值与Odyssey的两个红外激光器680nm和780nm激发波长相匹配，其发射光波长又与Odyssey的两个光敏二极管检测波长相匹配，与同时IRDye700和IRDye800的发射波长峰值相隔100nm，因此Odyssey可以给出最大的灵敏度和最小的信号交叉。同时由于采用二极管激光器和固态检测器，Odyssey具有很长的使用寿命（激光器使用寿命约4-6万小时），而系统维护的要求却很低。该系统可广泛应用于信号传导，蛋白磷酸化分析，In-Cell-Western分析等蛋白领域研究。主要特点1．高灵敏度,效果同于或者好于化学发光法，但不需信号放大步骤，信噪比高。2．直接检测，无需曝光和显色底物，不需要X光片，不需要暗房，没有放射性废料产生。3．双色检测，可以在一次杂交中同时检测两种目的分子，直观，省时。4．宽广的线性范围，可用于高准确性定量。5．背景低，图像清晰，激光强度可调，不会丢失弱的信号6．强有力的软件支持，结果分析如确定分子量和定量及图象处理编辑很容易7．系统操作和维护简单Odyssey的应用应用领域：蛋白质研究，核酸研究具体包括：Western分析，In-GelWestern分析，蛋白质定量分析，双色磷酸化分析，考马司亮兰胶的扫描，蛋白双向电泳，双色EMSA，双色微孔板分析，BDPowerBlotAnalysis，NorthernBlot，SouthernBlot等二、系统安装条件1.位置要求：稳定水平的操作平台放置设备，远离热源，避免阳光直射2.空间及载重要求：操作平台尺寸（长×宽×高）：80×70×80cm操作平台载重：40kg3.温度要求：15-25℃4.湿度要求：不超过60%5.电源：90-250VAC，47-63Hz。6.其它：通用插头接线板（至少3个插孔）三、Western实验所需试剂设备及样品WesternBlot实验所需试剂耗材：客户自备的蛋白样品(建议为新鲜制备的蛋白，最好用western验证过)细胞裂解液SDS胶电泳缓冲液硝酸纤维素膜转移缓冲液PBSTBS封闭液（建议使用5%进口脱脂奶粉）Tween-20一抗荧光标记的二抗（IRDye700和IRDye800）锡箔纸（通用试剂详细配方请参照《分子克隆实验指南》）其它配套设备：1)蛋白电泳仪2)脱色摇床3)转膜仪4)分子生物学实验室常用工具：加样器，Tip头，量筒，离心管，离心机，冰盒等。四、培训程序及时间安排（请至少安排2名实验室长期工作人员参加培训，方便以后有人员变动您也能进行仪器内部培训。）1.仪器概况及相关应用讲座（1小时）2.仪器使用培训（2小时）3.用户实际操作练习与答疑（1小时）五、仪器及试剂系统介绍1.Odyssey红外成像系统技术特点讲解2.仪器系统组成和工作原理讲解3.配套试剂介绍六．Western实验操作流程介绍荧光检测Western操作流程（以硝酸纤维素膜为例）：1.吸去培养液，用预冷的PBS洗细胞两次2.加入细胞裂解液，4℃放置20min3.用细胞铲刮下细胞，转移到1.5ml离心管，13000rpm，4℃，20min4.取上清5.取20-100µg蛋白进行电泳6.电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）按分子克隆实验手册操作7.硝酸纤维素膜于转移缓冲液（PBS）中平衡20min。（如果使用PVDF膜，请先）用甲醇浸湿，再用去离子水冲洗后转移到转移缓冲液中平衡20min。8.电泳胶置转移缓冲液中平衡20min。9.裁两张与胶同样大小的滤纸,置转移缓冲液中平衡。10.转膜顺序：负极－专用滤纸－电泳胶－PVDF膜－专用滤纸－正极。15V，电转30min。11.电转后，封闭液中封闭1～3hour。注：封闭液可以用5%的进口脱脂奶粉（用PBS溶解），因为Tween-20和BSA会对Odyssey造成高背景，所以在封闭完成前尽量不要让膜接触到这两种物质，所以麻烦您确定封闭液中没有Tween-20和BSA成分。12.封闭液稀释一抗（建议比例为1：1000－1：5000），膜在一抗中室温至少1hour或者4℃过夜。注：抗体的稀释倍数与抗体质量和实验中的蛋白样本相关，麻烦您根据经验选择合适稀释倍数。同时，不同的抗体可能需要在抗体稀释液中含有0.1-0.2%的Tween-20来降低背景，您可以根据您要检测的蛋白以及平时操作经验来选择需否在一抗稀释液中添加0.1-0.2%的Tween-20。13.之后用PBST于摇床洗膜4×5mins。14.封闭液稀释二抗（建议比例为1：3000~10000），膜在二抗中室温于摇床1hour（避光）。注：如果一抗稀释液中含有0.1-0.2%的Tween-20，则二抗稀释液也添加相同的Tween-20。如果使用Tween-20的同时添加0.01-0.02%的SDS于二抗稀释液中可以比较好的降低背景15.洗膜同13（避光）16.用PBS洗去膜上残留的Tween-20，接下来可直接进行扫描。实验的详细的操作流程、注意事项、问题解决请参见附件以及《分子克隆实验指南》。仪器的操作流程：1．在面板上打开仪器电源开关，再开启电脑，关机时相反。2．用软布或无尘纸蘸双蒸水将扫描平面的玻璃擦拭干净。3．将要扫描的胶或膜放到扫描平面上，记下坐标，扣上舱盖。4．双击软件图标，输入用户名、密码，进入主菜单。5．点击scan快捷键，选择要扫描的区域、介质、通道及合适的灵敏度、分辨率，开始扫描。6．扫描结束后对扫描结果进行分析。7．依次进行图象裁切、定道、定分子量标准、背景扣除等操作。8．根据需要输出图形或数据报告表格。七．软件使用培训以下是关于Odyssey配套软件的简要操作说明，便于初次操作的研究者能快速掌握如何使用软件进行扫描。关于进一步的如何使用软件对实验结果进行分析，请参见随机所带的英文原版使用手册。一、如何进行图像的扫描：1双击桌面上Odyssey的快捷方式图标打开软件出现软件的使用界面2点击工具栏中图标，建立一个新的case软件提示选择case的途径和名称，点击Browse，选择case存储的位置，并在name栏中输入case的名称，点击Done，软件提示将文件存储到相应的位置中点击确定，保存文件。3点击工具栏中图标，该图标在可以进行扫描时变为彩色状态系统提示输入用户名和密码，一般情况下用户名和密码均为user，点击OK，弹出扫描设置对话框，对扫描参数进行设置Name：输入本次扫描的名称Group：定义用户所归属的组别Preset：设定选择扫描界面可以根据实验的要求进行扫膜、扫蛋白胶、扫DNA胶、扫96孔板等选择操作Resolution：扫描分辨率设定，在右侧下拉框里选择需要的分辨率，有21、42、84、169、337五种分辨率可选，这里分选择的值越小，图像的分辨率越高，扫描得到的图像越大。一般的扫描我们推举使用169就可以得到300dpi的图像。Quality：图像的质量，在右侧的下拉框中选择需要的图像质量，一般的Westernblot膜我们推荐使用medium即可。Focusoffset：聚焦平面选择，一般情况下当在上面Preset中选择好扫描选项后，聚焦平面的值会根据上面的选择自动给出聚焦平面，一般来说，膜的聚焦平面为零，胶的聚焦平面为胶厚度的一半（可根据胶实际的厚度手动输入）Channels：选择扫描的激光通道，根据所使用的二抗其激发后产生的发射光波长为720nm或820nm，选择相应的700或800通道，如果同时使用两个通道，也可同时勾选这两种通道。Intensity：在右侧的下拉框中选择激发光的强度，由L2.0至10共24种强度可以选择，根据信号的强弱进行调整，信号弱时可将激发光强度相应调高。在进行双通道扫描时，可根据不同的信号，设置不同的激光强度进行同步扫描。ScanArea：在四个选项框中可以手动输入值，或者在右侧的25×25的扫描平面模拟图中圈选要进行扫描的面积。4扫描点击StartScan按钮，开始扫描扫描开始后，扫描的图像可以实时出现，在右下角可以看到完成的百分数5图像调整当扫描达到100％后，扫描结束，弹出图像调整对话框Flip：图像位置颠倒选项，可以将图像进行上下颠倒Rotate：图像旋转选项，可对图像进行不同角度的旋转Subtract：在原始图像截选取需要的范围Crop：将选取的范围裁剪下来Undo：返回上一步AdjustImage：调整图像的色阶AlterImage：调整图像的亮度和对比度在图像调整完成后，点击进入图像分析界面二、如何对图像进行灰度分析双击Scan下Analysis图标，打开图像，可以进行分析。1图像调整工具栏：快捷图标新建一个project打开已经存在的project打印显示的图像扫描，由扫描仪获得图像导出显示的图像，选择图像的分辨率和格式，并选择相应路径进行保存在已有的Scan下，再次添加新的Analysis显示选中的Analysis将已打开的图像，再次打开并平行窗口排列图像放大图像缩小图像比例调整去除或显示图像上的标注对图像的亮度和对比度进行调整对图像的的色阶进行调整显示700通道图像或显示双通道图像显示800通道图像将图像转化为黑白色显示彩色图像显示图像设置参数显示图像背景设置参数显示选择圈选图像的细节表格形式显示所圈选的图像显示所选泳道的峰值图调整图像在圈选框中的位置对图像的灰度值和浓度值做标准曲线编辑分子标准2图象分析工具栏3图象分析A打开需要分析的图象，左侧的分析工具栏被激活B使用矩形选择工具圈选图象上要分析的条带（尽可能小）C系统自动给出该条带的灰度值D如果进行多个目标条带的分析，对多个目标条带进行圈选，然后拖动鼠标将所有矩形框选中，则多个分析结果可以同时显示软件分析的详细功能，请参照仪器说明书，并和相关技术支持联系八.常见问题处理问题：高背景，但是是均匀分布的可能原因封闭液中有Tween-20存在封闭液中有BSA没有使用最佳的封闭试剂硝酸纤维素膜上的背景建议在封闭完成前不要让膜接触到Tween-20永远不要将BSA用于封闭或者抗体稀释，BSA会造成不可逆的高背景对不同的封闭液进行比较找到最适合自己体系的封闭液；另外可以延长封闭时间在稀释的抗体中加入Tween-20从而降低背景。Tween-20的浓度需要根据所用的一抗进行优化，一般为0.05-1%减少或者除去稀释抗体中的Tween-20，特别是在使用牛奶作为封闭液的时候优化一抗和二抗的稀释倍数增加洗膜次数和洗膜液的量。确保洗膜液中含有0.1%的Tween-20,必要时可提高Tween-20的浓度。但要注意，过量的Tween-20(0.5-1%)可能会使信号减弱。用Odyssey配套的封闭液，而不是牛奶。牛奶里经常会有IgG,IgG会和抗羊的二抗发生交叉反应。增加抗体的量，使膜完全浸没其中。操作要小心，处理膜的时候使用镊子，要防止膜干掉。PVDF膜上的背景抗体浓度太高洗膜不彻底封闭液有污染，污染物和抗体发生交叉反应使用的抗体量不合适膜的