发酵液预处理和固液分离

关于发酵液预处理和固液分离第一页，共一百九十八页，2022年，8月28日预处理和固液分离内容固液分离发酵液胞外上清液/滤液预处理提取生化物质的第一步，分两部分：胞内富集细胞第二页，共一百九十八页，2022年，8月28日

一、发酵液预处理的基本思路

二、预处理的目的

三、发酵液预处理的方法

第一节发酵液过滤特性的改变第三页，共一百九十八页，2022年，8月28日发酵液成分很复杂，包含菌（细胞）体，胞内外代谢产物，及剩余的培养基残分等；不管人们所需要的产物是胞内还是胞外，都首先要进行培养液的固液分离，才能进行后续的操作；对于胞外产物，可先将菌体或其他悬浮杂质去除，才能从澄清的滤液中提取代谢产物；对于胞内产物，首先富集菌体，再进行细胞破碎和碎片分离，然后才能提取胞内产物。一、发酵液预处理的基本思路

第四页，共一百九十八页，2022年，8月28日发酵液的基本特性1、发酵液成分复杂。2、发酵产物浓度低，悬浮液中大部分是水。3、悬浮物颗粒小，相对密度与液相差别不大。造成液相粘度很大，不宜过滤。4、菌体、蛋白等固体颗粒可压缩性大。5、产物性质不稳定，随时间易发生变化，如氧化、污染、蛋白质水解等作用的影响。6、发酵液中含有色素、毒性物质、热源物质等，对产品的质量安全及卫生标准产生不利影响。这些特性使得发酵液的过滤与分离相当困难。第五页，共一百九十八页，2022年，8月28日

固液分离方法主要是过滤和离心。对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度大，不能直接过滤；若用高速离心，能耗很大，设备昂贵；若用膜分离技术（如微滤）易产生膜污染，通量降低。发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物质的存在也会影响固液分离。寻找一种经济有效的方法来提高固液分离速度显得十分必要。预处理是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤第六页，共一百九十八页，2022年，8月28日二、预处理的目的

预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：（1）改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。（2）相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。（3）尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）。第七页，共一百九十八页，2022年，8月28日生物技术下游加工过程的一般步骤

第八页，共一百九十八页，2022年，8月28日三、发酵液预处理的方法加热法（Heating）调节悬浮液的pH值（RegulationofpH）助滤剂和反应剂（FilteraidsandReactant)杂蛋白的去除（Removalofuselessprotein）高价无机离子的去除（Removalofinorganicion）凝聚和絮凝（Coagulationandflocculation）第九页，共一百九十八页，2022年，8月28日

降低液体的粘度可以有效提高过滤的速率。1、降低液体的粘度常用方法有加水稀释和加热处理。流体力学原理过滤速率与液体的粘度成反比，降低液体粘度可有效提高过滤速率。第十页，共一百九十八页，2022年，8月28日1）加水稀释会增加悬浮液的体积，加大后续过程的处理任务。稀释后的过滤速率提高的百分比必须大于加水比才能有效。第十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日2）加热A、加热降低液体粘度液体黏度是温度的指数函数，升温是降低黏度的有效措施。B、加热使蛋白质变性凝固，去除杂蛋白

变性蛋白质的溶解度小。第十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日麦芽汁的黏度-温度曲线第十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日麦芽汁40℃粘度为12×10-3升高至75℃其粘度可下降一半以上，过滤速率可加倍。链霉素在pH3.0，加热至70℃半小时，粘度下降1/6，过滤速率可增大10-100倍。第十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日

加热时必须严格控制温度和时间：加热温度不能影响目的产物的活性及其他性质。避免氧化、分解、变性等。加热时间不能太长，否则会使细胞溶解，胞内物质大量外溢，增加发酵液的复杂性，影响目的产物的分离纯化。第十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日2、调节pHpH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。细胞(碎片)及某些胶体物质在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。大幅度改变pH还能使蛋白质变性凝固。通过调整pH值改变膜过滤中易吸附分子的电荷性质，可减少膜堵塞和污染；影响离子型絮凝剂的电离度。第十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日0020040060061218pH4.6pH4.2pH3.8pH2.8FiltrateVolume,cm3Time,minutesTheeffectonfiltratevolumeofpH第十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日

pH值的调整需要注意：保护目的物活性，一般不宜过酸或过碱。加酸或加碱时要慢慢地边加边搅拌，避免局部浓度过高，引起目的产物变性。第十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日采用凝聚与絮凝技术能有效的改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。还能有效的除去杂蛋白质和固体杂质，提高滤液的质量，因此絮凝与凝聚是目前工业上最常用的预处理方法之一。3、凝聚Coagulation第十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日凝聚是指在电解质作用下，由于胶粒之间扩散双电层电位下降，电排斥作用降低，破坏胶体体系的分散状态，使之不稳定相互凝集成1mm左右块状凝聚体的现象。第二十页，共一百九十八页，2022年，8月28日

蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质的相对分子质量在5*103-1*106之间，分子直径约1-30nm，呈胶体性质;蛋白质水化层：蛋白质分子周围存在与蛋白质分子紧密或疏松结合的水化层。紧密结合的水化层可达到0.35g/g蛋白质，而疏松结合的水化层可达蛋白质分子质量的2倍以上；静电排斥作用：第二十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日(1)胶体双电层结构发酵液中菌体表面带有负电荷，由于静电引力使溶液中反离子被吸附在其周围。正离子同时受到使它们均匀分布的热运动影响，具有离开胶粒表面的趋势，在界面上形成了双电层。第二十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日两种相反作用力下，双电层分裂成两部：

1）吸附层（紧密层）；2）扩散层。形成了扩散双电层的结构模型。第二十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日

双电层可分为两部分：紧密层：距胶核表面约一个离子半径的stern平面以内，正离子被紧密结合在胶核表面，不流动。分散层：紧密层外围反离子浓度逐渐降低直至达到主体溶液的平均浓度。滑移面：当胶体粒子在溶液中作相对运动时，总有一薄层液体，随着它一起滑移，这一薄层，厚度比吸附层稍大。第二十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日不同界面上形成不同的电位:胶核表面的电位φs是整个双电层的电位;Stern平面上的电位为φd;滑移面上的电位为ζ,称ζ电位。第二十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日

ζ电位是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双电层的特征。带电粒子间的静电相互作用取决于ζ电位的大小。当双电层的ζ电位足够大时，静电排斥作用抵御分子间的相互吸引作用，使蛋白质溶液处于稳定状态。第二十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日ζ电位电位的计算

D—

水的介电常数；q—

胶体的电荷密度，即滑移面上的电荷密度；δ—

扩散层的有效厚度，即为吸附层和扩散层界面处电位

φd降低到其值为1/e处的距离，不能直接测定.ζ电位是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双电层的特征，并作为研究凝聚机理的重要参数。第二十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日δ—扩散层的有效厚度式中N一阿伏伽德罗常数；

T一热力学温度;k—波尔兹曼常数；

e—电子电荷；

Zi—i种反离子的化合价；

Ci—i种离子的摩尔浓度。第二十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日(2)双电层与凝聚由上述两式可知，ζ电位与扩散层厚度δ和电动电荷密度q成正比，而扩散层厚度又与溶液中反离子强度和电荷成反比。对带负电性菌体的发酵液，高价阳离子的存在，可压缩扩散层的厚度，促使ζ电位迅速降低，而且化合价越高，这种影响越显著。第二十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日当双电层的排斥力不足以抗衡胶粒间范德华引力时，由于热运动的结果，导致胶粒的相互碰撞而聚集。由此可见，在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质，由于ξ电位的降低和脱除胶粒表面水化膜，就导致了胶粒间的凝聚作用。第三十页，共一百九十八页，2022年，8月28日

凝聚价或凝聚值：

使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（mmoL/L)，称为凝聚价或凝聚值。

电解质的凝聚能力用凝聚价或凝聚值来表示第三十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日Schulze－Hardy法则（叔米-哈第）：反离子的价数越高，凝聚价越小，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力受化合价、水化半径、离子运动能力的影响，次序为Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+第三十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日常用的凝聚剂电解质有：硫酸铝Al2(SO4)3•18H2O（明矾）；氯化铝AlCl3•6H2O;三氯化铁FeCl3;硫酸亚铁FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3第三十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日指在某些高分子絮凝剂的作用下，基于架桥作用，使胶粒交联成团、形成10mm大小的较大絮凝团的过程。

采用凝聚方法得到的凝聚体，其颗粒是比较细小的，有时还不能有效的进行分离。采用絮凝法则可以形成粗大的絮凝体，使发酵液较容易分离。

4、絮凝flocculation第三十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日絮凝剂是一类易溶于水的高分子聚合物。其分子量可高达数万甚至千万以上，它们具有长链线性结构，其链节上含有许多活性功能基团，可以带有多价电荷，如阴离子-COOH，阳离子-NH2，也可以是不带电的非离子型基团。1）絮凝剂第三十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日它们通过静电引力，范德华分子引力或氢键作用，强烈的吸附在不同颗粒的表面，当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同颗粒的表面上，产生了架桥连接，生成粗大的絮团，这就是絮凝作用。只要胶粒相互间排斥电位不太高，高分子聚合物的链节足够长，跨越的距离超过了颗粒间的有效排斥距离，就能把多个胶粒拉在一起，导致架桥絮凝。第三十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日2）高分子絮凝剂的吸附架桥作用第三十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日1）其分子必须含有相当多的活性官能团，使之能和胶粒表面相结合。2）要求必须具有长链的线性结构，以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团，但相对分子量不能超过一定限度，以使其有良好的溶解性。3）对絮凝剂的化学结构的要求第三十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日可分为四类：人工合成有机高分子聚合物、天然有机高分子聚合物、无机高分子聚合物、微生物絮凝剂4）工业上使用的絮凝剂A、目前常用的是人工合成有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚乙烯亚胺衍生物；聚丙烯酸类和聚苯乙烯类衍生物。第三十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日

高分子聚合物絮凝剂根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：阴离子型（含有羧基)、阳离子型（含有胺基）、非离子型第四十页，共一百九十八页，2022年，8月28日聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点用量少，一般以mg/L计量；絮凝体粗大，分离效果好；絮凝速度快；种类多，适用范围广。聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。近年来发展的聚丙烯酰胺阴离子絮凝剂，无毒，可以用于医药和食品上。目前最常见：聚丙烯酰胺类絮凝剂第四十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日B、天然有机高分子絮凝剂

人工合成有机高分子絮凝剂虽然发展很快，但还存在着残留单体有毒，生物降解难等问题，所以其应用受到了限制。天然有机高分子絮凝剂具有无毒，易生物降解，原料来源广等优点。天然有机高分子改性絮凝剂根据原料来源不同可分为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。其中淀粉改性絮凝剂的研究开发最引人注目。第四十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日C、无机高分子聚合物

有聚合铁系和铝系两大类铁系絮凝剂具有操作简单、费用低，受温度影响小，亲和力强，能有效地去除悬浮物、表面活性剂、破坏油水乳状液的能力很强等优点，缺点腐蚀性强、稳定性差。铝系是目前应用广、工艺较成熟的一类无机金属盐絮凝剂，絮凝效果好，缺点具毒性等。第四十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日D、微生物絮凝剂微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，一类由微生物或其分泌物产生的具有絮凝细胞功能的代谢产物。包括直接利用微生物细胞的絮凝剂、利用微生物细胞壁代谢产物的絮凝剂和克隆技术所获得的絮凝剂主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。最大的优点：安全，无毒和不污染环境。第四十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日1、微生物絮凝剂的商业化生产始于20世纪90年代，如红平红球菌及由此制成的NOC-1是目前发现的最佳微生物絮凝剂

2、微生物絮凝剂或将大部分替代普通絮凝剂3、浮游藻类、草分枝杆菌、硅酸盐芽孢杆菌。第四十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日

5）影响絮凝效果的因素絮凝剂分子量和类型絮凝剂用量溶液pH搅拌时间搅拌转速第四十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日①絮凝剂分子量分子量越大，链越长，吸附架桥作用越明显，但分子量越大，絮凝剂的溶解度越低。第四十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日

浓度低时，加大絮凝剂用量有助于架桥提高絮凝效果，但用量过多反而会引起吸附饱和，在胶粒表面形成覆盖层，而失去与其他胶粒的架桥机会，使胶粒更加稳定，降低絮凝效果。②

絮凝剂浓度第四十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖。第四十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日

溶液pH的变化会影响絮凝剂功能团的电离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，链节上相邻离子基团间的电排斥作用，使分子链从卷曲状态变为伸展状态，架桥能力提高。③溶液pH第五十页，共一百九十八页，2022年，8月28日

刚加入时搅拌速度加快能使絮凝剂迅速分散，发挥作用，但絮凝剂形成以后，过度搅拌会打碎絮凝团。④搅拌速度第五十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日定义：包括了凝聚和絮凝机理的过程称为混凝。对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和吸附桥架的双重机理，所以可单独使用。5、混凝第五十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，则主要通过分子之间引力和氢键作用产生吸附桥架，所以它常与无机电解质凝聚剂搭配使用。首先加入电解质使悬浮粒子间的双电层电位降低、脱稳、凝聚成微粒，然后再加入絮凝剂絮凝成较大的颗粒。无机电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创造了良好的条件，从而大大提高了絮凝的效果。第五十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日6、加入助滤剂（filteraids）

一种不可压缩的多孔微粒，在发酵液中加入固体助滤剂，则菌体可吸附于助滤剂微粒上，助滤剂就作为胶体粒子的载体，均匀地分布于滤饼层中，降低了滤饼的可压缩性，减小了过滤阻力。目前生物工业中常用的助滤剂是硅藻土，其次是珍珠岩粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纤维素、白土等。第五十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日一种是在过滤介质表面预涂助滤剂；另一种是在发酵液中直接加入。此法要有一个搅拌槽，充分搅拌，以防沉淀。也可以两种方法同时使用。

1）助滤剂使用方法第五十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日A、根据目的产物选择目的产物为液相时，注意产物是否会被助滤剂吸附，注意pH。目的产物为固相时，一般使用淀粉、纤维素等不影响产物质量的助滤剂。2）助滤剂的选择和使用第五十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日

B、根据过滤介质和过滤情况选择当使用粗目的滤网时，易漏。采用石棉粉、纤维素、淀粉做助滤剂；当使用细目滤布时，采用细硅藻土，如采用粗硅藻土，料液中的细颗粒仍通过助滤剂将到达滤布表面，从而使过滤阻力增大；当使用烧结或粘结材料时，宜使用纤维素；可使滤渣易剥离，并防止堵塞毛细孔。第五十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日

C、粒度选择

助滤剂粒度及粒度分布对过滤速率和滤液的澄清度影响很大，要粒度适宜。当粒度一定时，过滤速率与澄清度成反比，过滤速率越大，澄清度差；过滤速率小，澄清度好。助滤剂的粒度必须与悬浮液中固体粒子的尺寸相适应，一般应通过试验来确定选用何种粒度的助滤剂。第五十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日

D、使用量

助滤剂使用量要合适，涂层厚度一般在2mm，直接加入时加量与料液中固形物含量相等。使用硅藻土时细粒用量为500g/m3，中粒用量为700g/m3，粗粒用量为700-1000g/m3。第五十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日GradeDensity(kg/m3)pHWaterAdsorption(%)RelativeFlowRateDryWetDiatomaceousEarthsStandardSuper–Cel1302807.0260200512HyfloSuper–Cel14028010.025050053519028010.0250140056031032010.02207500PerlitesTerracel30011026027.5-300Terracel5001302407.5-900TypicalpropertiesofFilterAids第六十页，共一百九十八页，2022年，8月28日7.加入反应剂

加入某些不影响目标产物的反应剂，可消除发酵液中的一些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速度。

1）加入反应剂与某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀,生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，又能使蛋白质凝固，过滤性能上升，沉淀本身可作为助滤剂。如在新生霉素发酵液中加入CaCl2和Na3PO4，生成Ca3(PO4)2沉淀。第六十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日2）发酵液中含有不溶性多糖物质时，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。第六十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日第二节发酵液的相对纯化一、高价无机离子的除去二、杂蛋白的去除方法第六十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日发酵液中杂质很多，其中有些杂质不仅影响产品的质量和收率，同时对后继提取和纯化有很大影响。动植物或微生物细胞在合适的培养基及一定条件下生长、繁殖，并积累一定的代谢产物，其培养液预处理富含两大类杂质。第六十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）杂蛋白常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤效率。采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。

在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。第六十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日1、离子交换法指用阳离子交换树脂除去发酵液中的阳离子。一、高价无机离子的除去如四环素和土霉素的发酵液，铁离子含量很高，对成品质量与提取影响很大，尤其影响离子交换的吸附容量。一般采用122树脂预先除去。第六十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日

Ca2+的去除一般加草酸，生成不溶性的草酸钙，还能使蛋白质絮凝凝固，提高滤液（也称为原液）质量。但草酸价格较高，且草酸溶解度较小，故用量大时，可用其可溶性盐，如草酸钠。应注意回收草酸。如四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，在60℃下反应生成草酸铅。后者在90-95℃下用硫酸分解，经过滤、冷却、结晶后可以回收草酸。2、沉淀法第六十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日Mg2+的去除

加入三聚磷酸钠Na5P3O10，它和镁离子形成可溶性络合物后，即可消除对树脂的影响。

Na5P3O10+Mg2+MgNa3P3O10+2Na+第六十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日Fe3+的去除

可加黄血盐使其形成普鲁士兰沉淀而除去。

4Fe3++3K4Fe(CN)6=Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+第六十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日二、杂蛋白的去除方法沉淀法变性法吸附法第七十页，共一百九十八页，2022年，8月28日1.杂蛋白去除-沉淀法

precipitationA.等电点沉淀法（isoelectricprecipitation

）蛋白质的等电点大都在酸性范围内(pH4.0～5.5)，调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。B.酸碱调节，使蛋白质与离子形成沉淀在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子形成沉淀，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐等；在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子形成沉淀，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等。第七十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日2.杂蛋白去除-变性

Denaturation

蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性。变性蛋白质溶解度较小。加热，大幅度调节pH值，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。不足之处：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。

第七十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日链霉素生产中，采用调pH至酸性（pH3.0），加热至70℃，维持半个小时的方法来使蛋白变性，能使过滤速度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。柠檬酸发酵液，采用加热至80℃以上，使蛋白质变性凝固和降低发酵液粘度，从而大大提高了过滤速度。第七十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日3.杂蛋白去除-

吸附法adsorption加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN)5]2的胶状沉淀来吸附蛋白质，利用此法除蛋白质已取得很好的效果。在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。第七十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日

第三节固液分离及设备一、影响发酵液固液分离的因素二、常见的固液分离的方法第七十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发酵液中除去，即固液分离。固液分离是生物产品生产中经常遇到的重要单元操作。培养基、发酵液、某些中间产品和半成品等都需要进行固液分离。其中发酵液由于种类多，黏度大，和成分复杂，其固液分离最为困难。第七十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日一、影响发酵液固液分离的因素1）发酵液中悬浮离子的大小第七十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变化范围很宽。浓度可高达每单位体积含60%的不溶性固体，又可低至每单位体积仅含0.1%。粒径的变化可以从直径约为1um的微生物，到直径为1mm的不溶性物质。第七十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日2）发酵液的黏度

固液分离速度通常与粘度成反比，粘度越大，固液分离越困难。影响粘度的因素：菌体的种类和浓度（重要因素）：通常丝状菌、动物或植物细胞悬浮液粘度较大，浓度增大，粘度也提高。培养液中蛋白质、核酸大量存在：通常细胞破碎或细胞自溶后粘度增大。因此细胞破碎的程度应控制，发酵放罐时间要适宜。第七十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日培养基成分：如用黄豆粉、花生粉作氮源，淀粉作碳源，粘度都会升高。某些染菌发酵液，如染细菌，则粘度会增大。发酵过程的不正常处理，如大量过剩的培养基和消沫油加入，都会使粘度增大。第八十页，共一百九十八页，2022年，8月28日收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相;收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物（细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等）。固液分离的目的第八十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日二、常见的固液分离方法过滤(Filtration)离心(Centrifugation)全发酵液提取(Fermentationextraction)第八十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日不同性状的发酵液应选择不同的固液分离方法和设备。如霉菌和放线菌为丝状菌，体形大，发酵液都采用过滤方法；而细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，外形尺寸在1-10um范围。一般采用高速离心机分离，但若对其发酵液采用适当的方法经预处理后，也可采用过滤方法。第八十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日（一）过滤filtration过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差ΔP作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。过滤介质filtermedium

:过滤采用的多孔物质；滤浆filterpulp

:所处理的悬浮液；滤液filtrate

:通过多孔通道的液体；滤饼或滤渣filtercake:被截留的固体物质。第八十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日所用过滤的介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，填充于过滤器内构成过滤层，当悬浮液通过过滤层时，固体颗粒被阻拦式吸附在滤层的颗粒上，使滤液澄清。过滤介质起着主要的过滤作用。此种方法适用于固体含量少于0.1g/100mL，颗粒直径在5~100μm的悬浮液的过滤分离，如河水、麦芽汁、酒类和饮料等的澄清。1、澄清过滤第八十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日第八十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日2、滤饼过滤过滤介质为滤布，当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤渣）。在滤饼过滤中，当滤饼至一定厚度时即起主要的过滤作用。适合于固体含量大于0.1%的悬浮液的过滤分离。第八十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日第八十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日A、过滤推动力

悬浮液自身压强差、重力；悬浮液的—外加压力；过滤介质的—抽真空；离心力。第八十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日B、过滤阻力介质阻力：一般过滤初较明显滤饼阻力

滤饼厚度：随过滤进行而增加滤饼特性：颗粒形状、大小

大多情况下，过滤阻力主要取决于滤饼阻力。可压缩滤饼：形成的滤饼刚性不足，其内部空隙结构随着滤饼的增厚或压差的增大而变形，空隙率减小。不可压缩性滤饼第九十页，共一百九十八页，2022年，8月28日C、滤饼的质量比阻衡量过滤特性的主要指标是滤饼的质量比阻rB，它表示单位滤饼厚度的阻力系数，决定过滤的流速。与滤饼的结构特性有关。对于可压缩性滤饼，rB是操作压力差的函数：

rB＝r(ΔP)mr-不可压缩滤渣的比阻，对于一定的料液为常数；

m-压缩性指数，一般取，对不可压缩性滤饼m为0。对于不可压缩性滤饼，rB为常数，第九十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日滤饼的质量比阻与过滤关系滤饼的比阻值是随操作压力差的提高而增大的。开始过滤时应注意不能很快提高压差，通常靠液柱的自然压差进料，并应缓慢地，逐步地升高压力，一般在相当长的时间内，压力差不要超过0.05MPa，最后的压差也不超过0.3－0.4MPa。若操作压力控制过高，由于比阻值的急剧增加，会使过滤速度很快下降，以至达到不能继续过滤的程度。第九十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日D、恒压下的过滤方程恒压下，可压缩性滤饼的比阻应为常数。如过滤介质的阻力相对较小可以忽略不计，

q—

到时间τ时通过单位过滤面积的滤液量，m3；

ΔP—

压力差，Pa；

μ—

滤液粘度，Pa·s；

rB—

滤饼的质量比阻，m/kg；

XB

—

通过单位体积滤液所形成的滤渣重量(干重),kg／m3；

τ—

过滤时间，s第九十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日

E.质量比阻的计算质量比阻可根据上式，利用图解法求得。以τ/q为纵轴，以q为横轴所得的直线斜率为M，则rB可按下式计算：

根据滤饼的质量比阻值，可衡量各种不同发酵液过滤的难易程度。第九十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日

真菌的菌丝比较粗大，如青霉素的重量比阻为(0.15一0.20)xl012m/kg左右，发酵液容易过滤。放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状，如链霉素重量比阻为2000x1012m/kg左右，过滤较困难，一般需经预处理。细菌发酵液的菌体更细小，质量比阻值更大，直接过滤十分困难，如果不用絮凝等方法预处理发酵液，往往难以采用常规过滤设备完成过滤操作。第九十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日第九十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日F、过滤速度的强化降低滤饼比阻力rB

一切能够降低rB的方法：如添加电解质、絮凝剂、凝固剂、助滤剂等。降低滤液黏度μ

黏度愈低，过滤阻力愈小。加热、去杂蛋白、絮凝、调pH、选择合适的放罐时间。第九十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日

降低悬浮液中悬浮固体的浓度过滤速度与获得滤饼体积成反比。因此应尽可能降低培养基配料浓度（如玉米粉、豆饼粉的浓度）。如在链霉素发酵液的培养基中，如以黄豆粉代替玉米浆，则质量比阻增大倍。对发酵液进行预处理，改善滤液性质第九十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日G、过滤介质选择过滤介质起过滤作用，还是滤饼的支撑物。应具有足够的机械强度和尽可能小的流动阻力。合理选择过滤介质：过滤介质所能截留的固体粒子大小：通常以过滤介质的孔径表示。常用的过滤介质中，纤维滤布所能截留的最小粒子约10μm，硅藻土为lμm，超滤膜可小于0.5μm。过滤介质的透过性：是指在一定的压力差下，单位时间单位过滤面积上通过滤液的体积量，它取决于过滤介质上毛细孔径的大小及数目。第九十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日（1）过滤介质-织物介质又称滤布，应用最广泛，包括由棉、麻等天然纤维滤布和合成纤维滤布。其过滤性能受许多因素的影响，其中最重要的是纤维的特性、编织纹法和线型。

最高温度℃密度(kg／m3)吸水率％耐磨棉尼纶涤纶92105—12014515511413816-226.5-8.30.04-0.08良优优第一百页，共一百九十八页，2022年，8月28日

滤

液澄清度阻力滤饼中含

水滤饼脱落寿命堵孔倾向平纹斜纹缎纹依次降依次降依次减依次易中长短依次易第一百零一页，共一百九十八页，2022年，8月28日（2）过滤介质-粒状介质有硅藻土、珍珠岩粉、细砂、活性炭、白土等。最常用的是硅藻土，是优良的过滤介质：①一般不与酸碱反应，化学性能稳定；②形状不规则，空隙大且多孔，具有很大的吸附表面；③无毒且不可压缩，形成的过滤层阻力不随操作压力变化。第一百零二页，共一百九十八页，2022年，8月28日

硅藻土过滤介质通常有三种用法：（1）作为深层过滤介质。硅藻土过滤层具有曲折的毛细孔道，借筛分、吸附和深层效应作用除去悬浮液中的固体粒子，截留效果可达到1μm。（2）作为预涂层。在支持介质的表面上预先形成一层较薄的硅藻土预涂层，用以保护支持介质的毛细孔道不被滤饼层中的固体粒子堵塞。（3）用作助滤剂第一百零三页，共一百九十八页，2022年，8月28日（3）过滤介质-多孔固体介质如多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料等，可加工成板状或管状，孔隙很小且耐腐蚀，常用于过滤含有少量微粒的悬浮液。第一百零四页，共一百九十八页，2022年，8月28日典型过滤设备：按操作方式分类：间歇过滤机、连续过滤机按操作压强差分类：压滤、吸滤和离心过滤实验室用抽滤装置板框压滤机（间歇操作）转筒真空过滤机（连续操作）过滤式离心机3、固液分离过滤设备第一百零五页，共一百九十八页，2022年，8月28日1）实验室用抽滤装置第一百零六页，共一百九十八页，2022年，8月28日2）板框压滤机

plateandframefilter

板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的液压或进料贮槽中的气压。广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。第一百零七页，共一百九十八页，2022年，8月28日板框压滤机包括板和框，多做成正方形，角端均开有小孔，装合压紧后即构成供滤浆或洗水流通的孔道。框的两侧覆以滤布，空框与滤布围成了容纳滤浆及滤饼的空间，滤板用以支撑滤布并提供滤液流出的通道。第一百零八页，共一百九十八页，2022年，8月28日板框式压滤机在过滤时，悬浮液由离心泵或齿轮泵经滤浆通道打入框内，滤液穿过滤框两侧滤布，沿相邻滤板沟槽流至滤液出口，固体则被截留于框内形成滤饼。滤饼充满滤框后停止过滤。框板第一百零九页，共一百九十八页，2022年，8月28日第一百一十页，共一百九十八页，2022年，8月28日第一百一十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日板框压滤机优点过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液适应性强。它最重要的特征是通过过滤介质时产生的压力降可以超过0.1MPa,这是真空过滤器无法达到的，可以用以过滤细小颗粒或液体粘度高的物料。国内广泛采用。缺点不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长（解框、卸饼、洗滤饼、滤布，重新压紧板框等）。第一百一十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日自动板框式压滤机自动板框压滤机在板框压紧；卸饼、清洗等操作中可自动完成，劳动强度小，辅助操作时间短。自动压滤机结构复杂，价格昂贵，在一定程度上限制了它的应用和发展。第一百一十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日3）真空转鼓过滤机（rotary-drumvacuumfilter）真空过滤设备以大气与真空之间的压力差作为过滤操作的推动力。生物工业中，用得较多的是转筒式真空过滤机和带式真空过滤机。第一百一十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日转筒真空过滤机是一种连续操作的过滤设备，设备的主体是一个由筛板组成能转动的水平圆筒，表面有一层金属丝网，网上覆盖滤布,圆筒内沿径向被筋板分隔成若干个空间。第一百一十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日转筒真空过滤机结构：转筒，扇形格(18格)；

滤室；分配头；动盘(18个孔，分别与扇形格的18个通道相连)；定盘(三个凹槽：滤液真空凹槽、洗水真空凹槽、压缩空气凹槽，分别将动盘的18个孔道分成三个通道)；

滤浆槽。第一百一十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日第一百一十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日转筒下部浸入滤浆槽中，浸没角约900-1300，圆筒缓慢旋转时(转速约0.5-2r／min)，筒内每一空间相继与分配头中的3个室相通，可顺序进行过滤、洗涤、吸干、吹松、卸饼等项操作。即整个圆筒分为过滤区、洗涤及脱水区，卸渣及再生区3个区域。第一百一十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日转筒真空过滤机优点：转筒真空过滤机可吸滤、洗涤、卸饼、再生连续化操作，生产能力大，劳动强度小。缺点：辅助设备多，投资大，且由于真空过滤，推动力小（不超过8×104Pa），滤饼湿度大（20％～30％）。主要适用霉菌发酵液，对菌体细小、黏度大铺助滤剂。对于滤饼阻力较大的物料适应能力较差。第一百一十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日第一百二十页，共一百九十八页，2022年，8月28日过滤机外涂有厚厚的一层硅藻土，水和酶可以渗透过去，而培养基和微生物却被黏着在硅藻土表面上。转鼓过滤机旋转的过程中，发酵液喷散开来。水和酶被吸进过滤机的中央，培养基和微生物则留在硅藻土表面，稍后用巨型刀片将硅藻土及附着其上的培养基及微生物一同去除。第一百二十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日第一百二十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日3）带式真空过滤机带式真空过滤机（是自动连续运转、并能按工艺要求进行无级调速以及操作方便和动力消耗低的一种新型高效的脱水设备。第一百二十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日带式真空过滤机流程1、进料→过滤→滤饼洗涤→吸干→卸料→滤布清洗连续进行，配有PLC控制，自动化程度高。

2、真空过滤盘分段设计，可满足不同物料过滤、洗涤、吸干的工艺要求，滤带运行速度采用变频无级调速，对不同物料有广泛的适应性。3、在同一设备上可采用多次逆流洗涤得到高浓度的滤液，也可采用并流洗涤或顺流洗涤获得高纯度的滤饼。第一百二十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日水平带式真空过滤器简图第一百二十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日第一百二十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日

水平圆盘过滤器1—分配头2—螺旋输送器3—过滤盘水平回转翻盘式真空过滤器第一百二十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日

优点：处理量大，滤饼厚度可达200mm，并可根据对物质的洗净要求进行滤饼洗涤，洗涤效果良好，操作灵活。缺点：占地面积大，有效过滤面积小，投资高。第一百二十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日结构：转鼓滤饼滤布滤网离心过滤机工作原理图转鼓(上有小孔，亦称悬框)；滤网；滤布；机架。原理：

由于离心力作用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤网及滤筐而流出。4）离心过滤机（centrifugalfilter）第一百二十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日设备主要结构过程特点适用性板框压滤机滤板/滤框/夹紧机构/机架装合过滤洗涤卸渣整理加压过滤，推动力较大结构简单，造价低；过滤面积大，能耗少；间歇操作；洗涤时间长，生产效率低。应用广泛。对原料的适应性强转鼓真空过滤机转筒(滤网、滤布)/分配头、滤浆槽过滤洗涤吹干卸渣连续化生产，自动化程度高真空过滤，推动力较小；，滤饼湿度大，设备投资高适于粒度中等，粘度不太大的物料离心过滤机转鼓(滤网、滤布)/机架过滤洗涤卸渣离心过滤，推动力最大；滤液湿度小，设备成本高，应用广泛，过滤面积小。几种过滤设备的比较第一百三十页，共一百九十八页，2022年，8月28日5）硅藻土过滤机diatomitefilter硅藻土中的硅藻有许多不同的形状，由于硅藻土具有细腻、松散、质轻、多孔、吸水和渗透性强的特性，所以它是一种性能优良的工业滤剂。硅藻土过滤是以硅藻土作为过滤介质，它是一种预涂型过滤器，预涂、过滤、反冲洗是硅藻土过滤的一般工艺过程。在酿造、饮料、酒类和水处理等方面得到广泛应用。目前，国内主要用于酒类和饮料过滤。

第一百三十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日硅藻土过滤机第一百三十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日硅藻第一百三十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日硅藻土过滤机第一百三十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日又称切向流过滤（Cross-FlowFiltration）传统过滤时过滤液体垂直于过滤介质，过滤阻力主要来之滤饼。错流过滤打破了传统过滤的机制，即液体的流向和滤膜相切。在压力推动下，悬浮液以高速在管状滤膜的内壁作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走，而附着在滤膜上的滤饼很薄，因而能在长时间内保持稳定不变的过滤速度。６）错流过滤第一百三十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日微滤过程示意图,料液快速经过薄膜,以减少形成滤饼错流过滤第一百三十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日朗极化工公司膜澄清过滤和膜浓缩的“错流过滤系统”

陶瓷膜错流过滤第一百三十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日错流过滤特点收率高（97-98%）质量好减少处理步聚染菌罐也能进行处理介质阻力大不能得到干滤饼需要大的膜面积目前适用于小分子的分离第一百三十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日（二）离心分离

离心和过滤一样，也是固液分离的一种单元操作。对于一些浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，我们可以采用过滤方法分离。而对于一些固体颗粒小、溶液粘度大的生物体系，过滤实际上是很难进行的，必须采用离心技术方能达到目的。第一百三十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。与过滤设备相比，离心设备的价格昂贵。但当固体颗粒细小而难以过滤时，离心操作往显得十分有效。1、离心分离的概念

第一百四十页，共一百九十八页，2022年，8月28日离心沉降是科学研究与生产实际中最为广泛使用的非均相分离手段，不仅适用于菌体和细胞的回收或除去，而且可用于血球、胞内细胞器、病毒以及蛋白质的分离，也广泛应用于液-液分离。对大多数生物发酵液可以离心但不能有效地过滤分离，所以离心往往是很有效的方法。第一百四十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日优点

分离速度快；分离效率高；液相澄清度好。缺点

与过滤设备相比，设备投资高；能耗大；离心产生的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同,通常情况下离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或浆体，而过滤可获得的水分含量较低的滤饼。2、离心分离的特点

第一百四十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日3、离心分离颗粒沉降速度d－颗粒直径；ρp

－颗粒密度；ρm

－液体介质密度；η－液体介质粘度；ω－旋转角速度；r－转轴中心到颗粒中心距离。

与颗粒直径有关，大颗粒容易沉降。与颗粒密度和介质密度之差(ρp-ρm)成正比。与介质粘度成反比，随介质粘度增大而减小。增大离心力（ω2r）可提高沉降速度。对沉降速度小的颗粒，提高转速是有效的方法。离心力Fc=ω2r第一百四十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日

分离因数Fr（离心力强度）：离心力与重力的比值，表示粒子在离心机中产生的离心加速度与自由下降的加速度之比;分离因数Fr是离心分离设备的一重要技术指标，是衡量离心程度的参数。在转鼓直径相同的情况下，离心分离因数越大，则转速越高，离心力也越强，反之离心分离因数越小，则转速较低，离心力也小。第一百四十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日离心力与转速rpm/minRCF径向距离（cm）第一百四十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日在科技文献中，说到离心条件时，有时用转速表示，如12000rpm；有时用离心力表示，如1000g离心力。离心力为1000g，即Fr=1000。此时的转速可由下式推导得出：

r×ω2=r×4π2N2=1000g

转速N=[1000g/（r×4π2）]1/2第一百四十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日4、沉降系数S是离心技术中一个最基本的物理量，称为沉降系数。沉降系数S：指物质在单位离心场的沉降速度，是关于蛋白质等生物大分子的一个重要参数，一般用斯维德贝格（Svedberg）单位表示，1S=10-13s。第一百四十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日

通过υg=dr／dt=Srω2的积分式，可得到溶质完全沉淀所需要的时间：在生物化学研究中，沉降系数S有两个重要用途：1）预计沉降时间R1、R2分别表示旋转轴心到样品表面和离心管底部的垂直距离。R2R1第一百四十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日

蛋白质的相对分子质量越大，沉降系数越大。因此，若已知S，就可以计算溶质的离心沉降速度。2）测定物质分子质量M：该分子不含水的相对分子重量；R：气体常数；T：绝对温度；S：分子的沉降系数；ν：分子的微分比容（当一克溶质加到一个大体积的溶液中所占有的体积）；ρ：溶剂的密度。第一百四十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日按速度和离心力：1、常速离心机最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2、高速（冷冻）离心机

1×104-2.5×104rpm，相对离心力104-105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；3、超速离心机转速2.5-8×104rpm，相对离心力5×105g；用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。5、离心机的种类与用途对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和时间，就能达到分离效果。第一百五十页，共一百九十八页，2022年，8月28日按离心机的作用方式：斜角式平抛式管式蝶式螺旋式多室第一百五十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日1）斜角式离心机是一类结构最简单的实验室常用离心机，指离心管腔与转轴成一定倾角的转子；角度越大，沉降越结实，分离效果越好，角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差。颗粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积。第一百五十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日1）斜角式离心机结构稳定，可装载较多的样品使用较高的转速。加速或减速时，对样品有搅动。有些梯度离心要求用角转头，否则形成的梯度不均一，线性很差。第一百五十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日2）平抛式离心机平抛式离心机一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般在3000-6000rpm。转子活动管套内的离心管，静止时垂直挂在转头上，旋转时随着转子转动，从垂直悬吊上升到水平位置（约200—800rpm）。颗粒在水平转子中的沉降是沿管子轴向移动。样品便于收集受振动和变速搅乱后对流现象小，但转头结构复杂，最高转速相对要低容量也小一些。

第一百五十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日平抛式离心机转子第一百五十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日３）管式离心机

（tubular-bowlcentrifuge）管式离心机具有一个细长而高速旋转的转鼓，转鼓内装有纵向平板，其下部有进料口。上部两侧有重液相和轻液相出口。第一百五十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日管式离心机待处理的物料在一定压力（3×104Pa左右）下由进料管经底部空心轴进入鼓内，靠挡板分布于鼓的四周，并使料液迅速达到与转鼓相同的角速度。转鼓带动物料高速旋转，在离心力下，悬浮液沿转鼓内壁向上流动的，料液在离心力场的作用下因其密度差的存在而分离。澄清后的液相流动到转鼓上部的排液口排出。比重大的固体微粒逐渐沉积在转鼓内壁形成沉渣层，达到一定数量后，停机人工清除。第一百五十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日

第一百五十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日管式离心机特点：结构简单，可提供较大离心力，转速高，分离因数高达15000-65000。管状离心机可以冷却，有利蛋白质分离间歇操作，须定时拆卸、清洗适用于于分离乳浊液及含细颗粒的稀悬浮液，适用于固含量低于1%，颗粒度小于5微米，黏度大的悬浮液澄清或固液两相密度差较小的分离。第一百五十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日4）碟片式离心机disk-bowlcentrifuge是在管式离心机的基础上发展起来的，在转鼓中加入了许多重迭的碟片，缩短了颗粒的沉降距离，提高了分离效率。

是生物工业中应用最为广泛的一种离心机

有一个密封的转鼓，内装十至上百个锥顶角为60~100゜锥形碟片。碟片间的距离一般为0.5-2.5mm,第一百六十页，共一百九十八页，2022年，8月28日碟片式离心机工作原理当悬浮液在动压头的作用下，经中心管流入高速旋转的碟片之间的间隙时，便产生了惯性离心力，其中密度较大的固体颗粒在离心力作用下向上层碟片的下表面运动，而后在离心力作用下被向外甩出，沿碟片下表面向转子外围下滑，而液体则由于密度小，在后续液体的推动下沿着碟片的隙道向转子中心流动，然后沿中心轴上升，从套管中排出，达到分离的目的

第一百六十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日碟片式离心机类型人工排渣的碟片离心机碟片上不开孔，只有一个清液排出口。沉积在转鼓内壁上的沉渣，间歇排出。只适用于固体颗粒含量很少的悬浮液。喷嘴排渣的碟片离心机当固体颗粒含量较多时，可采用具有喷嘴排渣的碟式离心沉降机。在有特殊形状内壁的转鼓壁上开设若干喷嘴

活门（活塞）排渣的碟片离心机这是近年来开发的机型，它和相同直径的活塞机相似，其速度可增加23%~30%，故可使分离因素达15000左右，可用于酶制剂，疫苗和胰岛素等生产中分离物的澄清。第一百六十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日碟片式离心机第一百六十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日5）螺旋式离心机scroll-typecentrifuge连续操作的沉降设备。转鼓内有可旋转的螺旋输送器，其转数比转鼓的转数稍低。有立式和卧式两种，卧螺机是一种全速旋转，连续进料、分离和卸料的离心机，最大离心力可达6000，操作温度可达300℃用于分离含固量较多的悬浮液，生产能力较大。第一百六十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日螺旋式离心机工作原理转鼓与螺旋以一定差速同向高速旋转，悬浮液通过螺旋输送器的空心轴进入机内中部，由进料管连续引入螺旋内筒，加速后进入转鼓。在离心力场作用下，固相物沉积在转鼓壁上形成沉渣层。输料螺旋将沉积的固相物连续不断定推至转鼓锥端，经排渣口排出机外，较轻的液相物则形成内层液环，由转鼓大端溢流口连续溢出转鼓，经排液口排出机外。第一百六十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日6）多室式multichambercentrifuge

多室式离心机的转鼓内有若干同心圆筒组成的环状分离室加长了被分离液体的流程，使液层减薄，增加了沉降面积，减少了沉降距离。同时还有粒度筛分的作用，悬浮液中的粗颗粒沉降到靠近内部的分离室壁上，细颗粒则沉降到靠近外部的室壁上，澄清的分离液经溢流排出。常用于抗菌素液－液萃取分离，果汁和酒类饮料的澄清等。第一百六十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日①冷冻离心机使用前先降温。②离心前一定注意平衡。③离心时盖子一定要盖好④低转速时液体不要加得太满，避免甩出腐蚀性液体伤害离心机。⑤离心设备一般价格不菲，其关键部位为轴，使用特殊的材料制成，既有刚性又有韧性，应注意保护。

使用中应注意的问题第一百六十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日6、超离心法利用物质的沉降系数、质量和形状不同，应用强大的离心力（相对离心力5*105g），将混合物中各组分分离，浓缩、提纯的方法，称为超离心法。运用超离心法已经成功分离制备各种亚细胞物质，如线粒体、微粒体、溶酶体、DNA和各种RNA。如用5*105g的强大离心力，长时间离心（17h以上），可获得具有生物活性的DNA、m-RNA、t-RNA等，为遗传工程提供了必需基础，是现代生物技术领域研究中不可缺少的实验室分析制备手段。第一百六十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日A、超离心的原理粒子在沉降场沉降的基本公式：如果粒子在离心场中作匀速直线运动，则Uw=dr/dt结合两式积分，得适用范围：不适用于非球形粒子；只适用于牛顿流体的稀溶液即在某种介质中，使一种球形粒子从液体的弯月面沉降到离心管某部（如底部）所需的时间。第一百六十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日

在某一转速时，沉降一组均匀的球形颗粒所需要的时间与它们的直径的平方以及它们的密度和悬浮介质的密度之差成反比，与介质的黏度成正比。当粒子直径d和密度ρs不同时，移动同样距离所需的时间不同，在同样的沉降时间，其沉降的位置也不同。这是超离心技术的基础。第一百七十页，共一百九十八页，2022年，8月28日B、超离心技术的分类①粒子差速离心定义：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降粒子，在不同离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。目的：以菌体细胞的收集或除去为目的，是分级离心操作的一种特殊情况，称为一级分级分离。一般用于分离沉降系数相差较大的粒子。第一百七十一页，共一百九十八页，2022年，8月28日

172细胞破碎液离心600g，10min[沉降层]细胞核(4-6μm)[上清液]细胞膜碎片线粒体(1μm)溶酶体(0.25-0.5μm)核糖体(18nm)水溶性物质离心10000g，10min[沉降层]细胞碎片线粒体溶酶体[上清液]核糖体水溶性物质离心100000g，3h[沉降层]核糖体[上清液]水溶性物质细胞破碎液的差速离心分级第一百七十二页，共一百九十八页，2022年，8月28日

缺点：每次沉降粒子不是均一的，在某离心力下除了大粒子都沉淀以外，部分中粒子及少部分小也可能沉淀下来；且数目随离心时间的延长而增加，不容易得到粒度均匀的粒子，需要将沉淀重新悬浮，洗涤，再次离心，反复数次，才有较好的效果。第一百七十三页，共一百九十八页，2022年，8月28日②一般密度梯度离心、分级区带离心离心时把混合样品铺放在一个连续的液体梯度上，然后进行离心，由于不同组份颗粒在梯度液体里沉降速率的差别，而在离心的某一时刻，使得粒子在完全沉降之前，形成了数个含单一组分颗粒的区带。利用生物组份在尺寸上的差异而形成的沉降速率不同，选择在某一特定时刻，当各个纯样品区带之间的距离拉得最远时停止离心，即可达到分离的目的。仅用于有一定沉降系数差的粒子，与粒子密度无关，因此大小相同，密度不同的粒子（如线粒体、溶酶体和过氧化物酶）不能用此法分离。用于RNA-DNA混合物及其他细胞成分的分离。第一百七十四页，共一百九十八页，2022年，8月28日③等密度梯度离心定义：当不同粒子存在密度差时，在离心力场作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）并形成区带。其结果是依样品物质密度的不同在梯度溶剂中形成一个个区带。位于等密度点上的粒子没有运动，区带的形状和位置都不受离心时间的影响，体系处于动态平衡。分离效率仅取决于粒子的密度差，与粒子的大小、形状无关。密度差越大，分离效果越好。分类：预形成梯度；自形成梯度（平衡等密度梯度）。第一百七十五页，共一百九十八页，2022年，8月28日A、预形成密度离心需要预先制备密度梯度，常用的梯度介质主要是非离子型化合物（如蔗糖、甘油等）。离心管底部到上部逐渐加液的方式形成不连续梯度溶液，也可以通过一个梯度混合器产生连续梯度密度，这个密度包括了所有需要研究的密度范围。离心时把样品铺放在梯度介质的液面上，直到粒子的漂浮密度和梯度的密度相等时，粒子才发生沉降，交排列成不同的区带。预形成密度离心的密度梯度中最大密度小于待分离的目标产物的密度。第一百七十六页，共一百九十八页，2022年，8月28日

方法：1、事先调配好的不同浓度的蔗糖溶液，依浓度由大到小逐层加入离心管中即可形成密度梯度。2、如果要制成连续的蔗糖密度梯度，则将一定浓度的蔗糖溶液高速离心一段时间即可。3、除蔗糖外，如CsCl（可用于核酸的分离）和NaBr（可用于脂蛋白的分离）等，在离心力的作用下可以自动形成密度梯度。4、等密度离心法一般适用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化。5、缺点是处理量小，仅限于实验室规模。第一百七十七页，共一百九十八页，2022年，8月28日B、自形成梯度的等密度离心（平衡等密度离心）在这种离心法中，介质的梯度不是预先配制，而是在离心过程中，由于离心力的作用而逐渐形成的。常用的梯度介质有粒子型盐类如：铯盐或铷盐和三碘化苯衍生物等。离心时把密度均一的介质溶液和样品混合后装入离心管中，通过离心自形成梯度，让粒子在梯度中形成再分配离心达到平衡后，不同密度的粒子在样度中各自分配到其等密度点的特定位置上，形成不同的区带。样品物质的密度应介于介质梯度中最大和最小密度之间，否则，样品将沉到离心管的底部或漂浮到溶液的顶层。第一百七十八页，共一百九十八页，2022年，8月28日

第一百七十九页，共一百九十八页，2022年，8月28日（1）差速离心分离法差速离心是生化工业中常用的离心分离方法，在生产和科研试验中都是最常用的。以前所学离心为一次离心，是以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心式分级离心操作的一种特殊情况，为一级分级分离。但是由于料液中菌体和细胞、各种细胞器以及其他的颗粒，其大小密度不同，离心时其沉降速度不同，所以在工业中应根据实际物料的特点、分离的目的及所分离的程度选择适当的操作条件。5.4离心分离类型第一百八十页，共一百九十八页，2022年，8月28