双杂交技术课件

Two-hybridtechniqueLinglingLUBEIJINGINSTITUTEOFBRAINDISORDERS,CAPITALMEDICALUNIVERSITYTel：E-mail:

掌握双杂交技术原理1

掌握双杂交技术的应用2

了解双杂交技术的分类及操作流程3

了解试验过程中可能遇到的问题及解决办法4教学大纲ContentsSection1PrincipleofTwo-HybridTechnique-Methodsforproteininteraction-Principleoftwohybridsystem-ClassificationoftwohybridsystemSection2ApplicationofTwo-HybridTechnique-ThegeneralstepsofTwo-Hybridsystem-ApplicationandperspectivesofTwo-HybridTechniqueWantistranscriptionalfactor?Transcriptionfactor转录因子(transcriptionfactor)是一群能与基因5`端上有特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。转录因子的特点DNA结合结构域（DNA-bindingDomain,BD）转录激活结构域（transcription-activatingdomain,AD）一般认为，如果某个蛋白是体外转录系统中起始RNA合成所必需的，它就是转录复合体的一部分。根据结构和功能的不同，可将转录因子分为两个部分：转录激活域一般由30~100氨基酸残基组成，这些结构域有富含酸性氨基酸的α-螺旋

、富含Gln和富含Pro等不同种类。一般由60~100个氨基酸残基组成的几个亚区组成。与转录因子结合的DNA区常是一段反向重复序列，因此许多转录因子常以二聚体形式与DNA结合。转录因子的DNA结合结构域有锌指和螺旋-转角-螺旋等形式Homeodomain（同源域），最早来自控制躯体发育的基因，长约60个氨基酸，其中的DNA结合区与helix-turn-helixmotif相似，人们把该DNA序列称为homeobox。主要与DNA大沟相结合。DNA结合结构域基序

碱性螺旋--环--螺旋（basichelix-loop-helix）

该调控区长约50个aa残基，同时具有DNA结合和形成蛋白质二聚体的功能，其主要特点是可形成两个亲脂性α-螺旋，两个螺旋之间由环状结构相连，其DNA结合功能是由一个较短的富碱性氨基酸区所决定的。DNA结合结构域基序GeneTranscription双杂交技术是如何设计实施的？TheTwo-HybridSystemPrincipleGAL4UASPromoterReportergeneTranscriptionactivatorismodularDNAbindingdomain(DNA结合结构域,DNA-BD)andactivationdomain(转录激活结构域,AD)DNA-BDADTranscription酵母双杂交原理

典型的真核生长转录因子都含有二个不同的结构域:DNA结合结构域和转录激活结构域。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体:a含DNA-bindingdomain的载体;b含DNA-activatingdomain的载体。1.SystembasedonGal4TheDNA-BD/proteinX(bait)bindspromoterbutcannotactivatetranscription:AD/libraryfusionproteincannotbindtothepromoteraloneandthuscannotactivatetranscription:ABInteractionbetweenthebaitandlibraryproteinsinvivoactivatestranscriptionofthereportergene:CApplicationsIdentificationofnewproteinsandelucidatesbiologicalpathwaysIdentificationofaminoacidsorproteindomainsrequiredforprotein-proteininteractionsSimpleidentificationandisolationofgenesencodingproteinsinvolvedinprotein-proteininteractionsStudyofsignaltransduction,cellgrowthanddifferentiation,geneexpression,secretionandmetabolismSystembasedonRNApolIII1997,Marsoliteretal.Reportergene：SNR6SNR6promotorwasmodifiedtohaveaGal4bingdingdomain.ThisisconvinientforGal4fusedproteintobindonSNR6promoter.Preyproteinfusedwithτ138sub-unitofTFIIICfactor，τ138sub-unitcanrecruitmentpolIIISNR6wastranscripted.ApplicationtostudytheproteinsthatthemselvesarepolIItranscriptionactivatedfactorReversetwo-hybridsystemPrinciple:constructareversereportergene.cellscannotsurvivewhenreportergenewasexpressed。Reportergene:URA3(编码乳清苷5-磷酸脱羧酶,基因产物为尿嘧啶合成所必需，但能将5-氟乳清酸转化为一种有毒物质。)Selectmedium：add5-FOAApplication：可以从大量的突变体中直接筛选出导致蛋白质间相互作用减弱或消失的突变位点Split-hybridsystemAnotherreversesystem。利用了两个相互整合的报道基因，第一个报道基因含有大肠杆菌tetR因子的编码序列，其表达受上游lexA操纵子调控；第二个报道基因是His3，启动子区含有tet操纵子序列。分别与BD和AD融合的两个蛋白质在酵母细胞核内如果发生相互作用，将激活tetR（四环素抑制蛋白）的表达，tetR和tet操纵子序列的的结合进一步影响His3基因的表达，只有不能发生相互作用的蛋白质才能用这个系统在组胺酸缺陷培养基上生长。应用：除了筛选突变株获得蛋白质结合的信息外，还可以用于发现可导致相互作用的蛋白质间解离的药物或其他小分子物质。对于治疗疾病非常有意义。SOSrecruitmentsystem-细胞质内的双杂交系统-利用RAS信号转导途径的性质。酵母细胞需要RAS信号才能生存。RAS的功能依赖于激活鸟苷酸交换因子（GEF），它把无活性GDP-RAS转变成激活的GTP-RAS。酵母中天然的GEF是CDC25，它存在温度敏感的突变体。利用人的GEFhSOS蛋白可以代替温度敏感性突变酵母的RASGEF，即CDC25，使酵母在36℃可以存活。但是hSOS蛋白必须定位到细胞膜上才能刺激酵母RAS的鸟苷酸的交换。实际应用中，一种蛋白质和hSOS蛋白融合，另一种蛋白质和Src豆蔻酰化膜定位信号融合，如果两种蛋白质发生相互作用，就会将hSOS招募到细胞膜上，从而激活RAS，使细胞在限制温度下存活和增殖。-适合分析受体与配体相互作用SOSrecruitmentsystem细胞质内的双杂交系统研究膜相关蛋白利用RAS信号转导途径的性质Thesplit-ubiquitinmembraneyeasttwo-hybridsystemprovidesanalysisofproteininteractionsatthecellmembrane.BaitproteinsarefusedwiththeC-terminusofubiquitin(Cub)andatranscriptionfactor.PotentialinteractingproteinsarethencoupledtotheN-terminusofubiquitin(Nub).Ifthebaitandpreyproteinsinteractatthemembrane,thenubiquitinisreconstituted,triggeringreleaseofthetranscriptionfactortoactivatethereportergenes.Reportergene:transcriptionfactororproteinscapableofdetectionSplit-ubiquitinsystemUSPSUbiquitin-SpecificProteasesSystem，USPS:泛素专一性蛋白酶系统泛素的功能特点，泛素有独立的N端和C端两部分构成，当分离的两部分靠近时，泛素转移性的蛋白酶就会识别泛素，导致连接在其C端的蛋白解离释放。Split-ubiquitinsystem报道基因采用转录激活因子来激活报道基因的转录或其他易被检测到信号的蛋白质。Split-ubiquitinsystemAdvantages:蛋白质相互作用水解释放报道蛋白，这样报道蛋白如果是转录因子，就更容易进入核内，活化转录。报道蛋白可以选用其他的蛋白质如酶，这样可以通过分析酶的活性来分析蛋白质之间的相互作用。OnehybridsystemIntheonehybridsystem,proteinscapableofselectivelybindingtoaspecificDNAsequencecanbeidentifiedbyscreeningalibraryofrandomcDNA-AD.Additionally,theone-hybridsystemcanbeusedtostudytheeffectsofmutations,ligands,andregulatoryproteinsonthefunctionofaparticulartranscriptionalactivation.One-hybridsystemYeastThree-HybridSystem

研究RNA或小分子配基和蛋白质的相互作用ClassificationAccordingtotheprinciple:RNA聚合酶II以RNA聚合酶III为基础的双杂交体系reversetwo-hybridsystem反向双杂交系统Split-hybridsystem分离杂交系统SOSrecruitmentsystemSOS招募系统Split-ubiquitinsystem分离的泛素系统Onehybridsystem单杂交系统Threehybridsystem三杂交系统Accordingtothevector:Conventionalyeasttwo-hybridsystemMammaliantwo-hybridsystemBacteriomatchtwo-hybridsystem酵母双杂交体系的新发展筛选载体文库接合验证1.酵母菌株的多重筛选机制

位于报告基因上游的启动子是决定报告基因表达灵敏性和特异性最重要的因素，较早的双杂交系统虽然采用了双重报告基因，如HIS3和LacZ，但它们是受同一启动子的调控，具有相同的17个碱基的BD识别序列，能激活其中之一者很有可能在另一检测中亦呈阳性。目前设计的酵母菌株往往具有不同启动子调控下的报告基因。如PJ69-4A[14]具有三个报告基因：GAL1-HIS3、GAL2-ADE2和GAL7-LacZ，GAL1、GAL2、GAL7都有可被GaL4BD识别的特异序列，且彼此之间各不相同，使三种报告基因能同时产生假阳性反应的机率明显下降。其中GAL2-ADE2，经对照实验检测为一种灵敏性、特异性均强的报告基因，清除假阳性很有效。2.表达型载体的构建也正进行着几方面的改进首先，融合蛋白被置于一些可被诱导的启动子调控之下，使蛋白质在酵母的表达量能依需要进行调控。其次，BD或AD与作用蛋白质的连接方式也不再只是BD或AD的C端与蛋白质的N端，因为蛋白质的N端和其活性也有很大关系，对于常规连接找不到作用蛋白的对象，改用N端也许能有不同的发现。双杂交体系中不同载体原来均采用氨苄抗性作为选择标志，现在可被改进成具有耐氨苄、卡那霉素或氯霉素等不同耐药基因的载体，使得原来繁琐的从酵母中提取出单一质粒的工作变得轻松快捷。3.用于双杂交筛选的文库

用于双杂交筛选的文库不但应有代表每一基因的足够丰富的多样性，而且由于蛋白质间发生作用的位点可能为蛋白质多肽链的任意位置，所以对每一基因而言，还应当提供尽可能多地与AD连接位点。

插入片段不宜过大，否则因为非特异结合所导致的假阳性也会明显增多。选用更适宜的限制性内切酶以构建适用于双杂交体系的文库是综合提高双杂交技术的一个重要方面。4.酵母接合

邻近存在的两个不同交配型的酵母配子体可能交配形成二倍体。利用这一特点，酵母接合（yeastmating）可以很方便地将两种不同的质粒转入同一酵母菌株。

目前此方法已成为酵母转化的主要替代方法，极大的提高了可以被同时检测的蛋白质数量。5.体外验证

体内进行的双杂交检测往往需要体外的其他方法来验证，为了使后续的采用其他方法再次鉴别蛋白质相互作用的步骤更易实施，有报道将双杂交筛出的基因片段插入一个带有抗原决定簇标记的质粒载体，该载体可在哺乳动物细胞中高水平表达被抗原决定簇所标记的蛋白质。用BD-X质粒和带有AD-Y插入的抗原决定簇质粒载体共转染哺乳动物细胞，即可直接进行免疫共沉淀检测。应用这一方法已证实了Bcl-XL和Bad/Bax之间的相互作用。哺乳动物双杂交系统

CheckMate™

PROMEGA

●可在所选细胞系中研究相互作用，蛋白质更可能处于其本来构型。更好地保持了诸如糖基化、磷酸化和酰基化等翻译后的修饰。●快速瞬时检测：转染后两天即可得到结果，而酵母系统则需3-4天。●稳定转染：pACT载体含有新霉素磷酸转移酶基因，可用于稳定转染的选择Mammaliantwo-hybridassaykit（k1602-1)细菌双杂交基本原理

与酵母双杂交的原理相似。通过将所要研究的蛋白质分别与DNA结合域（DBD）与活化域（AD）融合，利用相互作用蛋白质提供的桥联功能，使活化域与DNA结合域结合，从而调控报告基因的表达。报告基因表达的调控结果可通过生化或遗传学的方法检测到。

TheBacterioMatch™Two-HybridSystem

大肠杆菌双杂交系统大肠杆菌双杂交系统最初是由Karimova等于1998年提出。该检测方法是根据百日咳博代杆菌（Bordetellapertussis）中的腺苷酸环化酶（CyaA）催化的反应为基础建立的。该腺苷酸环化酶催化cAMP的合成反应，其催化结构域可以分成T18和T25两个相对独立的功能单位。将所要研究的蛋白质分别与T18和T25片断融合后，再导入大肠杆菌DHP1(cya-)菌株中，如果待检蛋白质间能够相互作用，那么T18和T25片断就可借此结合到一起，催化形成cAMP。合成的cAMP作为一个信号分子，可激活作为报告基因的乳糖或麦芽糖操纵子的表达，产生可以识别的表型变化。特点和优点

虽然酵母双杂交系统近些年来得到广泛的应用和不断的改进。但其系统本身仍然还有一些局限。然而大肠杆菌双杂交系统，在某些方面则具有了更大的优势。第一、研究周期短，操作简单。传统的酵母双杂交系统需要六天或更久才可得到结果，而大肠杆菌双杂交系统只需不到一天的时间。另外，使用大肠杆菌双杂交系统时，分离和扩增质粒都非常简单。第二，能够产生容量更大的文库。就目前的方法而言，酵母细胞的转化效率只能达到106cfu/μgDNA，而大肠杆菌细胞可达到109cfu/μgDNA。第三，更低的假阳性率和假阴性率。大肠杆菌的遗传体系有更小的基因组复杂性，与高等真核生物相比，又具有更大的进化距离。从而，避免了在研究真核生物蛋白相互作用时，由酵母内源蛋白所引起的假阳性和假阴性现象。此外，一些真核的调控蛋白有可能对酵母细胞产生毒害，而同样的情况发生在大肠杆菌中的可能性会小得多。而且，采用大肠杆菌作为筛选宿主，还能够避免传统酵母双杂交系统对于核定位的要求。第四，更好的小分子药物筛选宿主。用酵母双杂交系统进行小分子药物的筛选时，一个关键的局限因素在于药物对于酵母细胞膜的可渗透性。然而，大肠杆菌细胞对于这些小分子药物的通透性要好得多。大肠杆菌双杂交系统的发展现状到目前为止，已经建立了许多不同体系的大肠杆菌双杂交系统。根据其建立原理可分为如下几类。以λ阻遏蛋白为基础的检测系统以协同抑制为基础的检测系统以形成DNA噜噗结构为基础的检测系统以酶为基础的检测系统以RNAP为基础的检测系统1以λ阻遏蛋白为基础的检测系统

在λ噬菌体中，阻遏蛋白cI是以同型二聚体的形式发挥作用的。其每个亚基由两个功能不同的区组成，N端具有与操纵区结合的功能，C端则介导二聚体的形成。而且，一旦移除二聚体形成区就会明显降低DNA结合区与操纵区的结合力。所以，当用外源蛋白代替C端区域时，只有当其发生相互作用，才能恢复cI蛋白对DNA的结合能力。阳性克隆可通过对噬菌体感染的免疫力或报告基因得以检测。除了cI蛋白，大肠杆菌来源的转录抑制因子LexA，细菌的阿拉伯糖C基因编码的AraC等蛋白也已经用来构建这种系统。当操纵子区域与启动子区域有重叠的时候，阻遏蛋白的结合就能影响大肠杆菌RNA聚合酶RNAP与启动子的结合，从而抑制转录。利用这一原理，将两个对DNA结合结构域DBD有不同亲和力的DNA位点串联起来，并使其中对DBD亲和力较低的序列与报告基因的启动子区域重叠，这样当与DBD融合表达的蛋白之间有相互作用发生，高亲和力DBD就可借此稳定低亲和力DBD与其识别序列的结合，从而阻碍RNAP的结合，抑制报告基因的表达。Hays和Hu利用此原理构建了一个检测系统。使用的两个协同DNA区域分别是：对λ阻遏蛋白有低亲和力的λ操纵子序列和对噬菌体434阻遏蛋白有高亲和力的操纵子序列。后者位于前者上游8bp处。λ操纵子序列又与cat-lacZ报告基因操纵元的-35启动子区域存在重叠。通过将Fos和Jun蛋白分别与434阻遏蛋白和λ阻遏蛋白融合的表达，证明了该系统的有效性。2以协同抑制为基础的检测系统3以形成DNA噜噗结构为基础的检测系统Kornacker等利用DNA的噜噗结构可抑制转录的现象设计了该系统。该系统以lacZ作为报告基因，araBADpromoter为启动子。其上游含有AraC操纵子，可高效结合AraC。AraC的结合可激活lacZ的表达。下游则包含一个LexA操纵子，其位于lacZ的转录和翻译起点之间，由三个正向重复的LexA半操纵子区域组成，可低亲合力的结合LexA。在两个上下游操纵子区域之间还含有一个整合宿主因子IHF识别的IHF操纵区。当诱饵蛋白Bait与猎物蛋白Prey分别与AraC和LexA融合后，依靠其相互作用，稳定了LexA与其操纵子的结合，从而引导形成了一个DNA-loop结构，这种结构再由IHF与DNA的结合而进一步加强，从而关闭lacZ基因的表达。在含有X-gal的培养基上，通过菌落颜色就可发现阳性克隆。

4以酶为基础的检测系统早在1967年，Ullmann等就将蛋白片段的互补用于基因的结构研究。此后，这种方法用到如蛋白质的折叠、酶活性分析和分子进化等许多领域。近年来，这一方法逐渐被用到了检测蛋白的相互作用。正如前文中所提到的Karimova利用CyaA活性重建而建立的检测方法。Michnick等利用鼠二氢叶酸还原酶（mDHFR）的亚基互补特性设计了相似的检测系统。该法对菌株是否为falA（编码DHFR的基因）缺陷型并无要求，而且可以方便的研究相互作用比较强的蛋白对。5以RNAP为基础的检测系统

与真核生物的转录因子有所不同，在原核生物中，许多转录因子的结合位点都靠近启动子，并且通过直接与RNA聚合酶作用激活转录。1997年，Dove[9]又证明了在DNA结合蛋白与RNA聚合酶间任意的相互作用都可激活转录。而且，这种相互作用力越大，对基因的激活能力也越大。这些发现，导致了一种新的通过相互作用蛋白直接招募RNA聚合酶激活报告基因的检测方法。在这一方法中，bait质粒通常含有λ阻遏蛋白序列，而prey质粒常使用RNA聚合酶的α或ω亚基序列。相互作用的蛋白可通过融合表达的α或ω亚基招募RNA聚合酶的其他亚基，从而激活报告基因的表达。对于其报告基因，以前多使用lacZ基因，但Joung等于2000年报道了一种新的构建体系，其中采用了his3和aadA基因作为第一和第二报告基因。可以降低系统的假阳性率，而且便于筛选容量更大的文库。这一系统是目前大肠杆菌双杂交系统中最具优势的系统之一。ComparisonofYeastandE.coliTwo-HybridSystemsConventionalyeasttwo-hybridsystemBacterioMatchTMtwo-hybridsystemGrowthTime6daysormore<1dayandanovernightincubationTransformationefficiency106foryeast109forE.coliDNAmanipulationAdditionaltransformationrequiredintoE.coliDirectcolonyscreeningDNAisolatiomYeastchromosomalDNAco-precipitateswithplasmidUsesasimpleminiprepprocedureGeneralstepsConstructingandcharacterizingabaittransformtheselectstrainofyeastwithbaitandpreyfusedplasmidSelectinganinteractorFirstconfirmationPCR,sequencing,blastSpecificitytestingRetestbyothermeansObtainorconstructcDNAlibraryConstructabaitproteinfusionplasmid,choosereporterplasmidandyeaststrainTransformcDNAlibraryintomatingpartneryeaststrainundernotinducingconditionsFreezeandstoretransformantsdetermineplatingefficiencyofpretransformedlibraryTransformyeast;characterizetranscriptionalactivityofbaitproteintestinglacZandLeureporterCharacterizeexpressionofbaitproteinbywesternand/orrepressionassaySetupmatingInducetheexpressionoflibraryencodedproteinsandselectforinteractingproteinsCharacterizeinsertsbyPCRandrestrictionmapping,chooseindependentclonesTestforspecificitySequencetheinserts,chooseprospectiveisolatesAnalyzetheinteractorsbyothermeansStep1:chooseanappropriatereporterplasmidandyeaststrainstratagenhybridZap:conventionalyeasttwo-hybridsysteminvitrogeneCytoTrapXR:SOSsystemClontech:one-hybridsystemStratagene’sBacterioMatch®Two-HybridSystemStep2:PlasmidconstructionFigure3.Plasmidconstruction.The'bait'and'hunter'fusionproteinsareconstructedinthesamemanner.The'bait'DNAisisolatedandinsertedintoaplasmidadjacenttotheGAL4BDDNA.WhenthisDNAistranscripted,the'bait'proteinwillnowcontaintheGAL4DNA-bindingdomainaswell.The'hunter'fusionproteincontainstheGAL4AD.Figure4.Title.Theyeasttwo-hybridassayusestwoplasmidconstructs:thebaitplasmid,whichistheproteinofinterestfusedtoaGAL4bindingdomain,andthehunterplasmid,whichisthepotentialbindingpartnerfusedtoaGAL4activationdomain.MethodsforPlasmidconstructionStandSubcloningtechniqueHomologousrecombinationNote:Whendecidinghowtoconstructabait,thefollowingpointsareimportant.Theassaydependsontheabilityofthebaittoenterthenucleus,anditrequiresthebaittobeatranscriptionalnonactivator,obvioussequencesthatconferattachmenttomembranesorsequencesthataretranscritionalactivationdomainshouldberemovedfromthechosenprotein.homologousrecombinationStep3:Yeasttransformation-LiAc乙酸锂转化法:最常用，快捷，105-6转化体/ug-fermentationliquor原生质体转化法-Electroporation电转化法-Mating接合转化方法比较转化效率转化数量花费时间乙酸锂转化法高适合大规模的实验短原生质体法较高少对于大规模实验花费时间太多电转化法最高小量DNA转化数量短Highthroughputyeasttransformations.Mating(接合)在酵母的有性生殖过程中有2种接合型：a和α。这两种单倍体之间接合能形成二倍体，但同一接合型间的细胞不能形成二倍体。将“诱饵”和“猎物”质粒分别转化不同接合型的酵母细胞。过夜培养混合培养形成的二倍体，在选择性培养基上筛选发生相互作用的二倍体。目前用接合方法进行大规模双杂交的方法可以分成两种。一种是阵列筛选法，一种是文库筛选法。Matrixexperiment(阵列筛选法)用不同接合型的表达“猎物”和“诱饵”蛋白的酵母株一一接合。用这种方法可以推测已知的蛋白质间的相互作用，例如从最近测序和注释的基因组中分析全长开放阅读框架之间的成对的相互作用。虽然是一对一的方法，由于克隆方法和利用小型机械化的工作站，此方法可用于大规模的研究。Example:SHIXiaobing,WEIJiamian&SHENYungang,Usingyeasttwo-hybridsystemtodetectinteractionsofATPsynthasesubunitsfromSpinaciaoleraceaFIG.2.Schemefortwo-hybridmatrixexperiments.Detailsaredescribedinthetext.AfterselectionofdiploidsonSc2Leu,2Trp,thepatchesarereplica-platedontothethreedifferentmediaindicated.AnexampleofaSc2Leu2Trp,2Uraplateisshowninwhichoneofthe80pairwisecombinationstestedconferredatwo-hybridpositivephenotype,i.e.,growthonmedialackinguracil.Thefivecontrolsarenotshownhere.Inmatrixexperiments,weusuallyaddthecontrolsonasingleplateforcomparison.文库筛选法用一种表达“诱饵”蛋白的酵母细胞和一个表达复杂的文库“猎物”蛋白的酵母细胞直接接合。这种高通量的系统可以发现许多未知的蛋白质。然后通过激活报道基因来筛选有相互作用的蛋白质。Example:QIBing(齐兵)1QIYipeng(齐义鹏)1MasuoYutsudo2&LIUQingzhen(刘青珍),Isolationandcharacterizationofahumanapoptosisinducinggenewithyeasttwo-hybridsystemStep4:BaitcharacterizationAssayplasmidstotransform

anticipatedresultsreporterLexA-fusionx-galplatesgrowthleu-Glugal/rafGal/rafActivationtestPmw112pBaitwhite/lightbluewhite/lightbluenonegativecontrolpMW112pEG202-RaswhitewhitenoweakpositivecontrolpMW112pEG202-hsRPB7lightbluebluishnostrongpositivecontrolpMW112pSH17-4darkblueblueyesRepressiontestpJK101pBait(white)lighterbluenegativecontrolpJK101-(pGKS3*)whitebluenopositivecontrolpJK101pEG202-RaswhitelighterblueTestbywesternblotExpressiontestuseclonesfrompBaitsinglebandPositivecontrol1activationpEG202-RassinglebandPositivecontrol2assaypSH17-4singlebandDetectionofbaitproteinexpressionWhattodetectTroublesHowtodoAnimportantstepincharacterizationofabaitproteinisthedirectassayofwhetherthebaitisdetectablyexpressedandwhetherthebaitisofthecorrectsize.Inmostcases,bothoftheabovewillbetrue;however,someproteins(especiallywherethefusiondomainis60-80kDorlarger)willeitherbesynthesizedatlowlevels,orbeposttranslationallyclippedbyyeastproteases.Eitherofthesetwooutcomescanleadtoproblemsinlibraryscreens.itisusuallygoodpracticetodemonstratethatthefull-lengthbaitproteinismade.ThiscanbedonebyrunningextractsfromyeastcellsthatharbourthebaitplasmidonanSDSpolyacrylamidegel,immunoblottingwitheitheran

antibodytoLexA

orone

specifictotheproteinfusedtoLexA

,anddetectingafusionproteinoftheexpectedapparentmolecularweight.TroubleshootingandmodificationsofbaitsThebaitactivatestranscription.Thisproblemcanbeadderssedinseveralways.Oneistomakeaseriesoftruncationsoftheprotein,inanattempttoeliminatetheactivationdomain.Ifthebaitactivatestranscriptionverystrongly,thatis,aswellasthepositivecontrol,thisstepwillbenecessary.Ifthebaitactivatesmoderately,thesimplestapproachistore-dothecontrolexperimentsusinglessstringentreporterplasmidsandstrainandtoseewhetheractivationbecomesminor.Alternatively,theproteincanbetruncated,asforastrongactivator.Finally,itispossibletouseanintegratingformofbaitvector,whichwillresultinastablereductionofproteinlevels.Ifthebaitisweakactivator,oneoptionistouselessstringentreporterplasmids;alternatively,theinvestigatormaychoosetoproceedwiththetestedreagents,assumingthatasmallbackgroundoffalsepositivesmaybeidentified.Ingeneral,itisagoodideatousethemostsensitivescreeningconditionspossible;insomecases,useofverystringentinteractionstrainseliminatesdetectionofbiologicallyrelevantinteractions.

Thebaitplasmidproducesaninappropriatelevelorsizeofprotein.Iftheproteinbeingpoorlyexpressedisverylarge,itmaybesimplesttosubdivideintotwoorthreeoverlappingconstructs,eachofwhichcanbetestedindependently.Alternatively,thevectorPjk202incorporatesanuclearlocaliztionsequence,andwillincreasethegeneralconcentrationofthebaitinthenucleus,whereitisrequiredfortheassay.Suchanapproachmaymakethebestofasituationwhereaproteincannotreadilybeexpressedathigherlevels.

Veryfewtransformantscontainingthebaitplasmidexpressthebaitprotein,oryeastexpressingthebaitproteingrownoticeablymorepoorlythancontrolyeastintheabsenceofanyselection.Theseresultswouldsuggestthatthebaitproteinissomewhattoxictotheyeast.Becausetoxicitycancausedifficultiesinperforminglibraryscreening,itmaybedesirabletoreclonetheproteinofinterestintopGilda.Therearethreebasicproblemsthatcanbeidentifiedandpotentiallycorrectedbeforescreening.Table3.possiblemodificationstoenhancebaitperformanceinspecificapplicationbaitproteinresponseStronglyactivatingWeaklyactivatingNottrans-portedtothenucleus,orlowexpressionlevelContinuousexpressionoflexA-fusionistoxictoyeastbaitproteinrequiresunblockedamino-terminalendforfunctionBaitproteinexpressedathighlevels,unstable,orinteractspromiscuouslyPotentialnewproblemTruncate/modifybait+-----Itmaybenecessarytosubdividebaitintotwoorthreeoverlappingconstructs,eachofwhichmustbetestedindependently.Usemorestringentstrain/reporterombination++--+?-+?Useofverystringentinteractionstrainsmayeliminatedetectionofbiologicallyrelevantinteractions.FusetonuclearlocalizationsequencepJK202--+---putLexA-fusedproteinundergal-induciblepromoterpGilda+?--++?+?Cannolongerusegal-dependenceofreporterphenotypetoindicatecDNA-dependentinteraction.FuseLexAtothecarboxylterminusofthebaitpNLexA----+-Generally,lexApoorlytoleratesattachmentoftheamino-terminalfusiondomain;only-60%egratebait,reduceconcentrationpEG202I+?--+?+?+Reducedbaitproteinconcentrationmayleadtoreducedassaysensitivity.+wouldusuallyhelp;+?Mayheop;-willnothelp.Step5:transformingandcharacterizingthelibraryRecommendmatinginthelibraryagainstthebaitofinterestasthemostconvenientstrategy.Themainadvantageofthisapproachisthatiftheinvestigatorwishestousethesamelibrarytoscreenmultiplebaits,onlyasinglelarge-scaletransformationisrequired,followedbyrelativelyeasymatingsteps.Alternatively,withminormodifications,thisprotocolcanbeusedtodirectlytransformthelibraryintoyeastcontainingthebait,whenonlysinglebaitistobescreened.Step6:selectinganinteractor-matingthebaitstrainandpretransformedlibrary-Screenforinteractingproteins:interactorswillbeselectedbyplatingthematedcellsontoselectionmediaplates-Firstconfirmationofpositiveinteractions.-Isolationoflibraryplasmidinsert,andsecondconfirmationofpositiveinteractions:PCR,thePCRproductobtainedinthisstepwillbeusednotonlyforsequencingbutalsoforsecondconfirmationofinteraction.matingthebaitstrainandpretransformedlibraryOncethebaitstrainhasbeenmadeandcharacterizedandthelibrarystrainhasbeentransformedandfrozeninaliquots,thenextstepistomatethetwostrains.Tomatethetwostrains,thebaitstrainisgrowninliquidcultureandthenmixedwithathawedaliquotofthepretransformedlibrarystrain.ThemixtureisthenplatedonYPDandgrownovernight.Duringthistime,individualcellsofthebaitstrainfusewithindividualcellsofthelibrarystraintoformdiploidcells.Themixtrueofdiploidsandunmatedhaploidsisthencollectedandplatedonmediatoselectforinteractors.Inpractice,thediploid/haploidmixtureisgenerallyfrozeninafewaliquotstoallowtiteringandrepeatedplatingsatvariousdilutions.Itisgenerallyagoodideatomatenewbaitstrainswithacontrolstrain.Thecontrolstrainisthesamestrainusedforthelibrary,butcontainingthelibraryvectorwithnocDNAinsert.Matingwiththecontrolstraincanbeperformedatthesametimeasthelibrarymating,andbothmatingscanbetreatedidenticallyinthenextstep,selectinginteractors.ThiscontrolwillprovideaclearestimateofthefrequencyofcDNA-independentfalsepositives,afrequencythatisimportanttoknowwhendecidinghowmanypositivestopickandcharacterize.Growthebaitstrainina30mlGlu/CM-Ura-Hismasterplatewithshakingat30Ctolate-logphase(OD600=1.0-2.0)Collectthecells:1000g,5min.ResuspendcellsinsterileH2Oandtransfertoasterile1.5-mlmicrofugetube.Thawanaliquotofthepretransformedlibrarystrainatroomtemperature.Mix200ulofthebaitstrainwith-108cellsofthepretransformedlibrarystrain.Centrifugethemixtureofcells,1000g5minanddiscardthesupernatant.Resuspendthecellpelletin200ulofYPDmedium.Plateonasingle100mm-diameterYPDplateandincubatefor12-15hat30c.Add1-2mlofsterileH2OtothesurfaceoftheYPDplateandresuspendthecellswhileshakingwithsterileglassbeads.Transfertosterilecollectiontubesandvortexgentlyfor2trifugation,1000g,5min,resuspendin1volumeofsterileglycerolsolution.Distributeinto200-ulaliquotsandfreezeat-80c.matingthebaitstrainandpretransformedlibraryGeneralstepsScreenforinteractingproteinsThawonealquotofthematedyeast(orcellscontainingpBaitthatweretransformeddirectlywiththelibraryDNA)withthelibraryDNA)anddilute1:100withgal-Raff/CM-Rra,-His,-Trpdropoutmedium.Incubatewithshaking4-6hat30ctoinducethegal1promoteronthelibrary.Plate-1X106cellson100mmgal-Raff/CM-Ura,-His,-Trp–LEUdropoutplates.Incubatetheplates5daysat30c.Goodcandiatesforpositiveinteractorswillgenerllyproducecoloniesoverthistimeperiod,dependingontheindividualbaitused.Thecommonappearanceofcoloniesshouldbeat2-4daysafterplating.GeneralstepsInsomecases,nopositivesareobtainedforagivenbait.why?Thelibrarysourcewasinappropriateorthataninsufficientnumberofcolonieswerescreened.Thebaitdoesnot,infact,interactwithanysinglepartnerproteinwithsufficientaffinitytobedetected.Thebaitisnotinnativeformation,eitherbecauseofadisfavoredtruncationorbecauseofstericinteractionswiththefusiondomain,orthatthebaitisnotinteractingwellwiththelexAoperatorbecausesomemoietyonthefusionproteinisrequesteringtheprotein.Sometimesitispossibletomodifybaitandscreeningconditionstoobtaininteractors;however,somebaitssimplydonotappeartogenerateinteractors.FirstconfirmationofpositiveinteractionsThefollowingstepstestforgalactose-dependenttranscriptionalactivationofboththelexAop-Leu2andlexAop-lacZreporters.Simultaneousactivationofbothreportersinagalactose-specificmannergenerallyindicatesthetranscriptionalphenotypeisattributabletoexpressionoflibrary-encodedproteins,ratherthanderivedfrommutationoftheyeast.step7:specificitytestingThisstepistodeterminewhetherisolatedcDNAsarerepeatableandspecifictothepBaitofinterest,andtoexcludelibrary-encodedcDNAsthatinteractwithlexA(insteadofthebait),stickyproteinsthatinteractwiththepBaitinanonspecificmanner,andclonesisolatedbecauseofmutationsintheinitialSKY48strainthatrendergrowthandtranscr