GMP质量体系金黄色葡萄球菌检查法

目的：建立金黄色葡萄球菌检查的标准操作程序，规范金黄色葡萄球菌检查的操作范围：适用于金黄色葡萄球菌检查职责：检验科主管、检验员规程：1.简述金黄色葡萄球菌(Staphylcoccusaureus)为葡萄球菌属中的一种，广泛分布于自然界、空气、土壤、水及物品上，人和动物皮肤及与外界相通的腔道中，也经常有本菌存在。本菌可产生多种毒素及酶，这些毒性物质能引起局部及全身化脓性炎症，严重时可发展成为败血症和脓毒血症，是人类化脓性感染中重要的病原菌。本菌抵抗力较强，干燥情况下能生存数月，80℃30min的条件下尚能存活，5%石碳酸或0。1%升汞溶液10～15min才会被杀死。金黄色葡萄球菌检查按增菌、分离、纯培养、革兰染色镜检和血浆固酶试验等步骤进行。本法适用于外用药品及一般滴眼剂，眼膏剂的检查。2.仪器、设备及用具(见大肠杆菌检查法2)3.试液、指示液3.10。9%无菌氯化钠溶液或无菌磷酸盐缓冲液(pH7。2)［附录3.1，3.3］3.2革兰染色液［附录2.4，2.10，2.16］3.3无菌枸橼酸钠氯化钠溶液［附录2.7］3.4兔(或人)血浆取20ml玻璃注射器一只，18×180mm试管及带离心管，严密包扎，灭菌备用。以无菌操作取无菌枸橼酸钠氯化钠溶液1ml于试管中。取2Kg以上家兔(雌雄均可)一只，固定于解剖台上，剪去心脏部位的毛，用碘酒。75%乙醇消毒。采血者左手拇指触摸家兔胸骨左侧，剑突一上指，心跳最明显处，用20ml注射器垂直刺入，如有回血，表明已刺入心脏。缓缓抽取9ml注入上述试管中，与抗凝剂轻轻混匀数分钟，血液应无任何程度的凝固现象。转入10ml无菌离心管，500r/min离心5min。用灭菌吸管吸取血浆移至无菌试管中，血浆宜新鲜使用，应无溶血及纤维蛋白析出现象。血浆若不能及时使用时，置冰箱内短保存备用。临用前必须用金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］和0.9%无菌氯化钠溶液，按血浆凝固酶测定法测试无假阳性及假阴性反应方可使用。3.51%酚磺酞指示液［附录4.4］4.培养基4.1营养肉汤培养基［附录5.1］4.2营养琼脂培养基［附录5.2］4.3亚碲酸盐肉汤培养基［附录5.15］4.4卵黄氯化钠琼脂培养基［附录5.16］4.5甘露醇氯化钠脂培养基［附录5.17］4.6血琼脂培养基［附录5.13］取营养琼脂培养基100ml，加热溶化，待冷至50℃左右，无菌操作加入5～10ml无菌脱纤维兔(或人、羊)血，摇匀，制成平板，于36℃培养箱中孵育24h，无菌生长方可使用。置冰箱内保存备用。脱纤维血的制备。无菌操作抽取兔(或羊)血。取出血后，徐徐放入含有数粒玻璃珠的100ml灭菌锥形瓶中，轻轻振摇数分钟，至使纤维蛋白结于玻璃珠上，用灭菌吸管吸出脱纤维血于试管中，置冰箱内保存备用。采血及操作过程中严防污染。5.对照用菌液取金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基中，36℃±1培养18～24h，用0.9%无菌氯化钠溶液，按10倍递增稀释至1:106，对照菌加入量为50～100个(一般用量为1:1060.1ml)，同时用营养琼脂平板计数。6.操作方法6.1供试液的制备［见细菌，霉菌(酵母菌)计数5.3］6.2供试液的制备［见细菌，霉菌(酵母菌)计数6.2］含抑菌成分供试品供试液的制备(见大肠杆菌检查法6.2.4)6.3增菌培养取营养肉汤(或亚碲酸钠肉汤)培养基3瓶，每瓶100ml，2瓶分别加入10ml供试液，其中1瓶加入50～100个对照菌作为阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液(Ph7.2)作为阴性对照，置36℃±1培养18～24h(必要时可延至48h)。阴性对照应无菌生长。6.4分离培养将上述供试品增菌培养液及阳性对照增菌液轻轻摇动，以接种环沾取1～2杯培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置36℃±1培养24～72h。当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于表1所列特征，可报告为1g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌。当供试品分离平板生长菌落与表1所列特征相似的典型形态，应挑取该菌落作纯培养，对非典弄形态的菌落，可增加血琼平板分离鉴别。表1金黄色葡萄球菌在三种选择性培养基上菌落形态特征 培养基菌落形态特征卵黄氯化纳琼脂金黄色，贺形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有分解卵磷脂后产生的乳浊圈，菌落直径1～2mm甘露醇氯化纳琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有黄色环，菌落直径0.7～1mm血琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有溶解红细胞后产生的透明溶血环，菌落直径较大，2～4mm当阳性对照板未生长或生长菌落经检查不时金黄色葡萄球菌时，应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响。6.5纯培养当供试品分离平板生长菌落与表1所列菌落特征相似或疑似时，应选取2～3个以菌落，分别用接种针，轻轻沾取菌落中心表面培养物，接种于营养琼脂斜面上，于36℃±1℃培养18～24h，取其培养物作革兰染色，镜检及血浆凝固酶试验。6.6革兰染色，镜检6.6.1革兰染色见(大肠杆菌检查法6.6)6.6.2镜检金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，无芽孢，一般不产生荚膜。排列呈规则的葡萄状，亦可呈单个，成双或短链状排列。6.7血浆凝固酶试验取无菌试管(10×100mm)3支，各加入血浆；0.9%无菌氯化钠溶液(1:1)0.5ml，1支加入被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml，其余2支作对照管:1支加入金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作为阳性对照；另一支加入营养肉汤0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照。三管同时置36±1℃水浴或恒温培养箱，3h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h。检查时，轻轻将试管倾斜，(动作勿大)仔细观察，阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反应；不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。7结果判断当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验呈阳性结果，供试品培养物按下列情况报告或处理。7.1革兰阳性球菌，血浆凝固酶试验阳性反应者，报告1g或1ml供试品检出金黄色葡萄球菌。7.2革兰染色镜检不是革兰阳性球菌，或血浆凝固酶试验阴性反应，报告1g可1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌。7.3阴性对照有菌生长或阳性对照试验呈阴性结果，试验结果无效。8注意事项8.1金黄色葡萄球菌在上述三种分离培养基上的典型菌落为金黄色。但由于受药物影响或非典型菌株存在，亦可呈橙黄色，柠檬色或白色。培养基存放时间和培养时间影响色素产生，故应新鲜配制。培养时间宜48h以上。8.2如果使用干燥培养基，应按说明书配制，注意pH值是否符合规定，必要时应校正PH灭菌使用。8.3血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆(纤维蛋白常已析出)易导致假阴性反应。此外，观察结果时不要摇动试管，因凝固初期凝块易破坏，引起假阴性试验。8.4葡萄球菌属在新版Bergey手册中共收载28种，常见有金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌三种。可参照表2进行鉴定。其中又以金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的鉴别最为重要。表2种葡萄球菌的主要性状性状金黄色葡萄球菌表皮葡萄