杂交瘤细胞的保存与复苏技术介绍

杂交瘤细胞的保存与复苏技术介绍筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当，一般为5×105/鼠，可根据腹水生长情况适当增减。选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好，冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在－70℃冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种，冻存过程中需格外小心。二甲亚砜（DMSO）是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在50％～95％之间。如果低于50％，则说明冻存复苏过程有问题。当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下：1．材料

(1)细胞：取对数生长期的细胞。

(2)10％二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品，无菌）：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI—1640液。

(3)20％FCS—1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。

(4)灭菌的2ml安瓶等

2．操作方法

(1)去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640液，使细胞悬浮。

(3)1000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×107细胞／ml。

(3)取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。

(4)用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。

(5)放4℃2h。

(6)放液氮罐气态部分（-70℃）15h。

(7)转入液氮部分。杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓿冻存。细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入－70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

杂交瘤细胞的复苏

1．从液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。

2．无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液，转入组织培养瓶。

3．逐滴缓慢加入20％FCS－1640培养液3.5ml，这个过程延续3min。

4．5％CO2饱和湿度，37℃培养。

5．4h后弃去培养液上清，加入新鲜的20％FCS－1640培养液。

6．继续培养，换液，以至形成单层。细胞复苏方法将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中