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文档简介

细胞培养液的配制

培养基的选择

依据:经验、文献、尝试常用:RPMI1640、DMEM

培养基的来源

市售干粉培养基---自己配制液体培养基---直接使用(注意有效期)

培养基的除菌方法

过滤除菌:(1)正压过滤---效率高

(2)负压过滤---效率低高压蒸气灭菌:

不含谷氨酰胺，灭菌后另外添加培养基附加成分的添加

按使用说明或实验要求添加配制时加:碳酸氢钠、抗生素、血清等临用前加:生物活性因子如EGF、FGF、NGF、PDGF等

配制步骤

(1)10.4g/包培养粉溶至1L三蒸水中,磁力搅拌20min(2)加2gNaHCO3/L,继续搅拌10min(3)加青霉素100U/mL(80万U溶至4ml三蒸水,取0.5ml)

链霉素100U/mL(100万U溶至5ml三蒸水,取0.5ml))(4)加1NHCl约3mL,调pH至7.2,继续搅拌(5)按要求加血清（血清一般需经56℃，30min灭活）例如:10%胎牛血清无血清培养液900ml

灭活胎牛血清100ml(6)正压过滤除菌(气压适当,防止滤膜破裂)(7)分装,贮存于4℃，2周内用完。(8)无菌试验:取样,37℃放置24－72h,无细菌、霉菌污染方可使用注意事项

谷氨酰胺在溶液中很不稳定，４℃，７ｄ分解５０％，放置两周以上时，根据需要添加谷氨酰胺。配制１００×母液（200mmol/L,即29.22g/L）,每100ml加入0.5－2ml母液，终浓度1－4mmol/L抗生素在37℃稳定性维持3－4d,可控制轻度污染。防污染重在无菌操作

培养液配制过程

（以RPMI1640为例）(2)培养粉、NaHCO3、1NHCl、青霉素、链霉素、血清、新鲜制备的三蒸水取孔径为0.45μm和0.22μm滤膜各一张，浸入三蒸水中

将装有滤膜的滤器包装后高压蒸气消毒

3.液体配制①将培养粉倒入容器中②加入新鲜制备的三蒸水磁力搅拌器充分搅拌③按照实验的具体要求分别加入NaHCO3和青链霉素（青霉素100U/mL：80万U溶至4ml三蒸水,取0.5ml；链霉素100U/mL：100万U溶至5ml三蒸水,取0.5ml)⑤加入1NHCl约3mL,调整pH至7.2－7.4

磁力搅拌器充

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