薄层色谱及柱色谱课件

薄层色谱及柱色谱刘雪丽刘菲李喜梅钟家吉薄层色谱及柱色谱一、实验目的1、掌握色谱法的基本原理及其应用。2、掌握薄层色谱及柱色谱的操作技能。二、色谱法基本原理1.色谱法又称为层析法，是分离，纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。2.色谱法的基本原理是利用混合物各组分在两相间（流动相和固定相）的吸附或分配（溶解性能）的差异。即当混合物随流动相流经固定相时，由于固定相对各组分的吸附或溶解性能的不同，经过两相间反复多次的吸附或分配，使吸附较弱或溶解度较小的组分在固定相中移动较快，从而使各组分得到分离。3.色谱法的应用主要包括以下几个方面：（1）分离混合物（2）精致提纯化合物（3）鉴定化合物（4）跟踪反应进程

展开剂选用9:1的无水苯－乙酸乙脂偶氮苯苏丹Ⅲ有关化合物的物理性质：

四、薄层色谱1.薄层板的制备：（1）固定相的选择：吸附色谱：氧化铝、硅胶（H——不含黏合剂）分配色谱的支持剂：硅藻土、纤维素（F——含荧光物质）（G——含煅石膏2CaSO4·H2O黏合剂)

薄层板的制备点样展开显色，计算、分析四、薄层色谱（2）制板：干法和湿法取3g硅胶G与6-7mL0.5%-1%的羧甲基纤维素钠的水溶液在烧杯中调成糊状物平铺或浸渍室温晾干后，放入烘箱内加热活化通常用六中染料确定活性四、薄层色谱3.展开（2）展开操作：a.先在密闭的展开槽内倒入少量配好的展开剂，高度不能超过1cm。待其蒸气饱和，以达到平衡。（约5min）b.将点样后的薄层板放入展槽中，先不要接触展开剂，让薄层板吸附蒸气以达饱和。（约3min）c.将点样的一端放入展开剂中，垫高薄层板，始终使薄层板浸入展开剂为0.5cm，展开剂高度绝对不能浸过起始线！（展开剂若高于样品点，会使本就少量的样品溶于展开剂，难以随展开剂的展开而分离。达不到分析的目的！）d.待溶剂前沿离顶端1cm左右，就应取出薄层板，待展开剂挥干后，观察分析。绝对不能使展开剂漫过薄层板的端！（1）展开剂的选择：根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素考虑。四、薄层色谱（3）良好的分离，Rf值应在0.15-0.75之间，否则应更换展开剂重做。通常样品的极性越大，Rf值越小。（4）在一定的操作条件下，即色谱条件一定，比移值（Rf）只与组分性质有关，因此可用来鉴定化合物。（定性）但是Rf值除了决定于物质的结构外，还与吸附剂的含水量、薄层厚度，展开剂纯度、温度等外界因素有关，因此薄层色谱几乎不用于定性，常用来分析样品中的组分。五、柱色谱在色谱柱中填入表面积很大、经过活化的多孔性粉状固体吸附剂（硅胶、氧化铝）。分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂亲和力大小分别形成若干色带。再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集。吸附柱色谱的工作原理：在色谱柱中填入表面积很大、经过活化的多孔性粉状固体吸附剂（硅胶、氧化铝）。分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂亲和力大小分别形成若干色带。再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集。吸附剂的选择：常用的吸附剂：氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭吸附剂要求：

不能与被分离的物质和展开剂发生化学作用；

吸附剂的粒度大小要均匀。粒度小，表面积大，吸附能力强，分离效果好，但流速慢粒度大，表面积小，吸附能力弱，分离效果差，但流速快。酸性（分离酸性物质，如有机酸类化合物）

中性（分离中性物质，如醛、酮、醌和酯类化合物）

碱性（分离碱性物质，如碳氢化合物、生物碱、胺等）本实验吸附剂：中性氧化铝（150目）氧化铝对各种化合物的吸附性大小：酸碱醇胺硫酸酯醛酮芳香族化合物卤代物醚烯饱和烃1.装柱：是柱色谱最关键的操作，装柱的好坏直接影响分离效果。（1）装柱前，应先将玻璃柱洗净，干燥，垂直固定在铁架台上。在柱底铺一小块脱脂棉，再铺约0.5cm厚的石英砂，然后进行装柱。有湿法和湿法两种方式，湿法装柱效果更好。五、柱色谱（2）湿法装柱：将固定相（如硅胶）用洗脱剂调成糊状，在柱内先加入约3/4柱高的洗脱剂，再将糊状物边震荡边倒入柱中，同时，打开下旋塞，用一干净干燥的烧杯接收洗脱剂。待糊状物全部装完后，用接收到的洗脱剂转移残留的固定相，并将柱壁上的固定相淋洗下去。装柱过程中，应不断轻敲色谱柱，以使固定相填充均匀、无气泡！整个装柱过程中，柱内洗脱剂的高度始终不能低于固定相最上端，否则柱内会出现裂痕和气泡！五、柱色谱2.展开及洗脱：将样品溶解在最少量的洗脱剂中。滴加前，打开下旋塞使洗脱剂流出，恰好下降到固定相表面时，关闭旋塞，开将样品迅速全部滴加于柱顶端后，用一事先戳孔的圆形滤盖住样品表面，以防加洗脱剂时搅动柱顶表面。样品加完后，打开下旋塞，再立即加入洗脱剂进行洗脱。色谱带的展开过程就是样品的分离过程，可按颜色段收集各组分。五、柱色谱洗脱过程中的注意事项：1.洗脱剂应连续平稳地加入，不能中断。2.洗脱剂流出速度应控制在每分钟5-10滴。下移速度太快，分离效好，太慢，会造成色谱扩散或成分破坏，影响分离效果注：色谱柱装的好坏，将严重影响分离效果。得色谱柱，不得使吸附剂有裂缝和气泡，且不得使液面低于吸附剂或砂层表面。3.吸附剂上部再填装0.5cm厚的石英砂是什么目的？石英砂的作用就是为了整理吸附剂表面，使其成为平面，达到较好的洗脱效果。4.解释为什麽荧光黄比亚甲基蓝更易被氧化铝吸附？荧光黄是极性化合物，它与氧化铝有三种相互作用力存在：一是荧光黄的羧基与氧化铝成盐；二是羟基能与氧化铝形成氢键；三是羰基的极性与氧化铝的极