酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用-课件

第四节酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用其应用主要包括以下几个方面：药物含量（活性）测定宿主蛋白残留检测抗生素残留检测杂质检测污染物检测药物原材料检测药物掺假检测1大家好第四节酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用其应用主要包括以一、GLP-1活性检测CyclicAdenosineMonophosphate(cAMP)ELISAKit2大家好一、GLP-1活性检测CyclicAdenosineMoGLP-1GLP-1是已发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素，它通过与GLP-1受体(GLP-1R)结合发挥作用1）GLP-1可通过刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃排空来降低血糖2）GLP-1还有减缓β细胞凋亡，促进其再生的独特作用3）GLP-1还能减慢胃排空速度，通过作用下丘脑，抑制食欲。3大家好GLP-1GLP-1是已发现的促胰岛素分GLP-1结合GLP-1R后，激活细胞膜内环腺苷酸(cAMP)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路胰岛成熟β细胞的GLP-1受体偶联Gs，活化腺苷酰环化酶，产生cAMP，后者与葡萄糖协同刺激胰岛素合成和分泌，刺激胰岛素基因转录和胰岛素原生物合成，可降低胰高血糖素浓度并抑制胰高血糖素分泌，增强细胞对胰岛素的敏感性，刺激胰岛素依赖性糖原合成，降低餐后血糖浓度。4大家好GLP-1结合GLP-1R后，激活细胞膜内环腺苷酸(cAMP3535LigandLigandsACsGTPATPcAMPPKACa2+NFAT-PNFATCalcineurinCREB-PNFAT-RECREF-LuciferseR-LuciferseGLP-1Receptor3535报告基因检测原理5大家好3535LigandLigandsACsATPcAM试验原理采用直接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被cAMP特异性抗体，样品中cAMP将和标准HRP-cAMP竞争结合微孔条上cAMP特异性抗体，用TMB底物显色，吸光值与样品中cAMP的含量成负相关。以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归拟合对照品和供试品的量效曲线，得出半效量浓度，求得供试品相对生物活性。6大家好试验原理采用直接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被c操作程序：1、取微孔板条，加入cAMP特异性抗体，50ul/孔，室温1h;2、洗涤后，向不同孔中分别cAMP、对照或细胞裂解上清品（样品），100ul/孔；3、向孔中加入HRP-cAMP，50ul/孔，室温作用2h；4、洗涤后，向孔中加入TMB溶液，200ul/孔，室温作用30min；5、向孔中加入终止液，100ul/孔，测定OD450nm/570nm7大家好操作程序：1、取微孔板条，加入cAMP特异性抗体，50ul/数据与结果1.标准曲线的绘制：（1）测定各浓度梯度下各孔对照品和供试品相应的吸光值，并分别计算平均值；（2）以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归拟合对照品和供试品的量效曲线，得出半效量浓度；对照品EC50；测试样EC502.数据处理：

供试品相对生物活性（%）=对照品EC50/供试品EC50100%

其中：对照品和供试品的EC50分别表示对照品和测试样的半效量的浓度。四参数方程中的C值即相当于半效量的浓度(EC50)。8大家好数据与结果1.标准曲线的绘制：8大家好典型的测定结果及回归曲线9大家好典型的测定结果及回归曲线9大家好10大家好10大家好二、宿主蛋白（HCP）残留检测Cygnus

F550

CHO

HCP

ELISA

Kit11大家好二、宿主蛋白（HCP）残留检测Cygnus

F550

CH宿主细胞蛋白污染物CHO宿主蛋白残留

E-coli宿主蛋白残留

酵母菌宿主蛋白残留

HEK293宿主蛋白残留12大家好宿主细胞蛋白污染物CHO宿主蛋白残留12大家好2D分离CHO、酵母、大肠杆菌等细胞系的全蛋白谱将2DGel上的全蛋白转移至膜上，用多克隆抗体孵育后进行WesternBlot化学发光检测，以确认多克隆抗体能够与哪些宿主细胞蛋白结合通过WesternBlot检测结果（多抗能检测到的HCP数量）与2D膜上检测结果（总HCP数量）的比较，得出用于评价检测的多克隆抗体特异性及适用性的MatchRate评估HCP定量用多克隆抗体的特异性13大家好2D分离CHO、酵母、大肠杆菌等细胞系的全蛋白谱评估HCP定14大家好14大家好试验原理采用双位点酶联免疫检测法，在酶标板微孔条上预包被抗CHOCHP多抗，免疫反应构成为夹层式结构：固相抗体-HCP-酶标记抗体。反应结束后清洗酶标板去除未结合反应物，添加TMB底物显色，吸光值与样品中CHO宿主蛋白的含量成正相关。15大家好试验原理采用双位点酶联免疫检测法，在酶标板微孔条上预包被抗C检测步骤：（1）于每个反应孔中，加入100μL抗CHOHCP多抗-HRP；（2）从标准蛋白液、对照和样品中吸取50μL上清加入到已标记好的反应孔中；180rpm下室温、振荡培养2h；（3）弃去孔内溶液，每孔加350μL洗涤液，重复洗涤4次；（4）

于每个反应孔中，加入100μLTMB底物溶液，于室温孵育30min；（5

）于每个反应孔中，加入100μL终止液；依序读取OD450/650nm吸收值(空白对照孔调零)。（6）数据处理：根据测定每孔标准液吸光值绘制四参数逻辑曲线，然后根据样品吸光值计算出样品中HCP浓度。16大家好检测步骤：（1）于每个反应孔中，加入100μL抗CHOH17大家好17大家好18大家好18大家好19大家好19大家好20大家好20大家好21大家好21大家好ELISA法研究药物作用靶点（GPⅡb/Ⅲa受体）实验原理根据ELISA实验原理，先在96孔板上包被纤维蛋白原，然后同时加入GPIIb/IIIa受体和待测样品，再加酶标抗体与GPIIb/IIIa受体结合，最后加入底物，酶作用于底物显色，在405nm测得OD值，OD值与GPIIb/IIIa受体量成正比。如果样品与GPIIb/IIIa受体结合，就会降低纤维蛋白原与受体的结合，导致所测的OD值降低。22大家好ELISA法研究药物作用靶点（GPⅡb/Ⅲa受体）实验原理2实验步骤：首先将纤维蛋白原（10μg/ml）用bufferA（0.1MNa2CO3,PH9.5）包被于96孔板上（100μl/well）（空白对照:不包被纤维蛋白原），4°C孵育过夜；TACTS（0.02MTris-HCl,PH7.5，0.15MNaCl，1mMCaCl2,0.02%NaN3,0.05%Tween20）冲洗一次，每孔200μl，3min；用含1%BSA的TACTS在37°C封闭1h（200μl/well）,TACTS洗三次；整合素αIIbβ3（20μg/ml、50μL/well）加一定浓度的待测样品50μl作为样品组；加孵育液做阴性对照组；37°C下孵育2h；TACTS洗三次；加一抗（鼠抗人CD61抗体，含0.5%BSA,TACTS稀释，1:2000(体积比)，100μL/孔）37°C下孵育1h；23大家好实验步骤：23大家好TACTS洗三次；加二抗（碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG，含0.5%BSA,TACTS稀释，1:1000，100μL/孔），37°C下孵育1h；TACTS洗三次，加底物（对硝基苯磷酸二钠溶液(PNPP)1mg/ml，用bufferB溶解，200μL/well），37℃下孵育30min；加入50μL3MNaOH(称0.6g加5ml蒸馏水)终止反应；5min内405nm波长下检测吸光度。24大家好TACTS洗三次；加二抗（碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG，数据处理通过以下公式计算抑制率：[(X−Y)/(X-Z)]×100%。X代表生理盐水组OD值；Y代表样品组OD值；Z代表空白对照组OD值。实验结果都用均数±标准差（

±s）表示，采用t检验进行单因素方差分析。p<0.05界定为具有统计学意义，所有数据处理均使用GraphPadPrism6软件(GraphPadSoftware，美国)。25大家好数据处理25大家好溶液配制及注意事项（60well大概用量）1.bufferA：0.1MNa2CO350ml：取固体0.53g溶液50ml蒸馏水中，调PH9.5.2.TACTS洗脱液（需300ml）：定容100ml，pH7.5，Tris-HCl：0.2423g；NaCl：0.8766g；NaN3：200μL；Tween20:50μL；CaCl2:0.0222g。孵育液（50ml）：TACTS加0.5%BSA封闭液（20ml）：TACTS加1%BSA3.受体αⅡbβ3（4ml）：配制1.63mg/ml母液,受体使用的终浓度为20μg/ml。4.一抗（8ml）：1:2000；二抗（8ml）：1:10005.样品配制：不溶的样品加DMSO全溶，终浓度不超0.5%6.受体，抗体，样品均用孵育液稀释。26大家好溶液配制及注意事项（60well大概用量）26大家好7.bufferB（底物缓冲液）：定容100ml，PH9.5,二乙醇胺：105μl；MgCl2：10.175mg8.PNPP对光敏感，现配现用，用bufferB溶解9.配制的纤维蛋白原浓度越高储存越稳定，37℃水浴锅加热包被液溶解，储存Fg>1mg/ml时较稳定。27大家好7.bufferB（底物缓冲液）：定容100ml，PH三、卡那霉素残留检测卡那霉素检测试剂盒28大家好三、卡那霉素残留检测卡那霉素检测试剂盒28大家好2015年版药典凡例十六：（3）生产过程中，应尽可能避免使用抗生素，必须使用时，应选择安全性风险相对较低抗生素，使用抗生素种类不得超过1种，且产品后继工艺应保证可有效去除制品中抗生素，去除工艺应该验证。（4）生产过程中使用抗生素时，成品鉴定中应检测抗生素残留量，并规定残留量限制。上述的生产过程包括种子培养活化，发酵，纯化等所有的步骤，所以种子活化阶段是算在生产过程中的。29大家好2015年版药典凡例十六：（3）生产过程中，应尽可能避免使用试验原理采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的卡那霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与残留物卡那霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中卡那霉素的含量。30大家好试验原理采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。31大家好操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20-255、加标准品/样本：加入标准品/样本20ml到对应的微孔中，加入酶标二抗50ml/孔，再加入抗体工作液80ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应40min。6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250ml/孔，充分洗涤4－5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。7、显色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中避光反应15min。8、测定：加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。32大家好5、加标准品/样本：加入标准品/样本20ml到对应的微孔中定量分析（1）百分吸光率的计算

标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值（%）＝B/B0×100%B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值（2）标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以卡那霉素标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中卡那霉素实际残留量。33大家好定量分析（1）百分吸光率的计算33大家好卡那霉素测定方法验证检测方法和标准曲线竞争ELISA法测定药盒卡那霉素标准品34大家好卡那霉素测定方法验证检测方法和标准曲线竞争ELISA法测定卡那霉素在样品溶液中的回收率卡那霉素在样品稀释液中的回收率(n=6)35大家好卡那霉素在样品溶液中的回收率卡那霉素在样品稀释液中的回收率(精密度试验卡那霉素稀释样本竞争ELISA法分析精密度试验结果(n=6)36大家好精密度试验卡那霉素稀释样本竞争ELISA法分析精密度试验结果四、人胰岛素原残留检测MercodiaProinsulinELISAkit37大家好四、人胰岛素原残留检测MercodiaProinsulin目前重组人胰岛素生产主要以E.coli表达人胰岛素原，初步纯化后变复性，经胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptidaseB)协同酶切，去掉前导肽和C-肽，形成有活性的胰岛素，并进一步纯化精制而成。上述工艺制备所得人胰岛素产品中可能残留人胰岛素原、C-肽等人胰岛素相关杂质，其残留的存在可能影响人胰岛素的药效。38大家好目前重组人胰岛素生产主要以E.coli表达人胰岛素原，初步纯Insulinconversionformationprocessandstructurediagram39大家好Insulinconversionformation试验原理采用双单抗夹心ELISA法，在酶标板微孔条上预包被抗胰岛素原C-肽特异性抗体，样品中胰岛素原结合微孔条上的特异性抗体，然后加入HRP标记的抗胰岛素特异性抗体，用TMB底物显色，吸光值与样品中胰岛素原的含量成正相关。40大家好试验原理采用双单抗夹心ELISA法，在酶标板微孔条上预包被抗操作步骤1、加样：加待检样品，100μl/孔，37℃2h，同上洗涤；2、加酶标抗体：酶标抗体稀释液稀释HRP-13A4至工作浓度，100μl/孔，37℃1h，同上洗涤；3、显色和中止反应：加新鲜配制的底物100μl/孔，37℃避光作用20min；加中止液50μl/孔终止反应，测定每孔OD450/630nm值。4、数据处理：以标准品浓度的对数log(c)对吸光值log(y)回归，可求得样品中人胰岛素原的残留量。41大家好操作步骤1、加样：加待检样品，100μl/孔，37℃2StandardcurveforrhPIinPBSwasdeterminedbytheimmunocaptureassay(n=5).42大家好StandardcurveforrhPIinP思考题1.抗原与抗体的属性，抗原与抗体反应的特点以及衡量抗体质量的指标？2.酶联免疫吸附试验（ELISA）的基本原理及技术要点、主要方法类型及其反应原理和适用范围?3.过碘酸盐氧化法与戊二醛偶联法制备酶偶联物的原理及各自优缺点?4.试述宿主蛋白（HCP）残留检测基本指导思想和试验原理？

43大家好思考题1.抗原与抗体的属性，抗原与抗体反应的特点以及衡量抗体谢谢44大家好谢谢44大家好第四节酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用其应用主要包括以下几个方面：药物含量（活性）测定宿主蛋白残留检测抗生素残留检测杂质检测污染物检测药物原材料检测药物掺假检测45大家好第四节酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用其应用主要包括以一、GLP-1活性检测CyclicAdenosineMonophosphate(cAMP)ELISAKit46大家好一、GLP-1活性检测CyclicAdenosineMoGLP-1GLP-1是已发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素，它通过与GLP-1受体(GLP-1R)结合发挥作用1）GLP-1可通过刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃排空来降低血糖2）GLP-1还有减缓β细胞凋亡，促进其再生的独特作用3）GLP-1还能减慢胃排空速度，通过作用下丘脑，抑制食欲。47大家好GLP-1GLP-1是已发现的促胰岛素分GLP-1结合GLP-1R后，激活细胞膜内环腺苷酸(cAMP)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路胰岛成熟β细胞的GLP-1受体偶联Gs，活化腺苷酰环化酶，产生cAMP，后者与葡萄糖协同刺激胰岛素合成和分泌，刺激胰岛素基因转录和胰岛素原生物合成，可降低胰高血糖素浓度并抑制胰高血糖素分泌，增强细胞对胰岛素的敏感性，刺激胰岛素依赖性糖原合成，降低餐后血糖浓度。48大家好GLP-1结合GLP-1R后，激活细胞膜内环腺苷酸(cAMP3535LigandLigandsACsGTPATPcAMPPKACa2+NFAT-PNFATCalcineurinCREB-PNFAT-RECREF-LuciferseR-LuciferseGLP-1Receptor3535报告基因检测原理49大家好3535LigandLigandsACsATPcAM试验原理采用直接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被cAMP特异性抗体，样品中cAMP将和标准HRP-cAMP竞争结合微孔条上cAMP特异性抗体，用TMB底物显色，吸光值与样品中cAMP的含量成负相关。以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归拟合对照品和供试品的量效曲线，得出半效量浓度，求得供试品相对生物活性。50大家好试验原理采用直接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被c操作程序：1、取微孔板条，加入cAMP特异性抗体，50ul/孔，室温1h;2、洗涤后，向不同孔中分别cAMP、对照或细胞裂解上清品（样品），100ul/孔；3、向孔中加入HRP-cAMP，50ul/孔，室温作用2h；4、洗涤后，向孔中加入TMB溶液，200ul/孔，室温作用30min；5、向孔中加入终止液，100ul/孔，测定OD450nm/570nm51大家好操作程序：1、取微孔板条，加入cAMP特异性抗体，50ul/数据与结果1.标准曲线的绘制：（1）测定各浓度梯度下各孔对照品和供试品相应的吸光值，并分别计算平均值；（2）以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归拟合对照品和供试品的量效曲线，得出半效量浓度；对照品EC50；测试样EC502.数据处理：

供试品相对生物活性（%）=对照品EC50/供试品EC50100%

其中：对照品和供试品的EC50分别表示对照品和测试样的半效量的浓度。四参数方程中的C值即相当于半效量的浓度(EC50)。52大家好数据与结果1.标准曲线的绘制：8大家好典型的测定结果及回归曲线53大家好典型的测定结果及回归曲线9大家好54大家好10大家好二、宿主蛋白（HCP）残留检测Cygnus

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CHO

HCP

ELISA

Kit55大家好二、宿主蛋白（HCP）残留检测Cygnus

F550

CH宿主细胞蛋白污染物CHO宿主蛋白残留

E-coli宿主蛋白残留

酵母菌宿主蛋白残留

HEK293宿主蛋白残留56大家好宿主细胞蛋白污染物CHO宿主蛋白残留12大家好2D分离CHO、酵母、大肠杆菌等细胞系的全蛋白谱将2DGel上的全蛋白转移至膜上，用多克隆抗体孵育后进行WesternBlot化学发光检测，以确认多克隆抗体能够与哪些宿主细胞蛋白结合通过WesternBlot检测结果（多抗能检测到的HCP数量）与2D膜上检测结果（总HCP数量）的比较，得出用于评价检测的多克隆抗体特异性及适用性的MatchRate评估HCP定量用多克隆抗体的特异性57大家好2D分离CHO、酵母、大肠杆菌等细胞系的全蛋白谱评估HCP定58大家好14大家好试验原理采用双位点酶联免疫检测法，在酶标板微孔条上预包被抗CHOCHP多抗，免疫反应构成为夹层式结构：固相抗体-HCP-酶标记抗体。反应结束后清洗酶标板去除未结合反应物，添加TMB底物显色，吸光值与样品中CHO宿主蛋白的含量成正相关。59大家好试验原理采用双位点酶联免疫检测法，在酶标板微孔条上预包被抗C检测步骤：（1）于每个反应孔中，加入100μL抗CHOHCP多抗-HRP；（2）从标准蛋白液、对照和样品中吸取50μL上清加入到已标记好的反应孔中；180rpm下室温、振荡培养2h；（3）弃去孔内溶液，每孔加350μL洗涤液，重复洗涤4次；（4）

于每个反应孔中，加入100μLTMB底物溶液，于室温孵育30min；（5

）于每个反应孔中，加入100μL终止液；依序读取OD450/650nm吸收值(空白对照孔调零)。（6）数据处理：根据测定每孔标准液吸光值绘制四参数逻辑曲线，然后根据样品吸光值计算出样品中HCP浓度。60大家好检测步骤：（1）于每个反应孔中，加入100μL抗CHOH61大家好17大家好62大家好18大家好63大家好19大家好64大家好20大家好65大家好21大家好ELISA法研究药物作用靶点（GPⅡb/Ⅲa受体）实验原理根据ELISA实验原理，先在96孔板上包被纤维蛋白原，然后同时加入GPIIb/IIIa受体和待测样品，再加酶标抗体与GPIIb/IIIa受体结合，最后加入底物，酶作用于底物显色，在405nm测得OD值，OD值与GPIIb/IIIa受体量成正比。如果样品与GPIIb/IIIa受体结合，就会降低纤维蛋白原与受体的结合，导致所测的OD值降低。66大家好ELISA法研究药物作用靶点（GPⅡb/Ⅲa受体）实验原理2实验步骤：首先将纤维蛋白原（10μg/ml）用bufferA（0.1MNa2CO3,PH9.5）包被于96孔板上（100μl/well）（空白对照:不包被纤维蛋白原），4°C孵育过夜；TACTS（0.02MTris-HCl,PH7.5，0.15MNaCl，1mMCaCl2,0.02%NaN3,0.05%Tween20）冲洗一次，每孔200μl，3min；用含1%BSA的TACTS在37°C封闭1h（200μl/well）,TACTS洗三次；整合素αIIbβ3（20μg/ml、50μL/well）加一定浓度的待测样品50μl作为样品组；加孵育液做阴性对照组；37°C下孵育2h；TACTS洗三次；加一抗（鼠抗人CD61抗体，含0.5%BSA,TACTS稀释，1:2000(体积比)，100μL/孔）37°C下孵育1h；67大家好实验步骤：23大家好TACTS洗三次；加二抗（碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG，含0.5%BSA,TACTS稀释，1:1000，100μL/孔），37°C下孵育1h；TACTS洗三次，加底物（对硝基苯磷酸二钠溶液(PNPP)1mg/ml，用bufferB溶解，200μL/well），37℃下孵育30min；加入50μL3MNaOH(称0.6g加5ml蒸馏水)终止反应；5min内405nm波长下检测吸光度。68大家好TACTS洗三次；加二抗（碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG，数据处理通过以下公式计算抑制率：[(X−Y)/(X-Z)]×100%。X代表生理盐水组OD值；Y代表样品组OD值；Z代表空白对照组OD值。实验结果都用均数±标准差（

±s）表示，采用t检验进行单因素方差分析。p<0.05界定为具有统计学意义，所有数据处理均使用GraphPadPrism6软件(GraphPadSoftware，美国)。69大家好数据处理25大家好溶液配制及注意事项（60well大概用量）1.bufferA：0.1MNa2CO350ml：取固体0.53g溶液50ml蒸馏水中，调PH9.5.2.TACTS洗脱液（需300ml）：定容100ml，pH7.5，Tris-HCl：0.2423g；NaCl：0.8766g；NaN3：200μL；Tween20:50μL；CaCl2:0.0222g。孵育液（50ml）：TACTS加0.5%BSA封闭液（20ml）：TACTS加1%BSA3.受体αⅡbβ3（4ml）：配制1.63mg/ml母液,受体使用的终浓度为20μg/ml。4.一抗（8ml）：1:2000；二抗（8ml）：1:10005.样品配制：不溶的样品加DMSO全溶，终浓度不超0.5%6.受体，抗体，样品均用孵育液稀释。70大家好溶液配制及注意事项（60well大概用量）26大家好7.bufferB（底物缓冲液）：定容100ml，PH9.5,二乙醇胺：105μl；MgCl2：10.175mg8.PNPP对光敏感，现配现用，用bufferB溶解9.配制的纤维蛋白原浓度越高储存越稳定，37℃水浴锅加热包被液溶解，储存Fg>1mg/ml时较稳定。71大家好7.bufferB（底物缓冲液）：定容100ml，PH三、卡那霉素残留检测卡那霉素检测试剂盒72大家好三、卡那霉素残留检测卡那霉素检测试剂盒28大家好2015年版药典凡例十六：（3）生产过程中，应尽可能避免使用抗生素，必须使用时，应选择安全性风险相对较低抗生素，使用抗生素种类不得超过1种，且产品后继工艺应保证可有效去除制品中抗生素，去除工艺应该验证。（4）生产过程中使用抗生素时，成品鉴定中应检测抗生素残留量，并规定残留量限制。上述的生产过程包括种子培养活化，发酵，纯化等所有的步骤，所以种子活化阶段是算在生产过程中的。73大家好2015年版药典凡例十六：（3）生产过程中，应尽可能避免使用试验原理采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的卡那霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与残留物卡那霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中卡那霉素的含量。74大家好试验原理采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。75大家好操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20-255、加标准品/样本：加入标准品/样本20ml到对应的微孔中，加入酶标二抗50ml/孔，再加入抗体工作液80ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应40min。6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250ml/孔，充分洗涤4－5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。7、显色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中避光反应15min。8、测定：加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。76大家好5、加标准品/样本：加入标准品/样本20ml到对应的微孔中定量分析（1）百分吸光率的计算

标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值（%）＝B/B0×100%B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值（2）标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以卡那霉素标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将