Exp重组质粒的酶切

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一、实验目的学习和掌握重组质粒的少量酶切、电泳及分析插入DNA片段的大小

二、实验原理EcoRI&PstI

BamHI单切器具和材料1.5mlEP管,移液器及枪头(10、50l)恒温水浴、电泳仪、电泳槽重组质粒pMD18-T三、实验器具、药品试剂限制酶:BamHI、EcoRI和PstI酶切buffer:10K、10HDNAmarker:-HindⅢ琼脂糖,1TAE,

上样buffer1.酶切反应步骤

ddH2O于EP管→10buffer→质粒DNA→限制酶→混匀,离心5s→37℃,50→65℃水浴10

四、实验步骤(1)单酶切反应BamHI(15U/l)组/4人;30℃,50

成分ddH2O10KBufferDNABamHITotal需量(l)7.52100.520(2)双酶切反应成分ddH2O10HBufferDNAEcoRIPstI需量(l)7.52100.250.25EcoRI&PstI(15U/l)组/4人;37℃,50

2.凝胶电泳检测

0.8%Aga,30mlTAE,煮沸冷却至55℃,2lEtBr倒胶,插梳子,凝固202l上样液+样品100V电泳,观察酶切失败的可能原因

不全切或基本未切缓冲体系不合适酶量过多样品杂质含量高DNA被降解痕量DNase注意事项①吸量要准确②最后加酶③冰

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