HY∕T 147.5-2013 海洋监测技术规程 第5部分：海洋生态

学兔兔学兔兔标准下载HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013学兔兔学兔兔标准下载中华人民共和国海洋行业标准HY/T147.5—2013海洋监测技术规程

第5部分:海洋生态Codeofpracticeformarinemonitoringtechnology一

Part5：Marineecology2013-04-25发布国家海洋局2013-05-01实施2013-04-25发布国家海洋局TOC\o"1-5"\h\zHUW V1酬 12规范性引用文件 13术语和定义 14浮游病毒总数——染色计数法 25沉积物中病毒总数——染色计数法 46弧菌总数——平板计数法 67肠球菌——最大可能数法(MPN)和滤膜法 68粪大肠菌群——测试片法 69分级叶绿素a——荧光法 1110分级初级生产力——“C同位素法 1511赤潮甲藻孢囊——光学显微镜法 1812微微型浮游植物——荧光显微镜计数法 1813微型浮游生物——显微镜个体计数法 2014小型浮游生物——显微镜个体计数法 2415鱼类浮游生物——体视显微镜计数法 2416珍稀濒危动物调査——调访观测法 2717滨海湿地植物——野外勘查法 3018腹泻性贝毒一酶联免疫吸附试验法(ELISA) 3319麻痹性贝毒——酶联免疫吸附试验法(ELISA) 3320麻痹性贝毒——髙效液相法(HPLC) 3321记忆缺失性贝毒——酶联免疫吸附试验法(ELISA) 3622神经性贝毒——酶联免疫吸附试验法(ELISA) 3623金黄色葡萄球菌——测试片法 3624沙门氏菌一微孔板试剂盒法 3925李斯特菌——测试片法 4226真菌 测试片法 4527海水中副溶血弧菌——聚合酶链式反应(PCR)法 4728海水中创伤弧菌——聚合酶链式反应(PCR)法 4929海水中河流弧菌——聚合酶链式反应(PCR)法 5030海水中溶藻弧菌——聚合酶链式反应(PCR)法 5131海水中哈氏弧菌一聚合酶链式反应(PCR)法 5232海水中霍乱弧菌——聚合酶链式反应(PCR)法 53HY/T147.5—2013TOC\o"1-5"\h\z33海水中鰻弧菌——聚合酶链式反应(PCR)法 5434海水中甲肝病毒——反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法 5535海水中诺如病毒——反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法 5536海水中星状病毒——反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法 5537海水中轮状病毒——反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法 5738海水中腺病毒——聚合酶链式反应(PCR)法 5839海水中肠道病毒一反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法 5940虾类桃拉病毒——反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法 6041虾类白斑综合征病毒——聚合酶链式反应(PCR)法 6042鱼类淋巴囊肿病毒——聚合酶链式反应(PCR)法 6043鱼类虹彩病毒——聚合酶链式反应(PCR)法 6144贝类帕金虫——雷氏液体巯基醋酸盐培养基培养(RFTM)法和聚合酶链式反应(PCR)法……6145贝类单孢子虫——聚合酶链式反应(PCR)法 6146微生物分子鉴定——限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)法 6147粪便污染源微生物示踪监测——重复性基因外回文序列聚合酶链式反应(REP-PCR)法 6448赤潮藻种分子鉴定——荧光原位杂交(FISH)法 6849海洋污染物生物毒性检验——发光细菌法 7050海洋污染物生物毒性检验——藻类检验法 7351海洋污染物生物毒性检验——多毛类检验法 7652海洋污染物生物毒性检验——软体动物检验法 8053海洋污染物生物毒性检验一甲壳类检验法 8254海洋污染物生物毒性检验——棘皮类检验法 8555海洋污染物生物毒性检验——鱼类检验法 8756海洋沉积物生物毒性检验——端足类检验法 89附录A(规范性附录)记录表 96附录B(资料性附录)生理盐水和细菌、真菌计数表 129附录C(规范性附录)被检样品中细菌最可能数(MPN)表 132附录D(规范性附录)浮游生物样品编号、生物量测定、计数 133附录E(规范性附录)比色卡 135附录F(规范性附录)沙门氏菌确认检验流程图 136附录G(规范性附录)单核细胞增生李斯特菌确认检验流程 137附录H(资料性附录)PCR法检测7种弧菌电泳模拟图 138附录1(资料性附录)PCR.RT-PCR法检测10种病毒电泳模拟图 139附录J(资料性附录)受试生物——日本大螯蜚 140图1粪大肠菌群测试片直接计数法检测程序 8图2粪大肠菌群测试片MPN计数法检测程序 10nTOC\o"1-5"\h\z图3文昌鱼年龄结构模式图 30图4金黄色葡萄球菌测试片直接计数法检验程序 37图5金黄色葡萄球菌测试片MPN计数法检验程序 39图6微孔板试剂盒法快速检测沙门氏菌流程 40图7单核细胞增生李斯特菌测试片检验程序 44图8霉菌与酵母菌的检验程序 46图E.1沙门氏菌微孔板试剂盒检测法结果判读比色卡 135图F.1沙门氏菌确认检验流程图 136图G.1单核细胞增生李斯特菌确认检验流程 137图H.1PCR法检测7种弧菌电泳模拟图 138图1.1PCR、RT-PCR法检测10种病毒电泳模拟图 139表1水样采集层次 11表2各种网具规格及适用对象 25表3植物群落样地描述调査表 31表4各类麻痹性贝毒检出限参考表 35表5用于荧光原位杂交试验的探针情况 69表6氯化汞工作液稀释配制系数 71表A.1浮游病毒及微微型浮游生物海上采样记录表 96表A.2浮游或沉积物病毒直接计数记录表 97表A.3叶绿素采样记录表 98表A.4叶绿素（萃取荧光法）测定记录表 99表A.5初级生产力粒度分级采样、过滤、测定记录表 100表A.6微微型光合浮游生物细胞数量记录表 101表A.7微型浮游生物海上采样记录表 102表A.8微型浮游生物样品登记表 103表A.9水样浮游生物标本个数计数记录表 104表A.10微型浮游生物标本个数计数记录表 105表A.11微型浮游生物数量统计表 106表A.12微型浮游生物种类名录 107表A.13鱼类浮游生物海上采集记录表 108表A.14鱼类浮游生物标本登记表 109表A.15鱼类浮游生物计数记录表 110表A.16鱼类浮游生物数量统计表 111表A.17海洋珍稀濒危游泳动物观测记录表 112表A.18海洋珍稀濒危游泳动物观测结果统计表 112表A.19珍稀濒危海鸟类样点观测记录表 113表A.20珍稀濒危海鸟类样带观测记录表 113表A.21文昌鱼现场采样记录表 114表A.22文昌鱼种群结构室内分析记录表 114表A.23滨海湿地植物调査记录表 115表A.24海水中病原性弧菌检测记录表 116表A.25海洋病毒记录表 117111IV学兔兔IV学兔兔标准下载IV学兔兔IV学兔兔标准下载HY/T147.5—2013TOC\o"1-5"\h\z表A.26鱼类淋巴囊肿病毒检测记录表 118表A.27生物毒性检验现场采样记录表 119表A.28发光细菌急性毒性测定试验记录表 120表A.29发光细菌法测定环境毒性的分级标准 120表A.30藻类毒性试验记录表 121表A.31百分率与概率单位换算表 122表A.32藻类毒性试验数据统计换算登记表 123表A.33 海洋生物毒性试验记录表 124表A.34海洋生物毒性试验数据统计换算登记表 125表A.35端足类毒性试验生物结果记录表 •. 126表A.36端足类毒性试验物理结果记录表 127表A.37端足类毒性试验生物结果统计表 128表B.1细菌（真菌）测试片直接计数表 130表B.2细菌测试片MPN计数表 131表C.1被检样品中细菌最可能数（MPN）表 132HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013学兔兔学兔兔标准下载HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013学兔兔学兔兔标准下载HY/T147《海洋监测技术规程》分为七个部分： 第1部分:海水；——第2部分:沉积物；——第3部分:生物体；——第4部分:海洋大气；——第5部分:海洋生态；——第6部分:海洋水文、气象与海冰；一第7部分:卫星遥感技术方法。本部分为HY/T147的第5部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由国家海洋环境监测中心提出。本部分由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。本部分起草单位：国家海洋环境监测中心、国家海洋局南海环境监测中心、国家海洋局东海环境监测中心、国家海洋局北海环境监测中心。本部分主要起草人:韩庚辰、樊景凤、马永安、姜文博、张振冬、林凤翱、李洪波、梁斌、许道艳、邵魁双、李冬梅、刘永健、刘述锡、袁秀堂、闫启仑、柳圭泽、王立俊、刘长安、冯志权、王真良、刘娜、于占国、黄楚光、髙阳、李秀芹、韦桂秋、易斌、肖瑜璋、陈嘉辉、李海涛、熊小飞、董燕红、吴施卫、卢楚谦、程祥圣、刘材材、孙亚伟、秦玉涛、李益云、夏永健、樊立静、纪焕红、黄辉、郜钧璋、忻丁豪、宋晨瑶、崔文林、齐衍萍、张琪、王泰森、主小清、李钦亮、赵升、孙蓓蓓、张清波。海洋监测技术规程

第5部分：海洋生态1范围HY/T147的本部分规定了海洋生物生态的样品采集、试验、分析、资料整理等方法的技术要求。本部分适用于近岸、近海、远海海域的生物生态的监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB3097海水水质标准GB4789.4-2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB4789.30—2010食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB4789.38食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数GB/T12763.1海洋调查规范第1部分：总则GB/T12763.6—2007海洋调查规范第6部分:海洋生物调查GB17378.3海洋监测规范第3部分:样品采集、贮存与运输GB17378.5海洋监测规范第5部分:沉积物分析GB17378.7—2007海洋监测规范第7部分:近海污染生态调査和生物监测GB18668海洋沉积物质量GB19489实验室生物安全通用要求海洋灾害调査技术规范第3部分:海洋生态灾害调查3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。1浮游生物plankton缺乏发达的运动器官，没有或仅有微弱的运动能力，悬浮在水层中，常随水流移动的生物。包括浮游植物和浮游动物两大类。浮游生物依个体的大小可分为以下几种类型：粒径小于2的称微微型浮游生物(picoplankton)；粒径为2pm〜20p.m的称微型浮游生物(nanoplankton)；粒径为20pm〜200fj.m的称小型浮游生物(microplankton或netplankton)；粒径为200pm〜2000ptm的称中型浮游生物(mesoplankton);粒径为2000fzm~20mm之间的，称为大型浮游生物(macroplankton)；粒径大于20mm的称巨型浮游生物(megaplankton)„此夕卜，鱼类浮游生物(ichthyoplankton)即为鱼卵和仔稚鱼。[GB/T12763.6—2007,定义3.10]3.2距离抽样distancesampling利用不同距离和生境内的鸟类辨识技术，在一定范围或距离内估算鸟类数量，收集生态种群数据。HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013学兔兔学兔兔标准下载HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013学兔兔学兔兔标准下载HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013学兔兔学兔兔标准下载抽样方法包括样点法和样带法。3.3样点法pointcount在一定时间内，观察者于固定的观察点对鸟类进行观察计数的方法，可以用于估计鸟类种群的相对密度，也可与距离估测结合计算绝对密度。该方法适用于调査高度可见的、鸣叫的以及在广阔生境中的鸟种，一般用于调査雀形目鸟类。3.4样带法linetransect在一定时间内，观察者沿固定的线路行进，并对线路两侧所见到的鸟类进行观察计数的方法，行进方式在陆地上可以是沿样带行走、驾车，在海上可行船，或在空中飞行。该方法适用于调查髙度开放生境中的鸟类，也适用于调查离开海岸的海鸟和水鸟。3.5微生物源示踪microbialsourcetracking以某些具有代表性的微生物作为示踪因子，对环境样品中的污染物质进行跟踪溯源的监测技术。3.6基因指纹图谱库genefingerprintlibrary将独有的基因片段作为特异性的指纹标记，用以判断基因来源而构建的比对用数据库。3.7沉积物毒性检验sedimenttoxicitytest通过将试验生物直接暴露于沾污沉积物的方法来确定沉积物中污染物质的生物效应。3.8加标spiked在实验室通过在清洁沉积物或海水中按一定浓度加入一种或几种具有潜在毒性化学物质的过程。3.9上覆水overlyingwater沉积物毒性检验试验中加人试验容器里面固相沉积物上面的试验海水。4浮游病毒总数一染色计数法1适用范围本方法适用于海水中浮游病毒的丰度检测。4.2方法原理荧光染料SYBRGreenI与病毒核酸嵌合，在荧光显微镜蓝色光激发下呈针扎状、亮绿色。根据颗粒大小分辨浮游病毒。4.3仪器设备仪器设备应符合以下要求：a）落射荧光显微镜；•b）抽滤装置:包括滤器、支架、抽滤瓶和真空泵；c） 衬垫滤膜：醋酸纤维滤膜，直径25mm,孔径0.45Mm、0.8pm；d） 氧化铝滤膜:直径25mm，孔径0.02Mm;e）离心管：5mL〜15mL，用5%HC1溶液浸泡1d以上，经0.02滤膜过滤的蒸馏水漱洗并高压灭菌；D无色指甲油。4.4试剂及其配制试剂及其配制要求如下：a） 戊二醛溶液：市售分析纯级；b） SYBRGreenI：市售，冷冻暗保存；c） 10%p-苯二胺储备液:避光冷冻保存；d） PBS甘油储备液：将50%的PBSC8.5gNaCl,2.2gNa2HPO4,0.15gNaH2PO4,l000mL蒸馏水，pH值为7.5）和体积分数为50%的甘油混合，冷藏保存。4.5样品采集与处理样品采集详细信息记录于表A.10取水样15mL〜50mL置于灭菌离心管中，加固定剂戊二醛溶液至终浓度为0.5%；避光冷藏保存，应在7d内分析；超低温（一80C）避光保存，宜在30d内分析完毕。4.6分析步骤分析步骤如下：a） 滤器装配：长期未用的滤器应先装好滤器和抽滤装置，用经0.02 滤膜过滤的高压灭菌蒸馏水加满滤筒并抽滤清洗2次〜3次（当天使用的滤器，在各个样品测定前用同样方法清洗一次，清洗时不应取下衬垫滤膜）；卸下滤筒在衬垫滤膜上放置氧化铝滤膜，装配好滤筒。b） 配制染色剂：取出SYBRGreenI,用经0.02Mm滤膜过滤的无菌去离子水按1:10稀释，操作应在弱光环境中进行，未用完的染色剂应立即避光冷冻保存。c） 配制荧光保护剂工作液：取10%的〆苯二胺储备液，化霜、摇匀后吸取10ML与990PBS甘油储备液混合，制成工作液。d） 加样：加人0.1mL〜2mL样品（视野病毒数控制在200个以下），若样品量少于1mL则应加入经0.02 滤膜过滤的超纯水稀释至1mL，再加样。e） 抽滤：在负压15kPa~20kPa条件下，把样品抽滤至干。f） 染色：用移液器吸取97.5经0.02滤膜过滤的无菌去离子水，滴入干净的无菌塑料培养皿，再加人2.5 10%的SYBRGreen1染色剂工作液（染色剂浓度为0.25%），取下氧化铝滤膜，将膜的非载样面放在培养皿的染色液上，冰浴、避光染色15min。g） 制片：染色后，取出滤膜，吸干滤膜背面及边缘的液滴，把滤膜紧贴于灭菌载玻片上（载样面朝上），加30mL荧光保护剂，加上盖玻片，滤膜上下两面均不应有气泡，用无色指甲油密封盖玻片四周，制片可冷冻保存30d。h） 计数：在荧光显微镜蓝色滤光片、油镜下观测，病毒颗粒呈针扎状、亮绿色，细菌亦呈亮绿色，但其亮度强于病毒颗粒，且菌体比病毒颗粒大得多。随机选取至少20个视野，计算病毒颗粒数。记录总数不少于300个病毒颗粒。4.7记录和计算记录将记录和计算结果记入表A.2中。3HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013(1)学兔兔学兔兔标准下载HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013(1)学兔兔学兔兔标准下载4.7.2丰度计算浮游病毒丰度以个/mL表示。按式（1）计算样品病毒丰度：式中：N——样品病毒丰度，单位为个每毫升（个/mL）；N.——各视野平均病毒数，单位为个；S——滤膜实际过滤面积，单位为平方厘米（cm2）；S（——显微镜视野面积，单位为平方厘米（cm2）；f——固定剂终浓度；V——过滤样品量，单位为毫升（mL）。4.8注意事项注意事项如下：a） 样品宜保存在低温黑暗条件下；b） 操作过程中所涉及的容器、器皿均应事先灭菌；c） 为减少误差，观测视野应大于20个，且病毒总计数应大于300个，保证足够的视野数；d） 未用完的10%/）-苯二胺储备液应立即冷冻保存，但累计冻、融不应超过3次；如果储备液呈棕色，应弃之不用并重新配制；e） 测定时应做空白对照，空白制片中每个视野不应出现3个以上病毒。5沉积物中病毒总数——染色计数法1适用范围本方法适用于海洋表层沉积物中病毒的丰度测定。5.2方法原理见4.205.3仪器设备仪器设备应符合以下要求：a)箱式采泥器；b)超声波清洗仪；c)离心机，转速不低于1000r/mind)旋涡振荡器；e)分析天平：感量士0.01g；f)无菌勺；g)其他仪器设备见4.3。5.4试剂及其配制焦磷酸钠；其他试剂见4.4。HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013学兔兔学兔兔标准下载HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013学兔兔学兔兔标准下载5.5样品采集处理5.5.1泥样采集样品采集如下：a） 用箱式采泥器采集未受干扰的沉积物；b） 用无菌勺取上层2cm的泥沙样两份（1g〜10g）置于50mL离心管内，并称重记录泥沙重量；c） 加人经0.02 氧化铝膜过滤的戊二醛灭菌海水溶液4mL（终浓度2%）,冷藏保存直到分析。5.5.2样品处理样品处理如下：a） 用焦磷酸钠（终浓度5mmol/L）萃取样品，剧烈摇动混匀，孵化15min〜30min；b） 样品离心管外围用碎冰包围，置于超声波清洗仪分散处理3次，每次1min，间隔30s；c） 用旋涡振荡器振动样品1min，于1000r/min条件下离心1min；d） 取上清液置于一80*€超低温冷冻保存，直至丰度检测。5.6分析步骤见4.6。5.7记录和计算5.7.1丰度计算沉积物中病毒丰度以个/g表示。按式（2）计算样品病毒丰度：式中：N——样品含病毒丰度数，单位为个每克（个/g）;N.——各视野平均病毒数，单位为个；S——滤膜实际过滤面积，单位为平方厘米（cm2）；S,——显微镜视野面积，单位为平方厘米（cm2）；f——固定剂终浓度；M——样品湿重重量，单位为克（g）。结果记录把记录和计算结果记人表A.2中。5.8注意事项注意事项如下：a） 泥样宜是上层2cm以上的泥样；b） 超声波处理泥样时，应冰浴，防止温度升高;c） 其他见4.8。HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013学兔兔学兔兔标准下载HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013学兔兔学兔兔标准下载6弧菌总数一平板计数法按《海洋灾害调查技术规范第3部分:海洋生态灾害调查》的要求执行。7肠球菌——最大可能数法（MPN）和滤膜法按《海洋灾害调查技术规范第3部分:海洋生态灾害调查》的要求执行。8粪大肠菌群一测试片法1适用范围本方法适用于海水、海洋沉积物和海洋鱼、虾、蟹、贝、藻类等生物样品中粪大肠菌群的快速检验。本方法包括直接计数法与最大可能数（mostprobablenumber,简称MPN）计数法，当两种方法所获结果发生矛盾时，以直接计数法为仲裁方法。8.2直接计数法1方法原理大肠菌群测试片是一种预先制备好的培养基，含有紫罗兰红胆汁（VRB）培养基、冷水可溶性凝胶和氯化三苯四氮唑（TTC）指示剂等，可增强大肠菌群菌落的计数效果。同时该培养基系统表面覆盖的胶膜可截留发酵乳糖而产生的气体，因此红色菌落周围有气泡形成。44.5X：土0.5T培养24h士2h后计数周围有气泡的红色菌落数，即为粪大肠菌群数，亦称耐髙温大肠菌群数。8.2.2仪器设备仪器设备应符合以下要求：a） 超净工作台；b） 恒温培养箱：44.5C土0.5c） 干热灰菌箱；d） 冰箱：2°C~5°C；e） 髙压蒸汽灭菌器；f） 便携式冷藏箱；g） 天平或电子秤：感量0.1g；h） 无菌锥形瓶：150mL；i） 无菌培养皿：直径90mm；j） 无菌试管：180mmX18mm；k） 无菌采水瓶、击开式采水器；l） 无菌刀、勺子、剪子、镊子等；m） 大肠菌群测试片压板：1mL,5mL；n） 移液器及其吸头或无菌吸管lmL、10mL;o） 75%酒精棉球；P）采泥器；q） 一次性无菌乳胶手套；r） —次性无菌塑料袋；s） 采集贝类的耙子、刮刀；t） 采集网箱养殖鱼类、甲壳类的手捞网；u） 灭菌玻璃研钵或均质器（旋刀式或拍击式）；v） 放大镜、菌落计数器或菌落自动判读仪。8.2.3试剂和测试片试剂和测试片如下：a） 生理盐水：参见附录B;b） 髙灵敏度大肠菌群测试片；c） 大肠菌群测试片。8.2.4样品采集与预处理1海水样品海水样品的采集和预处理如下：a） 采集：根据需要使用击开式采水器和无菌采水瓶采取表层或其他水层海水样品100mL~200mL，并立即冷藏保存，24h内送回实验室进行检验分析，细菌（真菌）计数表要求记录采样时间、现场水温、盐度等参见附录B；b） 预处理:无菌移取海水样品5mL至装有45mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分稀释，制备成10—1稀释样品；依此类推，无菌移取1CT1稀释样品5mL至装有45mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分稀释，制备成1（T2稀释样品。2.4.2沉积物样品沉积物样品的采集和预处理如下：a） 采集：用无菌刀先刮去采泥器采取的表层沉积物表面，再用无菌勺根据需要挖取约100g~200g沉积物样品并装入无菌塑料袋中，挤出袋内空气，将袋口扎好，做好标签，再将此袋和做好的标签一起放人另一个无菌袋中。将外层袋内空气挤出、袋口扎好，冷藏保存，24h内送回实验室进行检验分析，细菌（真菌）计数表要求记录采样时间、现场水温、盐度等参见附录B；b） 预处理：用无菌不锈钢勺无菌移取表层沉积物样品5g至装有45mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分稀释，制备成10_：稀释样品；再无菌移取1CT1沉积物稀释样品5mL至装有45mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分稀释，制备成10—2稀释样品；依此类推，可以制备10一3稀释样品。2.4.3生物样品生物样品的采集和预处理程序如下，a）采集：1）采集贻贝、牡蛎等附着性贝类，首先将刮刀用酒精棉球消毒，然后用刮刀将贻贝或牡蛎从附着物上采集下来。再带好一次性消毒手套随机选取无机械损伤的活贝样品于无菌塑料袋中，每个样品根据需求和采集对象的规格，采集5个〜30个（能剖出10g〜80g鲜重贝肉）即可。挤出袋内空气，将袋口扎好，做好标签，再将此袋和做好的标签一起放人另一个无菌袋中。将外层袋内空气挤出、袋口扎好，冷藏保存，24h内送回实验室进行检验分析。2） 采集文蛤、杂色蛤、四角蛤蜊等底埋性贝类，首先将耙贝类耙子用酒精棉球消毒，耙取底埋贝类，然后再戴好一次性消毒手套将耙出的贝类样品采集到无菌塑料袋中。把样品装人无菌袋中，做好标签、扎好袋口，做好记录，样品及时冷藏保存。3） 采集浮筏养殖的海带、裙带菜等大型藻类样品，首先将剪取样品的剪刀用酒精棉球消毒，然后再戴好一次性消毒手套剪取大型藻类样品并装人无菌塑料袋中，做好标签、记录，样品及时冷藏保存。4） 采集网箱养殖的鱼类、甲壳类样品，首先将捞取样品的手抄网用紫外线消毒，然后再戴好一次性消毒手套捞取养殖的鱼类、甲壳类样品，并装入无菌塑料袋中，做好标签、记录，样品及时冷藏保存。上述各种生物样品采集的同时细菌（真菌）计数表要求记录采样时间、现场水温、盐度等参见附录B。所有生物样品都应在24h内送回实验室进行检验分析。b）预处理:无菌剖（剪）取生物样品5g，并剪碎至无菌玻璃研钵中，无菌研磨成肉糜后加人45mL无菌生理盐水，充分稀释，制备成1CT1稀释样品；再无菌移取10_*稀释样5mL至装有45mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分稀释，制备成1CT2稀释样;依此类推，可以制备i（r3、i（r4稀释样品。8.2.5检验操作程序检验操作程序如图1所示。图1