学习情境一细菌发酵制药

学习情境一

细菌发酵制药发酵制药子学习情境1.1

天冬酰胺酶发酵天冬酰胺酶生产的工艺流程任务1菌种保藏

任务2菌种复壮

任务3种子扩大培养

任务4发酵罐的使用和维护

任务5发酵控制、分离纯化及活性测定子学习情境1天冬酰胺酶发酵任务1菌种保藏一、菌种保藏的目的

保持菌种的存活率与优良遗传性状；防止菌种退化与污染使已经退化的菌种恢复原有的性状总之，就是防止优良遗传性状的丧失和菌种死亡。

二、菌种保藏的原理挑选典型培养物（typicalculture）的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。菌种的保藏主要是依据微生物的生理、生化特性，人工创造条件使微生物代谢活动处于不活泼状态。利用微生物的孢子、芽孢及营养体，给以不适合其萌发、生长、繁殖的条件，即低温、干燥、缺氧、缺营养等手段来达到菌种保藏的目的。三、菌种的保藏方法斜面保藏法沙土保藏法冷冻真空干燥保藏法试管熔封保藏法矿油保存法（一）斜面保藏法1、贴标签：将注有菌株名称和接种日期的标签贴在试管斜面正上方。2、接种：将待藏菌种用些面接种法移种至标明菌名的相应试管斜面上。3、培养：细菌置37℃恒温培养15～24h，酵母菌置28～30℃恒温培养36～60h，放线菌和丝状真菌置28℃培养4～7d。4、收藏：为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎或用熔化的固体石蜡熔封棉塞后置4℃冰箱保存。保存温度不宜太低，否则会因结冰脱水而加速菌种的死亡。斜面菌种（二）沙土管或硅胶管保藏法1、处理沙土：取河沙经60目筛子过筛以除去大的颗粒，用10%HCL浸泡（用量以浸没沙面为度）2～4h（或煮沸30min）以除去有机质，然后倒去盐酸，用流水冲洗至中性，烘干或晒干备用。另取非耕作层瘦黄土（不含有机质）风干、粉碎，用100～120目的筛子过筛备用。2、装沙土管：将沙与土按2：1或4：1（W/W）比例混合均匀，装入试管（10mm×100mm）中，装置约1cm高，加棉塞后用高压蒸汽灭菌（121℃灭菌30min）。灭菌后取少许置于牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中，在合适的温度下培养一段时间确证无菌生长才能使用。3、制备菌液：吸3ml无菌水至斜面菌种管内，用接种环轻轻搅动，洗一下孢子制成孢子悬液。4、加孢子液：吸取上述孢子液0.1～0.5ml于每一沙土管中，加入量以湿润沙土达2/3高度为宜。5、干燥：将含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器内用培养皿盛P2O5（或变色硅胶）做干燥剂，再用真空泵抽气2～4h以加速干燥。6、收藏：沙土管可选择下列方法之一。⑴保藏于干燥器中。⑵将沙土管取出，管口用火焰熔封后保藏。⑶将沙土管装入含CaCl2等干燥剂的大试管内，塞上橡皮塞并用蜡封管口，置于4℃冰箱中保藏。7、恢复培养：使用时挑少量混有孢子的沙土接种于斜面培养基上即可。沙土管仍可原法继续保藏。（三））冷冻冻真空空干燥燥保藏藏法分支管管再与与麦氏氏真空空计和和冷凝凝管相相连。。冷凝凝管的的另一一端连连接在在真空空泵上上。置冷凝凝管于于盛有有干冰冰（固固体CO2）的广广口保保温瓶瓶中，，使安安瓿管管中抽抽出的的水汽汽进入入冷凝凝管内内立刻刻冻结结。将安瓿瓿管的的下半半部也也埋入入干冰冰中，，使管管内物物质骤骤然冷冷却。。约10min，管管内物物质已已全部部冻结结，开开动真真空泵泵30min后后，将将安瓿瓿管移移入-15℃的的冰盐盐水中中，继继续开开动真真空泵泵抽气气1h，然然后将将安瓿瓿管置置于室室温中中，再再抽气气30min。。此时管管内物物质已已全部部干燥燥，样样品呈呈疏松松状。。用微微型煤煤气灯灯在真真空状状态下下，熔熔封安安瓿管管的颈颈部。。将制制好的的冷冻冻菌种种管置置于4℃冰冰箱中中保藏藏。先将牛牛奶煮煮沸后后冷却却，去去掉上上面的的一层层脂肪肪。反反复三三次后后用脱脱脂棉棉过滤滤，或或者将将牛奶奶在3000r/min的离离心机机中离离心数数分钟钟，除除去表表面脂脂肪后后，在在50kPa压压力下下灭菌菌30min。。然后后用牛牛奶洗洗下在在斜面面上长长好的的菌体体，制制成菌菌悬液液，装装入安安瓿管管中约约0.1ml，，塞上上棉塞塞，用用橡皮皮管将将安瓿瓿管连连接在在分支支管上上（见见图1-1）图1-1冷冷冻冻干燥燥封管管装置置简图图1、安安瓿管管2、干干冰容容器3、、接真真空计计4、接接真空空泵5、、冷凝凝管（四））试管管熔封封（密密封））保藏藏法试管熔熔封法法的一一般操操作如如下：：用各种种琼脂脂斜面面（普普通肉肉汤等等）常常规灭灭菌后后，经经接种种，室室温培培养24～～48小时时后，，将接接种菌菌生长长旺盛盛的试试管用用喷灯灯将其其管口口熔封封，分分别置置室温温和冰冰箱下下保存存。使用时时，用用砂轮轮在管管口划划一圈圈，并并在乙乙醇灯灯下火火焰灭灭菌后后敲开开管口口即可可转接接到另另一斜斜面上上，由由于试试管经经熔封封后，，可防防止培培养基基水分分蒸发发，又又可减减缓细细菌的的代谢谢速度度，并并能防防止杂杂菌污污染。。密封法法保藏藏法将需保保藏菌菌种按按无菌菌操作作要求求接种种至固固体培培养基基（细细菌采采用肉肉汤琼琼脂、、酵母母采用用蔡氏氏培养养基、、放线线菌采采用高高氏１１号培培养基基）上上，经经适温温培养养后，，（细细菌１１～２２d，，孢芽芽菌、、放线线菌５５～７７d，，酵母母菌３３d））塞紧紧棉花花塞，，放在在干燥燥器内内，干干燥器器密封封处涂涂上凡凡士林林。盖盖紧后后使之之与真真空泵泵相连连接，，开动动真空空泵抽抽真空空30rain至１１h（（此时时真空空度约约为640），，关闭闭密封封口，，拔出出胶塞塞，置置于室室温下下保存存，待待使用用时，，打开开盖，，取出出菌种种，接接种至至培养养基上上即可可。。（五））矿油油保存存法菌种在在琼脂脂斜面面上或或在半半固体体琼脂脂试管管中生生长后后，在在试管管中再再加入入无菌菌液体体石蜡蜡，使使覆盖盖在培培养基基上面面，这这样就就使菌菌种和和培养养基与与外界界空气气隔绝绝，并并可防防止培培养基基水分分蒸发发，管管口可可用固固体石石蜡封封口，，放置置低温温保存存，至至少可可以保保存六六个月月至一一年））。表1-1菌菌种种保藏藏各种种方法法比较较表表1-2微微生物物菌种种制备备、保保藏和和使用用记录录表表1-3菌菌种种接收收记录录表任务2菌种种复壮壮菌种合合理传传代方方法之之一一、菌菌种的的衰退退、复复壮概概念1.衰衰退（（degeneration）：：菌菌种在在培养养或保保藏过过程中中，由由于自自发突突变的的存在在，出出现某某些原原有优优良生生产性性状的的劣化化、遗遗传标标记的的丢失失等现现象，，称为为菌种种的衰衰退。。衰退的的原因因：①①基因因突变变，②②分离离现象象。常见的的衰退退现象象：①①菌落落和细细胞形形态的的改变变；②②生长长速度度缓慢慢，产产孢子子越来来越少少；③③抵抗抗力、、抗不不良环环境能能力减减弱等等；④④代谢谢产物物生产产能力力或其其对宿宿主寄寄生能能力下下降。。2、菌菌种的的复壮壮（rejuvenation））：使使衰退退的菌菌种恢恢复原原来优优良性性状。。狭义的的复壮壮是指指在菌菌种已已发生生衰退退的情情况下下，通通过纯纯种分分离和和生产产性能能测定定等方方法，，从衰衰退的的群体体中找找出未未衰退退的个个体，，以达达到恢恢复该该菌原原有典典型性性状的的措施施；广义义的的复复壮壮是是指指在在菌菌种种的的生生产产性性能能未未衰衰退退前前就就有有意意识识的的经经常常、、进进行行纯纯种种的的分分离离和和生生产产性性能能测测定定工工作作，，以以期期菌菌种种的的生生产产性性能能逐逐步步提提高高。。实实际际上上是是利利用用自自发发突突变变（（正正变变））不不断断地地从从生生产产中中选选种种。。二、、菌菌种种复复壮壮的的主主要要方方法法纯种种分分离离法法宿主主体体内内复复壮壮法法淘汰汰法法遗传传育育种种法法菌种种保保藏藏方方法法纯种种分分离离法法平板表面涂布法平板划线分离法琼脂培养基浇注法用“分离小室”进行单细胞分离用显微操纵器进行单细胞分离用菌丝尖端切割法进行单细胞分离菌落纯（菌种纯）细胞纯（菌株纯）纯种分离法平板板涂涂布布方方法法平板板划划线线方方法法三、、菌菌种种复复壮壮操操作作步步骤骤1、、菌菌悬悬液液的的制制备备。。用用无无菌菌生生理理盐盐水水或或缓缓冲冲液液将将斜斜面面菌菌体体洗洗下下制制成成菌菌悬悬液液。。经经一一定定浓浓度度稀稀释释后后在在平平板板上上进进行行菌菌落落计计数数。。2、、平平板板分分离离。。根根据据计计数数结结果果，，定定量量稀稀释释后后制制成成菌菌浓浓度度为为每每毫毫升升50-200个个的的菌菌悬悬液液，，取取0.1毫毫升升注注入入平平皿皿，，再再倒倒入入适适量量培培养养基基，，摇摇匀匀，，制制成成混混菌菌平平板板，，培培养养后后长长出出分分离离的的单单菌菌落落。。3、、纯纯培培养养。。选选取取分分离离培培养养后后长长出出的的各各型型单单菌菌落落，，接接种种斜斜面面后后培培养养。。4、初筛筛。将成成熟的斜斜面菌种种对应接接入发酵酵瓶，摇摇床发酵酵一段时时间后测测定各菌菌落生产产性能。。5、复筛筛。挑选选初筛中中高单位位菌株的的5%~20%进行摇摇瓶复试试，最好好使用母母瓶与发发酵瓶二二级发酵酵，重复复3~5次后分分析确定定产量水水平。初初、复筛筛都需以以正常生生产菌种种作对照照，复筛筛出的菌菌株产量量应比对对照菌株株提高5%以上上，并经经糖、氨氨代谢检检验，合合格后在在生产罐罐上试验验。6、菌种种保藏。。将复筛筛后得到到的高单单位菌株株制成沙沙土管、、冷冻管管或用其其他方法法保藏。。任务3种种子扩扩大培养养种子扩大大培养：是指将将保存在在砂土管管、冷冻冻干燥管管中处于于休眠状状态的生生产菌种种接入试试管斜面面活化后后，在经经过扁瓶瓶或摇瓶瓶及种子子罐逐级级放大培培养而获获得一定定数量和和质量的的纯种过过程。这这些纯种种培养物物称为种种子。发酵工业业生产过过程中的的种子的的必须满满足以下下条件：：（1）菌菌种细胞胞的生长长活力强强，移种种至发酵酵罐后能能迅速生生长，迟迟缓期短短；（2）生生理形状状稳定；；（3）菌菌体总量量及浓度度能满足足大容量量发酵罐罐的要求求；（4）无无杂菌污污染；（5）保保持稳定定的生产产能力。。一、种子子的制备备过程种子扩大大培养流流程图1、实验验室细菌菌种子的的制备细菌的斜斜面培养养基多采采用碳源源限量而而氮源丰丰富的配配方。培培养温度度一般为为37℃℃。细菌菌菌体培培养时间间一般为为1~2天，产产芽孢的的细菌培培养则需需要5~10天天。(1)菌菌种培养养：采取取大肠杆杆菌ASl-375。。普通牛牛肉培养养基，接接种后于于37℃℃培养24h。。(2)种子培培养。16%玉玉米浆，，接种量量1%一一1.5%，37℃温温度，通通气搅拌拌培养4～8h。其过程如如下：试管→三三角瓶→→摇床→→种子罐罐液体培养养法（三三角瓶摇摇床振荡荡或转式式培养））2、生产产车间种种子制备备⑴种子罐罐的作用用：主要是使使菌体，，接入发发酵罐能能迅速生生长，达达到一定定的菌体体量，以以利于产产物的合合成。⑵种子罐罐级数的的确定种子罐级级数：是指制制备种子子需逐级级扩大培培养的次次数，取取决于：：①菌种生生长特性性、菌体体繁殖速速度；②所采用用发酵罐罐的容积积。细菌：生长快快，种子子用量比比例少，，级数也也较少，，二级发发酵。茄子瓶→→种子罐罐→发酵酵罐3、确定定种子罐罐级数需需注意的的问题种子级数数越少越越好，可可简化工工艺和控控制，减减少染菌菌机会种子级数数太少，，接种量量小，发发酵时间间延长，，降低发发酵罐的的生产率率，增加加染菌机机会虽然种子子罐级数数随产物物的品种种及生产产规模而而定。但但也与所所选用工工艺条件件有关。。如改变变种子罐罐的培养养条件，，加速了了孢子发发芽及菌菌体的繁繁殖，也也可相应应地减少少种子罐罐的级数数。二、种子子质量的的控制(一)影影响孢子子质量的的因素及及控制影响孢子子质量的的因素通通常有：：培养基基、培养养条件、、培养时时间和冷冷藏时间间等。1、培养基（1）培培养基所所用原料料要经过过发酵试试验合格格才可使使用；（2）严格格控制灭菌菌后培养基基的质量；；（3）斜面面培养基使使用前，需需在适当温温度下放置置一定时间间；（4）供生生产用的孢孢子培养基基要用比较较单一的氮氮源，作为为选种或分分离用的培培养基则采采用较复杂杂的有机氮氮源。2、种龄与与接种量种龄：种子培养养时间。一般选择对对数期，缩缩短发酵周周期。接种量：移入的种种子液体积积与接种后后培养液体体积比。多数抗生素素的接种量量在7%-15%，，有时20-25%。依据具具体的的发酵类型型和工艺条条件而定。。3、温度：：温度直接影影响生长和和酶的合成成；最适温度。4、pH值值：对微生生物有明显显的影响各种微生物物都有生长长的最适pH。培养养基pH值值在发酵时时要受菌体体代谢的影影响。调节方法(1)酸碱溶液中中和(2)缓缓冲溶液液(3)生生理缓冲冲剂5、通气搅搅拌搅拌：促进氧的溶溶解，营养养物质与代代谢产物的的分散。通气：通气量的多多少以溶解氧来衡定。6、泡沫危害：影响微生物物对氧的吸吸收。消泡方法：：（1）消消泡剂：天天然动植物物油、石油油化工矿物物油；改性性油，表面面活性剂（（有机硅聚聚合物）；；（2）机机械消泡：：（3）改变变培养基成成分。7、染菌的的控制染菌原因：设备、管道道、阀门漏漏损、发酵酵罐结构““死角”、、灭菌不彻底底、空气净化化不好、无菌操作不不严、菌种不纯纯；8、种子罐罐级数种子罐级数数越少，越越有利于简简化工艺，，便于控制制，减少染染菌。任务4发发酵罐的的使用和维维护一、发酵罐罐的结构1、空气预预处理器2、电动动阀3、、电磁流量量计4、、空气预滤滤器5、、空气精滤滤器6、、蒸汽过滤滤器7、、pH电电极8、、电动阀（（夹套进冷冷水）9、电动阀阀（夹套进进热水）10、通通风管11、消沫沫电极12、消沫沫器13、搅拌器器14、、检测温度度的电热偶偶15、、DO电极极16挡挡板17电机18、减速速器19、接种孔孔20、、出水阀21、夹夹套22、冷凝水水排除阀23、取取样与放料料阀（三向向阀门）图1-6100L全自动实实验罐结构构示意图二、发酵罐罐的使用（一）空气气过滤器的的灭菌操作作1、灭菌前前的准备启动蒸汽发发生器将将自来水水引入水处处理装置进进行除杂、、软化处理理，处理后后留入贮水水灌，然后后开启自动动控制开关关进行加热热，蒸汽压压力达到0.2-0.3Mpa时可供供使用。启动冷冻机机将自自来水引入入冷冻机，，开启冷水水机电源开开关制冷。。当冷水温温度达到10℃时，，可供空气气预处理使使用。启动空气压压缩机启启动前，，先关闭空空气管路上上所有阀门门，然后打打开空气压压缩机电源源开关，启启动空气压压缩机。当当空气压缩缩机的压力力达到0.25Mpa左右时时，依次打打开管路上上阀门，将将空气引入入冷冻机、、油水分离离器，经过过冷却、除除油水后进进入贮气罐罐，待用。。2、空气过过滤器的灭灭菌、吹干干以及保压压图1-7是是100L发酵罐空空气管道示示意图1、电动阀阀2、电电磁流量计计3、粗粗滤器4、空气阀阀门5、、排气阀16、压力表表7、精精滤器8、排气阀阀29、空气阀阀门10、排气阀阀311、蒸汽汽阀112、空气气过滤器13、蒸蒸汽阀214排气气阀4（二）发酵酵罐的空消消发酵罐空消消前，必须须首先检查查并关闭发发酵罐夹套套的进水阀阀门，然后后启动计算算机，按照照操作程序序进入到显显示发酵罐罐温度的界界面，以便便观察温度度变化。空消时，先先打开夹套套的冷凝水水排出阀，，以便夹套套中残留的的水排出，，然后从两两路管道将将蒸汽引入入发酵罐：：一路是发发酵罐的通通风管，另另一路是发发酵罐的放放料管。每每一路进蒸蒸汽时，都都是按照““由远处到到近处”依依次打开各各个阀门。。两路蒸汽汽都进入发发酵罐后，，适当打开开所有能够够排汽的阀阀门充分排排汽，如管管路上的小小排汽阀、、取样阀、、发酵罐的的排气阀等等，以便消消除灭菌的的死角。灭灭菌过程中中，密切注注意发酵罐罐温度以及及压力的变变化情况，，及时调节节各个进蒸蒸汽阀门以以及各个排排汽阀门的的开度，确确保灭菌温温度在（121±1）℃，维维持30min，即即可达到灭灭菌效果。。灭菌完毕，，先关闭各各个小排汽汽阀，然后后按照“由由近处到远远处”依次次关闭两路路管道上各各个阀门。。待罐压降降至0.05Mpa左右时，，关闭发酵酵罐的排气气阀，迅速速打开精过过滤器后的的空气阀，，将无菌空空气引入发发酵罐，利利用无菌空空气压力将将管内的冷冷凝水从放放料阀排出出。最后，，关闭放料料阀，适当当打开发酵酵罐的排气气阀，并调调节进空气气阀门开度度，使罐压压维持在0.1Mpa左右，，保压，备备用。（三）培养养基的实消消培养基实消消前，关闭闭进空气阀阀门并打开开发酵罐的的排气阀，，排出发酵酵罐内空气气，使罐压压为0，再再次检查并并关闭发酵酵罐夹套的的进水阀门门、发酵罐罐放料阀。。将事先校校正好的pH电极、、DO电极极以及消沫沫电极等插插进发酵罐罐，并密封封、固定好好。然后，，拧开接种种孔的不锈锈钢塞，将将配制好的的培养基从从接种孔倒倒入发酵罐罐。启动计计算机，按按照操作程程序进入到到显示温度度、pH、、DO、转转速等参数数的界面，，以便观察察各种参数数的变化。。同时，启启动搅拌，，调节转速速为100r/min左右。。实消时，先先打开夹套套的进蒸汽汽阀以及冷冷凝水排出出阀，利用用夹套蒸汽汽间接加热热，至80℃左右，，为了节约约蒸汽，可可关闭夹套套的进蒸汽汽阀，但必必须保留冷冷凝水排出出阀处于打打开状态。。然后，按按照空消的的操作，从从通风管和和放料管两两路进蒸汽汽直接加热热培养基。。实消过程程中，所有有能够排汽汽的阀门应应适当打开开并充分排排汽，根据据温度变化化及时调节节各个进蒸蒸汽阀门以以及各个排排汽阀门的的开度，确确保灭菌温温度和灭菌菌时间达到到灭菌要求求（不同培培养基灭菌菌要求不一一样）。灭菌完毕，，先关闭各各个小排汽汽阀，然后后关闭放料料阀，并按按照“由近近处到远处处”依次关关闭两路管管道上各个个阀门。待待罐压降至至0.05Mpa左左右时，迅迅速打开精精过滤器后后的空气阀阀，将无菌菌空气引入入发酵罐，，调节进空空气阀门以以及发酵罐罐排气阀的的开度，使使罐压维持持在0.1Mpa左左右，进行行保压。最最后，关闭闭夹套冷凝凝水排除阀阀，打开夹夹套进冷却却水阀门以以及夹套出出水阀，进进冷却水降降温，这时时，启动冷冷却水降温温自动控制制，当温度度降低至设设定值机自自动停止进进水。自始始至终，搅搅拌转速保保持为100r/min左右右，无菌空空气保压为为0.1Mpa左右右，降温完完毕，备用用。（四）接种种操作接种前，调调节进空气气阀门以及及发酵罐排排气阀门的的开度，使使罐压为0.01-0.02Mpa。。用酒精棉球球围绕接种种孔并点燃燃。在酒精精火焰区域域内，用铁铁钳拧开接接种孔的不不锈钢塞，，同时，迅迅速解开摇摇瓶种子的的纱布，将将种子液倒倒入发酵罐罐内。接种后，用用铁钳去不不锈钢塞在在火焰上灼灼烧片刻，，然后迅速速盖在接种种孔上并拧拧紧。最后，将发发酵罐的进进气以及排排气的手动动阀门开大大，在计算算机上设定定发酵初始始通气量以以及罐压，，通过电动动阀门控制制发酵通气气量以及罐罐压，使达达到控制要要求。（五）发酵酵过程的操操作参数控制发酵过程中中在线检测测参数可通通过计算机机显示，通通气量、pH、温度度、搅拌转转速和罐压压等许多参参数，可按按照控制软软件的操作作程序进行行设定，只只要调解机机构在线，，通过计算算机控制调调解机构而而实现在线线控制。流加控制流加时，在在火焰区域域内揭开不不锈钢插针针的包扎，，并将插针针迅速插穿穿流加孔的的硅胶塞，，同时，将将硅胶罐装装入蠕动泵泵的挤压轮轮中，启动动蠕动泵，，积压轮转转动可以将将流加液压压进发酵罐罐。通过计计算机可以以设定开始始流加的时时间、挤压压轮的转速速，从而可可以自动流流加以及自自动控制流流加速度。。取样样操操作作取样样时时，，可可调调节节罐罐底底的的三三向向阀阀门门至至取取样样位位置置，，利利用用发发酵酵罐罐内内压压力力排排出出发发酵酵液液，，用用试试管管或或烧烧杯杯接接收收。。取取样样完完毕毕，，关关闭闭三三向向阀阀门门，，打打开开与与之之连连接接的的蒸蒸汽汽，，对对取取样样口口灭灭菌菌几几分分钟钟。。放料料操操作作发酵酵结结束束后后，，先先停停止止搅搅拌拌，，然然后后，，关关闭闭发发酵酵罐罐的的排排气气阀阀门门，，调调节节罐罐底底的的三三向向阀阀门门至至放放料料位位置置，，利利用用发发酵酵罐罐内内压压力力排排出出发发酵酵液液，，用用容容器器接接受受发发酵酵液液。。（六六））发发酵酵罐罐的的清清洗洗与与维维护护放料料结结束束后后，，先先关关闭闭放放料料阀阀以以及及发发酵酵罐罐进进空空气气阀阀门门，，打打开开排排气气阀阀门门派派出出馆馆内内空空气气，，使使罐罐压压为为0。。然然后后，，拆拆卸卸安安装装在在罐罐上上的的pH、、DO等等电电极极以以及及流流加加孔孔上上的的不不锈锈钢钢插插针针，，并并在在电电极极插插空空和和流流加加孔孔拧拧上上不不锈锈钢钢塞塞。。接接着着，，从从接接种种孔孔加加入入70L左左右右的的清清水水，，启启动动搅搅拌拌，，转转速速为为100r/min左左右右，，用用蒸蒸汽汽加加热热清清水水至至121℃℃左左右右，，搅搅拌拌30min左左右右，，以以此此清清洗洗发发酵酵罐罐。。清清洗洗完完毕毕，，利利用用空空气气压压力力排排出出洗洗水水，，并并用用空空气气吹吹干干发发酵酵罐罐。。停用用蒸蒸汽汽时时，，切切断断蒸蒸汽汽发发生生器器的的电电源源，，通通过过发发酵酵罐罐的的各各个个蒸蒸汽汽管管道道的的排排气气阀阀排排出出残残余余蒸蒸汽汽，，直直至至蒸蒸汽汽发发生生器器上上的的压压力力表表现现是是为为0。。停停用用空空气气时时，，切切断断空空气气压压缩缩机机的的电电源源，，通通过过空空气气管管道道的的排排气气阀阀排排出出残残余余空空气气，，直直至至贮贮气气罐罐上上压压力力表表显显示示为为0。。最最后后，，关关闭闭所所有有的的阀阀门门以以及及计计算算机机。。（七七））电电极极的的使使用用与与维维护护pH电电极的的使用用与维维护在pH电机机装上上发酵酵罐之之前，，须对对pH电极极进行行两点点校正正。pH电电极与与计算算机连连接后后接通通电源源，将将pH电极极分别别浸泡泡在两两种不不同pH的的标准准缓冲冲溶液液中进进行校校正，，检查查测定定值的的两点点斜率率，一一般要要求斜斜率≧≧90%，，方可可使用用。DO的的电极极的使使用与与维护护使用前前，DO电电极与与计算算机连连接并并接通通电源源，将将DO电极极浸泡泡在饱饱和的的亚硫硫酸钠钠溶液液中（（或培培养基基恒温温结束束降温温前）），此此时的的测量量指标标定为为0。。发酵酵培养养基灭灭菌并并冷却却至初初始发发酵温温度充充分通通风搅搅拌（（一般般以发发酵过过程的的最大大通风风和搅搅拌转转速条条件下下氧饱饱和））时，，DO电极极的测测量指指标定定为100%。。（八））折叠叠膜过过滤芯芯的维维护折叠膜膜过滤滤芯，，其锁锁扣、、外筒筒、端端盖以以及密密封胶胶圈虽虽然都都是热热稳定定材料料，但但耐高高温有有一定定限度度。灭灭菌时时，必必须严严格控控制灭灭菌温温度和和灭菌菌时间间，若若灭菌菌温度度过高高、灭灭菌时时间过过长，，容易易造成成损坏坏。同同时，，灭菌菌后必必须用用空气气吹干干，才才能使使用，，否则则过滤滤效率率降低低或失失效。。不使使用时时，必必须保保持干干燥，，以免免霉腐腐。（九））蒸汽汽发生生器的的维护护用于蒸蒸汽发发生器器的水水必须须经过过软化化、除除杂等等处理理，以以免蒸蒸汽发发生器器加热热管结结垢，，影响响产生生蒸汽汽的能能力。。使用用时，，必须须保证证供水水，使使水位位达到到规定定高度度，否否则会会出现现“干干管””现象象造成成损坏坏。蒸蒸汽发发生器器的电电气控控制部部分必必须能能够正正常工工作，，达到到设置置压力力时能能够自自动切切断电电源。。蒸汽汽发生生器上上的安安全阀阀与压压力表表须定定期校校对，，能够够正常常工作作。每每次使使用后后，先先切断断电源源，排排除压压力后后，停停止供供水，，并将将蒸汽汽发生生器内内的水水排空空。任务5发酵酵控制制、分分离纯纯化及及活性性测定定一