微生物发酵-青霉素类抗生素

--青霉素类抗生素微生物发酵一

抗生素的概述二

青霉素的制备抗生素概述1.定义2.作用3.来源4.分类5.作用机制抗生素概述1.定义：是某些细菌、放线菌、真菌等微生物的次级

代谢产物，或用化学方法合成的相同化合物或结

构类似物，在低浓度下对各种病原性微生物或肿

瘤细胞有强力杀灭作用或有其他药理作用的药物。返回抗生素概述2.作用：

抗细菌感染治疗肿瘤抗病原虫免疫抑制剂刺激植物生长3.来源：生物合成（发酵）化学合成（全合成和半合成）返回抗生素概述4.分类：青霉素类

氨苄青霉素

邻氯青霉素RNA合成抑制喹诺酮类利福霉素类核酸合成抑制细胞膜抑制多粘菌素

BDNA合成抑制磷霉素头孢菌素类头霉素类大环内酯类

麦迪霉素

红霉素氯霉素蛋白质合成抑制细胞壁合成抑制四环素类氨基糖苷类

返回抗生素概述5.作用机制：抑制细菌细胞壁的合成（β-内酰胺类、磷霉素、万古霉素。）抑制细菌蛋白质合成（四环素、大环内酯类、氨基糖苷类、氯霉素类。）抑制细菌DNA合成（利福平。）抑制细菌RNA合成（放线菌素。）损伤细菌细胞膜（两性霉素B、粘菌素、氨基糖苷类。）青霉素的制备一：青霉素的背景二：青霉素的性质三：青霉素的生产工艺过程四：青霉素的应用青霉素的背景青霉素(Penicillin)又被称为盘尼西林，它是人类发明的第一种抗生素，也是全球销量最大的抗生素。青霉素是一种高效、低毒、临床应用广泛的重要抗生素。它的研制成功大大增强了人类抵抗细菌性感染的能力，带动了抗生素家族的诞生。1953年，我国第一批青霉素的诞生揭开了我国生产抗生素的历史;到2001年，我国青霉素的产量已经占据了全球的60%的市场份额，目前我国是全球最大的青霉素生产国家。青霉素类抗生素青霉素的发现1928年，英国细菌学家Fleming发现污染在培养葡萄球菌的双蝶上的一株霉菌能杀死周围的葡萄球菌。他将此霉菌分离纯化后得到的菌株鉴定为青霉，并将这菌产生的抗生物质命名为青霉素。1940年，英英国Florey和Chain进一一步研究究此菌，，并从培培养液中中制出了了干燥的的青霉素素制品。。经实验验和临床床试验证证明，它它毒性很很小，并并对一些些革兰氏氏阳性菌菌所引起起的许多多疾病有有卓越疗疗效。青霉素类类抗生素素青霉素G青青霉素X青青霉素V来源：霉霉菌属的的青霉菌菌发酵液液中提取取，天然然青霉素素有5种种G、V、N、、K、X、其中中PG的的活性最最高、产产量最高高。青霉素N青青霉霉素K青霉素理理化性质质酸性一般的羧羧酸Pka4-6PGPka2.7临床用其其钠盐、、钾盐或或普鲁卡卡因盐，，增强水水溶性。。粉针针剂剂，，有有效效期期2年年临床床用用粉粉针针剂剂，，现现用用现现配配不稳稳定定性性β––内内酰酰胺胺环环是是青青霉霉素素中中最最不不稳稳定定的的部部分分，，原原因因是是1、、四四元元环环和和五五元元环环稠稠合合，，环环的的张张力力大大2、、两两个个环环不不在在同同一一平平面面，，青青霉霉素素结结构构中中ββ-内内酰酰胺胺环环中中羰羰基基和和氮氮原原子子的的孤孤对对电电子子不不能能共共轭轭，，易易受受到到亲亲核核性性或或亲亲电电性性试试剂剂的的进进攻攻，，使使ββ-内内酰酰胺胺环环破破裂裂。。β-内内酰酰胺胺环环对对水水、、光光、、热热、、酸酸、、碱碱、、酶酶、、醇、、胺胺不不稳稳定定，，ββ-环环开开裂裂、、活活性性降降低低或或消消失失对碱碱或或酶酶(ββ-内内酰酰胺胺酶酶)不不稳稳定定，，水水解解对稀稀酸酸不不稳稳定定，，发发生生重重排排；；PH=4青霉二酸青霉醛青霉胺-CO2对羰基亲核反应分解重排对强强酸酸不不稳稳定定，，发发生生重重排排PH=2orHgCl2

青霉酸+青霉醛酸

△青霉醛aβ-环开裂,-CO2abb青霉霉素素生生产产工工艺艺过过程程菌种种→种子子制制备备→发酵酵→发酵酵液液预预处处理理→提取取及及精精制制→成品品包包装装菌种种介介绍绍：：青霉霉是是产产生生青青霉霉素素的的重重要要菌菌种种。。广广泛泛分分布布于于空空气气、、土土壤壤和和各各种种物物上上，，常常生生长长在在腐腐烂烂的的柑柑桔桔皮皮上上呈呈青青绿绿色色。。目目前前已已发发现现几几百百种种，，其其中中产产黄黄青青霉霉(Penicillumchrysogenum)、、点点青青霉霉(Penicillumnototum)等等都都能能大大量量产产生生青青霉霉素素种子子制制备备：：种种子子制制备备是是指指孢孢子子接接入入种种子子罐罐后后，，在在罐罐中中繁繁殖殖成成大大量量菌菌丝丝的的过过程程，，其其目目的的是是使使孢孢子子发发芽芽、、繁繁殖殖和和获获得得足足够够数数量量的的菌菌丝丝，，以以便便接接种种到到发发酵酵罐罐当当中中去去。。种种子子制制备备所所使使用用的的培培养养基基及及其其它它工工艺艺条条件件，，都都要要有有利利于于孢孢子子发发芽芽和和菌菌丝丝繁繁殖殖。。青霉素素生产产工艺艺过程程发酵条条件下下的生生长过过程第1期期：分分生孢孢子萌萌发，，形成成芽管管，原原生质质未分分化化，，具有有小泡泡。第第2期：：菌丝丝繁殖殖，原原生质质体具具有嗜嗜碱性性，类类脂肪肪小颗颗粒。。第3期期：形形成脂脂肪包包涵体体，机机理贮贮藏物物，没没有空空泡，，嗜碱碱性很很强。。第第4期期：脂脂肪包包涵体体形成成小滴滴并减减少，，中小小空泡泡，原原生质质体嗜嗜碱性性减弱弱，开开始产产生抗抗生素素。第5期期：形形成大大空泡泡，有有中性性染色色大颗颗粒，，菌丝丝呈桶桶状，，脂肪肪包涵涵体消消失，，青霉霉素产产量最最高。。第第6期期：出出现个个别自自溶细细胞，，细胞胞内无无颗粒粒，仍仍然桶桶状。。释放放游离离氨，，pH上升升。第第7期：：菌丝丝完全全自溶溶，仅仅有空空细胞胞壁。。1－4期为为菌丝丝生长长期，，3期期的菌菌体适适宜为为种子子。4－－5期期为生生产期期，生生产能能力最最强，，通过过工程程措施施，延延长此此期，，获得得高产产。在在第第六期期到来来之前前结束束发酵酵。青霉素素的发发酵发酵中中灭菌菌发酵工工艺控控制：：1.基基质浓浓度2.温温度3.培培养基基成分分的控控制4.pH值值、溶溶氧5.菌菌丝浓浓度等等6.泡泡沫的的控制制发酵中中灭菌菌青霉霉素素属属于于ββ-内内酰酰胺胺类类抗抗生生素素，，其其ββ-内内酰酰胺胺环环极极易易破破坏坏而而失失效效，，所所以以不不可可以以高高压压灭灭菌菌了了，，否否则则将将导导致致完完全全失失效效。。一般般制制备备青青霉霉素素是是采采用用无无菌菌操操作作法法、、冷冷冻冻干干燥燥技技术术（（真真空空条条件件下下使使冰冰直直接接升升华华，，得得以以除除去去水水分分））制制备备的的。。发酵酵工工艺艺控控制制1.基基质质浓浓度度：在分分批批发发酵酵中中，，常常常常因因为为前前期期基基质质量量浓浓度度过过高高，，对对生生物物合合成成酶酶系系产产生生阻阻遏遏或或对对菌菌丝丝生生长长产产生生抑抑制制（（如如葡葡萄萄糖糖和和钱钱的的阻阻遏遏或或抑抑制制,苯苯乙乙酸酸的的生生长长抑抑制制））,而而后后期期基基质质浓浓度度低低限限制制了了菌菌丝丝生生长长和和产产物物合合成成。。所以以，，在在青青霉霉素素发发酵酵中中通通常常采采用用补补料料分分批批操操作作法法，，以以维维持持一一定定的的最最适适浓浓度度。。发酵酵工工艺艺控控制制2.温温度度：青霉霉素素发发酵酵的的最最适适温温度度随随所所用用菌菌株株的的不不同同可可能能稍稍有有差差别别,但但一一般般认认为为应应在在25°°C左左右右。。温温度度过过高高将将明明显显降降低低发发酵酵产产率率,同同时时增增加加葡葡萄萄糖糖的的维维持持消消耗耗,降降低低葡葡萄萄糖糖至至青青霉霉素素的的转转化化率率。。对对菌菌丝丝生生长长和和青青霉霉素素合合成成来来说说,最最适适温温度度不不是是一一样样的的,一一般般前前者者略略高高于于后后者者,故故有有的的发发酵酵过过程程在在菌菌丝丝生生长长阶阶段段采采用用较较高高的的温温度度，，以以缩缩短短生生长长时时间间,到到达达生生产产阶阶段段后后便便适适当当降降低低温温度度,以以利利于于青青霉霉素素的的合合成成。。发酵酵工工艺艺控控制制3.培培养养基基成成分分的的控控制制:A.碳源源--发酵酵中中常常用用乳乳酸酸或或葡葡萄萄糖糖，，也也可可采采用用葡葡萄萄糖糖母母液液、、糖糖蜜蜜等等。。其其中中乳乳糖糖最最为为便便宜宜，，但但因因货货源源较较少少，，很很多多国国家家采采用用葡葡萄萄糖糖代代替替。。但但当当葡葡萄萄糖糖浓浓度度超超过过一一定定限限度度时时，，会会过过分分加加速速菌菌体体的的呼呼吸吸，，以以至至培培养养基基中中的的溶溶解解氧氧不不能能满满足足需需要要，，使使一一些些中中间间代代谢谢物物不不能能完完全全氧氧化化而而积积累累在在菌菌体体或或培培养养基基中中，，导导致致pH下下降降，，影影响响某某些些酶酶的的活活性性，，从从而而抑抑制制微微生生物物的的生生长长河河产产物物的的合合成成。发酵酵工工艺艺控控制制B.氮源源-主要要有有机机氮氮源源为为玉玉米米浆浆、、棉棉籽籽饼饼粉粉、、花花生生饼饼粉粉、、酵酵母母粉粉、、蛋蛋白白胨胨等等。。玉玉米米浆浆为为较较理理想想的的氮氮源源，，含含固固体体量量少少，，有有利利于于通通气气及及氧氧的的传传递递，，因因而而利利用用率率较较高高。。固固体体有有机机氮氮源源原原料料一一般般需需粉粉碎碎至至200目目以以下下的的细细度度。。有有机机氮氮源源还还可可以以提提供供一一部部分分有有机机磷磷，，供供菌菌体体生生长长。。无无机机氮氮如如硝硝酸酸盐盐、、尿尿素素、、硫硫酸酸铵铵等等可可适适量量使使用用。。发酵酵工工艺艺控控制制C.无机机盐盐-碳酸酸钙钙用用来来中中和和发发酵酵过过程程中中产产生生的的杂杂酸酸，，并并控控制制发发酵酵液液的的pH值值，，为为菌菌体体提提供供营营养养的的无无机机磷磷源源一一般般采采用用磷磷酸酸二二氢氢钾钾。。另另外外加加入入硫硫代代硫硫酸酸钠钠或或硫硫酸酸钠钠以以提提供供青青霉霉素素分分子子中中所所需需的的硫硫。。由由于于现现在在还还有有一一些些工工厂厂采采用用铁铁罐罐发发酵酵，，在在发发酵酵过过程程中中铁铁离离子子便便逐逐渐渐进进入入发发酵酵液液。。发发酵酵时时间间愈愈长长，，则则铁铁离离子子愈愈多多。。铁铁离离子子在在50µµg/ml以以上上便便会会影影响响青青霉霉素素的的合合成成。。采采用用铁铁络络合合剂剂以以抑抑制制铁铁离离子子的的影影响响，，但但实实际际对对青青霉霉素素产产量量并并无无改改进进。。所所以以青青霉霉素素的的发发酵酵罐罐采采用用不不锈锈钢钢制制造造为为宜宜，，其其他他重重金金属属离离子子如如铜铜、、汞汞、、锌锌等等能能催催化化青青霉霉素素的的分分解解反反应应。。发酵工工艺控控制D.前体-添加加苯乙乙酸或或者苯苯乙酰酰胺，，可以以借酰酰基转转移的的作用用，将将苯乙乙酸转转入青青霉素素分子子，提提高青青霉素素G的的生产产强度度，。。因此此前体体的加加入成成为青青霉素素发酵酵的关关键问问题之之一。。但苯苯乙酸酸对发发酵有有影响响，一一般以以苯乙乙酰胺胺较好好。也也有人人采用用苯乙乙酸月月桂醇醇酯，，其优优点是是在发发酵中中月桂桂醇酯酯水解解，苯苯乙酸酸结合合进青青霉素素成品品。而而月桂桂酸作作为细细菌营营养剂剂及发发酵液液消沫沫剂，，且其其毒性性比苯苯乙酸酸小，，但价价格较较贵。。前体体要在在发酵酵开始始20h后后加入入，并并在整整个发发酵过过程中中控制制在50µµg/ml左右右。前前体用用量大大于0.1%时时，青青霉素素的生生物合合成均均下降降。所所以一一般发发酵液液中前前体浓浓度以以始终终维持持在0.1%为为宜。。发酵工工艺控控制4.pH值值、溶溶氧：青霉素素在合合理的的Ph(6.8～7.2)和和溶氧氧(>30%)下，，生产产和发发酵才才会达达到最最高效效率！！在罐罐的夹夹层或或蛇管管中需需通冷冷却水水以维维持一一定罐罐温。。在整整个发发酵过过程中中，需需不断断通无无菌空空气和和搅拌拌，以以维持持一定定罐压压或溶溶氧。。5.菌菌丝浓浓度等等：在葡萄萄糖限限制生生长的的条件件下，，青霉霉素比比生产产速率率与产产生菌菌菌丝丝的比比生长长速率率之间间呈一一定关关系。。而其其它的的如：：菌菌丝形形态等等亦会会有所所影响响………发酵工工艺控控制6.泡泡沫的的控制制：在发酵酵过程程中产产生大大量泡泡沫,可可以用用天然然油脂脂,如如豆豆油、、玉米米油等等或用用化学学合成成消泡泡剂““泡泡敌敌””来来消泡泡,应应当当控制制其用用量并并要少少量多多次加加入,尤尤其在在发酵酵前期期不宜宜多用用,否否则则会影影响菌菌体的的呼吸吸代谢谢。。加消沫沫剂以以控制制泡沫沫，必必要时时还加加入酸酸、碱碱以调调节发发酵液液的pH。。发酵液液预处处理发酵液液中的的杂质质如高高价无无机离离子（（Fe2+、Ca2+、、Mg2+）和和蛋白白质在在离子子交换换的过过程中中对提提炼影影响甚甚大，，不利利于树树脂对对抗生生素的的吸收收。如如用溶溶媒萃萃取法法提炼炼时，，蛋白白质的的存在在会产产生乳乳化，，使溶溶媒合合水相相分离离困难难。对对高价价离子子的去去除，，可采采用草草酸或或磷酸酸。如如加草草酸则则它与与钙离离子生生成的的草酸酸钙还还能促促使蛋蛋白质质凝固固以提提高发发酵滤滤液的的质量量。如如加磷磷酸（（或磷磷酸盐盐），，既能能降低低钙离离子浓浓度，，也利利于去去除镁镁离子子。加加黄血血盐及及硫酸酸锌，，则前前者有有利于于去除除铁离离子，，后者者有利利于凝凝固蛋蛋白质质。此此外，，两者者还有有协同同作用用。他他们所所产生生的复复盐对对蛋白白质有有吸附附作用用。染菌菌处处理理染菌菌是是发发酵酵工工业业长长期期以以来来不不能能彻彻底底解解决决的的问问题题，，因因此此如如何何解解决决染染菌菌问问题题就就成成了了发发酵酵工工业业的的工工作作重重点点之之一一。。要要解解决决染染菌菌问问题题首首要要问问题题就就是是要要能能检检测测出出是是否否染染菌菌。。染染菌菌通通常常通通过过三三个个途途径径发发现现：：无无菌菌试试验验，，发发酵酵液液直直接接镜镜检检，，发发酵酵液液的的生生化化分分析析。。其其中中无无菌菌试试验验是是判判断断染染菌菌的的主主要要依依据据。。染菌菌的的常常用用检检测测法法无菌菌试试验验的的方方法法有有双碟碟培培养养斜斜面面培培养养肉肉汤汤培培养养镜镜检检等，，其其中中以以双双碟碟培培养养为为主主。。无菌菌试试验验的的方方法法--双双碟碟培培养养双碟碟培培养养的操操作作要要点点是是：：种种子子罐罐在在培培养养过过程程中中每每8小小时时取取样样一一次次，，取取样样时时在在装装有有9毫毫升升肉肉汤汤的的试试管管内内加加入入2～～5毫毫升升试试样样，，然然后后在在无无菌菌室室内内通通过过无无菌菌操操作作在在事事先先铺铺好好琼琼脂脂培培养养基基的的双双碟碟内内画画线线。。剩剩下下的的肉肉汤汤培培养养物物，，在在37℃℃培培养养6小小时时后后复复画画一一次次，，及及另另画画一一双双碟碟作作比比较较，，发发酵酵罐罐在在发发酵酵过过程程中中每每隔隔8小小时时取取样样一一次次，，用用空空白白试试管管取取样样5～～15毫毫升升左左右右，，于于37℃℃培培养养6小小时时后后画画碟碟时时，，双双碟碟放放置置37℃℃培培养养．．24小小时时内内的的双双碟碟，，每每隔隔2～～3小小时时在在灯灯光光下下检检查查一一次次，，观观察察有有无无杂杂菌菌生生长长。。24～～48小小时时的的双双碟碟每每天天检检查查一一次次，，以以防防生生长长缓缓慢慢的的杂杂菌菌漏漏检检。。一一般般杂杂菌菌在在37℃℃，，24小小时时以以内内能能长长出出来来．．此此法法的的优优点点是是比比较较准准确确，，但但反反应应较较慢慢（（因因杂杂菌菌在在双双碟碟上上繁繁殖殖成成菌菌落落要要有有一一定定的的时时间间）），，并并且且操操作作也也较较麻麻烦烦。。无菌菌试试验验的的方方法法--斜斜面面/肉肉汤汤培培养养斜面面或或肉肉汤汤培培养养法法，就是是直直接接用用酚酚红红肉肉汤汤取取样样培培养养，，或或直直接接用用斜斜面面取取样样培培养养，，但但也也有有先先用用空空白白无无菌菌试试管管取取样样，，再再接接种种于于肉肉汤汤或或斜斜面面培培养养基基的的。。也也有有在在中中小小罐罐接接种种前前，，无无菌菌试试验验样样品品先先进进行行镜镜检检。。直直接接取取样样进进行行无无菌菌试试验验的的方方法法比比较较方方便便。。无无菌菌试试验验的的结结果果，，一一般般要要8～～16小小时时才才能能做做出出判判断断。。为为了了加加速速杂杂菌菌的的生生长长，，特特别别是是对对中中小小罐罐无无菌菌情情况况的的及及时时判判断断，，可可以以加加入入对对氨氨基基苯苯甲甲酸酸等等生生长长促促进进剂剂，，以以促促进进杂杂菌菌的的生生长长。。染菌菌的的处处理理染菌菌后后一一般般是是丝丝状状菌菌丝丝对对过过滤滤有有影影响响，，以以及及发发酵酵杂杂菌菌产产物物对对提提取取有有影影响响。。因因此此应应对对污污染染过过的的发发酵酵液液作作加加热热预预处处理理，，加加助助滤滤剂剂等等有有利利于于过过滤滤，，对对发发酵酵产产物物中中的的杂杂质质如如蛋蛋白白质质等等，，可可加加入入絮絮凝凝剂剂等等，，使使蛋蛋白白质质凝凝聚聚.染菌菌在在发发酵酵过过程程的的每每个个阶阶段段都都可可能能发发生生，，下下面面就就各各个个不不同同的的阶阶段段的的染染菌菌情情况况和和处处理理办办法法一一一一说说明明。。⒈种种子子培培养养期期染染菌菌⒉发发酵酵前前期期染染菌菌⒊发发酵酵中中期期染染菌菌⒋发发酵酵后后期期染染菌菌染菌菌的的处处理理⒈种种子子培培养养期期染染菌菌种子培养主主要是生长长繁殖菌体体。此时菌菌体浓度低低，培养基基营养丰富富，因此容容易染菌。。种子培养养期染菌，，带进发酵酵罐中的危危害极大，，应严格控控制种子污污染。当发发现种子受受污染后均均应灭菌后后弃去，并并对种子罐罐、管道进进行检查和和彻底灭菌菌。返回染菌的的处理理⒉发酵前期期染菌发酵前朗主主要是菌体体生长繁殖殖，代谢产产物生成很很少，染菌菌后杂菌容容易繁殖，，与生产菌菌争夺营养养成分和氧氧分，严重重干扰生产产菌的生长长繁殖和产产物的生成成，因此要要特别注意意发酵前期期的染菌。。当发酵前前期染菌时时，由于营营养成分消消耗不多，，能耗也不不大，从经经济性的角角度考虑应应迅速重新新灭菌，补补充必要的的营养成分分，重新接接种进行发发酵。返回染菌的的处理理⒊发酵中期期染菌发酵中期染染菌将严重重干扰生产产菌的代谢谢，影响产产物的生成成。如产酸酸，产泡沫沫，使菌体体自溶，使使发酵液变变臭等。发发酵中期染染菌，由于于营养成分分大量消耗耗，一般挽挽救处理困困难，危害害性大，发发酵中期染染菌应做到到早发现，，早处理，，通常做法法是“倒罐罐”，即用用一罐没有有染菌的发发酵液与染染菌的发酵酵液混合，，使有害菌菌浓度下降降，生产菌菌浓度提高高进而重新新成为优势势生长菌群群。显然，，倒罐必然然造成物料料消耗和操操作费用的的增加。返回染菌的的处理理⒋发酵后期期染菌发酵后期产产物积累较较多，效价价已经很高高，营养物物质接近耗耗尽，此时时如染菌量量不多，可可继续进行行发酵，如如严重污染染也可提前前放罐，停停止发酵，，这在经济济上往往是是合算的。。青霉素素提取取化学提取和和精制的目目的:从发发酵液中制制取高纯度度的、合乎乎药典的抗抗生素成品品。由由于发酵酵液山洪青青霉素浓度度很低，仅仅0.1%~4.5%左右，，而杂质浓浓度比青霉霉素的高几几十倍甚至至几千倍，，并且某些些杂质的性性质与抗生生素的非常常相近，因因此提取精精制是一件件十分重要要的工作。。发发酵液中常常见的杂质质有：菌丝丝、未用完完的培养基基、易污染染杂菌、产产生菌的代代谢产物、、预处理理需要加入入的杂质灯灯。青霉素素提取取青霉素的提提取遵循下下面四个原原则：⒈⒈时时间短⒉⒉温度低低⒊⒊pH适中⒋⒋勤清清洗消毒常用的提取取方法有溶媒萃取法法离离子交换法法沉沉淀法等青霉素素提取取溶媒萃取法法这是利用抗抗生素在不不同的pH条件下一一不同的化化学状态（（游离态、、碱或盐））存在时，，在水及水水互不相溶溶的溶媒中中溶解度不不同的特性性，是抗生生素从一种种液相（如如发酵滤液液）转移到到另一种液液相（如有有机溶媒））中去，以以达到浓缩缩和提纯的的目的。利利用此原理理就可借助助于调节pH的方法法使抗生素素从一个液液相中被提提取到另一一液相中去去。所选用用的溶媒与与