微生物的生长与控制课件

第七章微生物的生长与控制1第七章微生物的生长与控制1生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用>异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。发育——从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）个体生长个体繁殖群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖生长与繁殖的概念2生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用>异第一节微生物纯培养分离及生长测定方法3第一节微生物纯培养分离及生长测定方法3一、获得纯培养的方法纯培养(pureculture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.4一、获得纯培养的方法纯培养(pureculture)——微首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.这种方法适合于细胞较大的微生物.①液体稀释法5首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使②平板划线分离法（StreakPlate）特点：快速、方便。

分区划线（适用于浓度较大的样品）

连续划线（适用于浓度较小的样品）Aninoculatingloopisusedtothinoutorganismsonthesurfaceoftheagar.6②平板划线分离法（StreakPlate）特点：快速、方便连续划线划线分离后平板上显示的菌落照片7连续划线划线分离后平板上显示的菌落照片7③倾注平板法（PourPlate）Organismsareseriallydiluted,thenasmallamountisaddedtoanemptysterilepetridish,towhichmeltedagarat50ºCisadded.Thenmixtodistributetheorganisms.1ml1ml1ml1ml1ml1ml9ml9ml9ml9ml8③倾注平板法（PourPlate）Organismsar④平板涂布分离法（SpreadPlate）简单易行，但易造成机械损伤Liquidspecimenisspreadonthesurfaceofsolidagarwithasterilebentglassrod.9④平板涂布分离法（SpreadPlate）简单易行，但易造⑤选择性培养分离法为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。＊利用选择培养基进行直接分离＊富集培养10⑤选择性培养分离法为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，⑥单细胞（单孢子）分离法采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。11⑥单细胞（单孢子）分离法采用显微分离法从混杂群体中直接分离单⑦MembraneFilterWhenthereisasmallnumberoforganismsinalargeamountofliquid,theliquidisfilteredthroughamembraneandthenthemembraneisplacedonagarinapetridish.12⑦MembraneFilterWhenthereis二、微生物纯培养生长的测定方法描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。（一）微生物细胞数目的检测法直接法（血球计数板、比例计数法）间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法）（二）微生物生长量和生理指标测定法直接法(干重法，堆体积法)间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）13二、微生物纯培养生长的测定方法描述不同种类、不同生长状态的微1.血球计数板法141.血球计数板法14原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。1.血球计数板法15原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中2.涂片染色法应用：可同时计数不同微生物的菌数，适

于土壤、牛奶中细菌计数。方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取

0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代

入公式：每ml原菌液含菌数=视野中平均菌数×涂布面积/视野面积×100×稀释倍数162.涂片染色法应用：可同时计数不同微生物的菌数，适

3.平板菌落计数法173.平板菌落计数法173.平板菌落计数法★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完成操作），严格无菌操作；★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；★适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，★误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作★Astandardplatecount(viablecount)reflectsthenumberofviablemicrobesandassumesthateachbacteriumgrowsintoasinglecolony;platecountsarereportedasnumberofcolony-formingunits(CFU)perml(CFU/ml)orperg(CFU/g)ofsample.183.平板菌落计数法★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（1Whenweobservecolonies,wecannotassumeeacharosefromjustonecelloriginallyplantedonthemedium,however.Apair,chainorclusterofcellswhich'land'onthemediumincloseproximitytoeachothercanmultiplyandproduceasinglecolony.Thus,weusethetermcolony-formingunitwhenweconsiderthecommonoriginforthecellsofanycolony."ThistermisusuallyabbreviatedCFU.Colony-FormingUnit19Whenweobservecolonies,wec4.液体稀释法10n10n-210n-1204.液体稀释法10n10n-210n-1205.薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。215.薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物6.干重法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或80℃)、称重。一般干重为湿重的10%—20%，而一个细菌细胞一般重约10-12—10-13g。该法适合菌浓较高的样品。举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10–12~10–13g，液体培养物中细胞浓度达到2×109个/ml时，100ml培养物可得10~90mg干重的细胞。226.干重法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后7.比浊法原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。237.比浊法原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正8.生理指标法测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。248.生理指标法测含氮量24Table1.SomeMethodsusedtomeasurebacterialgrowth

MethodApplicationCommentsDirectmicroscopiccountEnumerationofbacteriainmilkorcellularvaccinesCannotdistinguishlivingfromnonlivingcellsViablecellcount(colonycounts)Enumerationofbacteriainmilk,foods,soil,water,laboratorycultures,etc.VerysensitiveifplatingconditionsareoptimalTurbiditymeasurementEstimationsoflargenumbersofbacteriainclearliquidmediaandbrothsFastandnondestructive,butcannotdetectcelldensitieslessthan107cellspermlMeasurementoftotalNorproteinMeasurementoftotalcellyieldfromverydensecultures

onlypracticalapplicationisintheresearchlaboratoryMeasurementofBiochemicalactivitye.g.O2uptakeCO2production,ATPproduction,etc.MicrobiologicalassaysRequiresafixedstandardtorelatechemicalactivitytocellmassand/orcellnumbersMeasurementofdryweightorwetweightofcellsorvolumeofcellsaftercentrifugationMeasurementoftotalcellyieldincultures

probablymoresensitivethantotalNortotalproteinmeasurements25Table1.SomeMethodsusedto第二节微生物的生长规律26第二节微生物的生长规律26由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长（synchronousgrowth），进行同步分裂的细胞称为同步细胞。同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。一、微生物的个体生长和同步生长27由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。一获得同步生长的方法：获得同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。28获得同步生长的方法：获得同步生长的方法主要有两类：28Helmstetter-Cummings法原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。29Helmstetter-Cummings法原理：一些细菌细Figure5.

Thesynchronousgrowthofabacterial

population.

Bycarefulselectionofcellsthathave

justdivided,abacterialpopulationcanbe

synchronizedinthebacterialcelldivisioncycle.

Synchronycanbemaintainedforonlyafewgenerations.

Figure.synchronousgrowth30Figure5.

Thesynchronousgro二、微生物的群体生长☆无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的，☆由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（Ｇenerationtime,G），代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间，有时也称为倍增时间。☆右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。右图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长的特征。1.无分支单细胞微生物的群体生长特征31二、微生物的群体生长☆无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌Bydefinition,bacterialgrowthiscellreplication–i.e.,growthoftheculture.Mostspeciesofbacteriareplicatebybinaryfission,whereonecelldividesinto2cells,the2cellsinto4,the4into8,etc.Ifthiscelldivisionoccursatasteadyrate–suchaswhenthecellshaveadequatenutrientsandcompatiblegrowingconditions–wecanplotnumbersofcellsvs.timesuchasonthegraphatright.Beforetoolong,wewillneedtoextendthepaperverticallyasthepopulationcontinuestodouble.Foraculturewherecellsdivideevery20minutes,onecellcanresultin16,777,216(i.e.,224)cellsafterjust8hours–barringnutrientdepletionorothergrowth-alteringconditions.1.无分支单细胞微生物的群体生长特征32Bydefinition,bacterialgrowtIfweweretoconvertourverticalaxistoalogarithmicscale–asonthegraphatright–wewillnotneedasmanysheetsofgraphpaper,andwewillfindthatasteadyrateofgrowthisreflectedasastraightline.(Ontheverticalaxis,thesamedistanceonthepaperiscoveredwitheachdoubling.)Thistypeofgraphpaperiscalledsemilogarithmicgraphpaperonwhichwewillbeplottingourclassresults.Thenumbersweplotwillfallonthegraphatthesameplacethelogarithmsofthesenumberswouldfallwhenplottedonconventionalgraphpaper.33IfweweretoconvertourvertTheexampleatrightshowsthetypeofgraphwemayobtainfromourclassdata.Wecanplotbothcolony-formingunits(CFUs)permlandabsorbanceonthesamegraph,rememberingthattheabsorbanceunitsshouldalsobeonalogarithmicscale.Ratherthan"connectingthedots,"wedrawthebeststraightlineamongourCFU/mlplotstorepresentthephasesofgrowth–lag,exponential,andthestartofthemaximumstationaryphase.34Theexampleatrightshowsthe★指数生长可以用下式表示：

b=B×2nB,b和t可由试验获得，n可通过上式计算得出，将等式两侧取对数重排后得：lgb=lgB+nlg2lgb-lgBlgb-lgB

lg20.301式中：B

为起始师细胞数目，

b

为指数生长某个时刻t时的细胞数目，

n

为世代数n==指数生长35★指数生长可以用下式表示：式中：n==指数生长35例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（B），经4h（

t）后增加到49，000，000（b），这样，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12★借助于n和t，还可以计算出不同培养条件下的代时G，

G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。36例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（B），经★代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。★代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为1~3h,然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。37★代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生一些细菌的代时菌名 培养基 培养温度 代时E.coli（大肠杆菌） 肉汤 37℃ 17minE.coli 牛奶 37 12.5 Enterobacteraerogenes（产气肠细菌） 肉汤或牛奶37 16~18 E.aerogenes 组合 37 29~44B. Cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤 30 18B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤 55 18.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶 37 66~87Streptococcuslactis（乳酸链球菌） 牛奶 37 26S.lactis 乳糖肉汤 37 48Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌） 肉汤 37 23.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344~46 Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 792~93 Nitrobacteragilis（活跃硝化杆菌） 组合 27 120038一些细菌的代时菌名 培养基 培养温度 代时38BacteriumMediumGenerationTime(minutes)EscherichiacoliGlucose-salts17Bacillus

megateriumSucrose-salts25StreptococcuslactisMilk26StreptococcuslactisLactosebroth48StaphylococcusaureusHeartinfusionbroth27-30LactobacillusacidophilusMilk66-87RhizobiumjaponicumMannitol-salts-yeastextract344-461MycobacteriumtuberculosisSynthetic792-932TreponemapallidumRabbittestes1980Table.Generationtimesforsomecommonbacteriaunderoptimalconditionsofgrowth.

39BacteriumMediumGenerationTime不同温度下的代时温度对微生物的代时有明显影响：E.Coli在不同温度下的代时温度（℃） 代时（分） 温度（℃） 代时（分）10 860 35 2215 120 37 1720 90 40 17.525 40 45 2030 29 47.5 7740不同温度下的代时温度对微生物的代时有明显影响：40G(generationtime)=t(time,inminutesorhours)/n(numberofgenerations)G=t/nG=generationtime(timeforthecellstodivide)t=timeintervalinhoursorminutesB=numberofbacteriaatthebeginningofatimeintervalb=numberofbacteriaattheendofthetimeintervaln=numberofgenerations(numberoftimesthecellpopulationdoublesduringthetimeinterval)b=Bx2n(Thisequationisanexpressionofgrowthbybinaryfission)G=t/n

Solveforn:n=logB+nlog2n=logb-logB

log2n=logb-logB

.301n=3.3logb/BG=t/nSolveforGG=

t

3.3logb/BCalculationofGenerationTime41G(generationtime)=t(time,Example:Whatisthegenerationtimeofabacterialpopulationthatincreasesfrom10,000cellsto10,000,000cellsinfourhoursofgrowth?

G=

t

3.3logb/BG=

240minutes

3.3log107/104

G=

240minutes

3.3x3G=24minutes

42Example:Whatisthegeneratio2.无分支单细胞微生物的群体生长曲线☆以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结论也基本适用于酵母菌。☆生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。☆每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。432.无分支单细胞微生物的群体生长曲线☆以细菌为例介绍无分支单将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。生长曲线的制作44将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在典型的生长曲线

（Growthcurve）延滞期对数期稳定期衰亡期时期的划分：按照生长速率常数（growthraceconstant）不同45典型的生长曲线

（Growthcurve）延滞期对数期稳其它名称：停滞期、调整期、适应期1.现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。2.特点：生长速率常数=0细胞形态变大或增长细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物①.延滞期（lagphase）46其它名称：停滞期、调整期、适应期①.延滞期（lagphas◆菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；◆接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；◆接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）；◆培养基成分：

在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；

接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。★影响延迟期长短的因素：47◆菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；★影响延迟期认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：◆在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；采取的缩短lagphase的措施有：①增加接种量；（群体优势----适应性增强）②采用对数生长期的健壮菌种；③调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。④选用繁殖快的菌种◆在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌48认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：◆在发酵工业上需②.对数期（logarithmicphase）其他名称：指数期现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。

特点：生长速率常数最大，即代时最短细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致代谢最旺盛细胞对理化因素较敏感影响因素：菌种营养成分营养物浓度﹡培养温度49②.对数期（logarithmicphase）其他名称：指应用意义：①由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。50应用意义：50营养物浓度与对数期生长速率和产量作用方式：影响微生物的生长速率和总生长量生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收获量受影响生长速度和最大收获量受影响时间细胞数或菌体量51营养物浓度与对数期生长速率和产量作用方式：影响微生物的生长速③.稳定期（stationaryphase）又称：恒定期或最高生长期特点：①新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。②细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。③此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。产生原因：

营养物尤其是生长限制因子的耗尽营养物的比例失调，如碳氮比不合适;有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）物化条件（pH、氧化还原势等）不合适;52③.稳定期（stationaryphase）又称：恒定期应用意义：1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）调pH

调整温度2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。生长产量常数（Y，或生长得率，growthyield）：概念：表示微生物对基质利用效率的高低

Y=菌体干重/消耗营养物质的浓度

根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量如：Y=0.5，表示要得到5g菌体，需某营养物（葡萄糖）10g。Y=x–x0C0

–C=x–x0C053应用意义：生长产量常数（Y，或生长得率，growthyie④.衰亡期（declinephase）特点：①细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”。②细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。③因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡54④.衰亡期（declinephase）特点：①细胞死亡数lg细胞数或产物浓度时间细胞产物I型 II型3.微生物生长与代谢产物形成的关系微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般认为：初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，初级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机；次级代谢产物与微生物的生存、生长和繁殖无关。次级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中，它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后期或衰亡期。55lg细胞数或产物浓度时间细胞I型 II型3.微生物生长与代4.丝状微生物的群体生长丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。可以用菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。可分为三个阶段：1、生长停滞期2、迅速生长期3、衰退期564.丝状微生物的群体生长丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液1、生长停滞期:造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。2、迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。3、衰退期:菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。4.丝状微生物的群体生长571、生长停滞期:造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞连续培养（continuousculture）分批培养（batchculture）：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养（continuousculture）：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。58连续培养（continuousculture）分批培养（b原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。单批培养恒浊法恒化法单批培养 连续培养 时间连续流入新鲜培养液lg细胞数（个/ml）连续培养连续培养原理59原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以连续培养器按控制方式分按培养器的级数分按细胞状态分按用途分内控制（控制菌体密度）：恒浊器外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器单级连续培养器多级连续培养器一般连续培养器固定化细胞连续培养器实验室科研用：连续培养器发酵生产用：连续发酵罐连续培养器60连续按控制方式分内控制（控制菌体密度）：恒浊器单级连续培养器连续培养技术——恒化连续培养概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究61连续培养技术——恒化连续培养概念：以恒定流速使营养物质浓度恒Figure.

Schematicdiagramofachemostat,

adeviceforthecontinuouscultureofbacteria.

Thechemostatrelievestheenvironmentalconditions

thatrestrictgrowthbycontinuouslysupplying

nutrientstocellsandremoving

wastesubstances

andspentcellsfromtheculturemedium.

62Figure.

Schematicdiagramof恒化器Chemostat或bactogen

63恒化器Chemostat或bactogen

63概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。连续培养技术——恒浊培养使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。64概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围恒浊器菌体密度（内控制）无限制生长因子不恒定最高大量菌体或与菌体形成相平行的产物生产为主恒化器培养基流速（外控制）有限制生长因子恒定低于最高不同生长速率的菌体实验室为主恒浊器与恒化器的比较65装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围恒浊器菌体密连续发酵（continuousfermentation）连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。优点：高效，简化了操作——装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；自控：便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量稳定节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月~1年。66连续发酵（continuousfermentation）连TypicalbacterialexponentialGrowth67Typicalbacterialexponential第七章微生物的生长与控制68第七章微生物的生长与控制1生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用>异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。发育——从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）个体生长个体繁殖群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖生长与繁殖的概念69生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用>异第一节微生物纯培养分离及生长测定方法70第一节微生物纯培养分离及生长测定方法3一、获得纯培养的方法纯培养(pureculture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.71一、获得纯培养的方法纯培养(pureculture)——微首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.这种方法适合于细胞较大的微生物.①液体稀释法72首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使②平板划线分离法（StreakPlate）特点：快速、方便。

分区划线（适用于浓度较大的样品）

连续划线（适用于浓度较小的样品）Aninoculatingloopisusedtothinoutorganismsonthesurfaceoftheagar.73②平板划线分离法（StreakPlate）特点：快速、方便连续划线划线分离后平板上显示的菌落照片74连续划线划线分离后平板上显示的菌落照片7③倾注平板法（PourPlate）Organismsareseriallydiluted,thenasmallamountisaddedtoanemptysterilepetridish,towhichmeltedagarat50ºCisadded.Thenmixtodistributetheorganisms.1ml1ml1ml1ml1ml1ml9ml9ml9ml9ml75③倾注平板法（PourPlate）Organismsar④平板涂布分离法（SpreadPlate）简单易行，但易造成机械损伤Liquidspecimenisspreadonthesurfaceofsolidagarwithasterilebentglassrod.76④平板涂布分离法（SpreadPlate）简单易行，但易造⑤选择性培养分离法为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。＊利用选择培养基进行直接分离＊富集培养77⑤选择性培养分离法为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，⑥单细胞（单孢子）分离法采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。78⑥单细胞（单孢子）分离法采用显微分离法从混杂群体中直接分离单⑦MembraneFilterWhenthereisasmallnumberoforganismsinalargeamountofliquid,theliquidisfilteredthroughamembraneandthenthemembraneisplacedonagarinapetridish.79⑦MembraneFilterWhenthereis二、微生物纯培养生长的测定方法描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。（一）微生物细胞数目的检测法直接法（血球计数板、比例计数法）间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法）（二）微生物生长量和生理指标测定法直接法(干重法，堆体积法)间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）80二、微生物纯培养生长的测定方法描述不同种类、不同生长状态的微1.血球计数板法811.血球计数板法14原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。1.血球计数板法82原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中2.涂片染色法应用：可同时计数不同微生物的菌数，适

于土壤、牛奶中细菌计数。方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取

0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代

入公式：每ml原菌液含菌数=视野中平均菌数×涂布面积/视野面积×100×稀释倍数832.涂片染色法应用：可同时计数不同微生物的菌数，适

3.平板菌落计数法843.平板菌落计数法173.平板菌落计数法★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完成操作），严格无菌操作；★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；★适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，★误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作★Astandardplatecount(viablecount)reflectsthenumberofviablemicrobesandassumesthateachbacteriumgrowsintoasinglecolony;platecountsarereportedasnumberofcolony-formingunits(CFU)perml(CFU/ml)orperg(CFU/g)ofsample.853.平板菌落计数法★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（1Whenweobservecolonies,wecannotassumeeacharosefromjustonecelloriginallyplantedonthemedium,however.Apair,chainorclusterofcellswhich'land'onthemediumincloseproximitytoeachothercanmultiplyandproduceasinglecolony.Thus,weusethetermcolony-formingunitwhenweconsiderthecommonoriginforthecellsofanycolony."ThistermisusuallyabbreviatedCFU.Colony-FormingUnit86Whenweobservecolonies,wec4.液体稀释法10n10n-210n-1874.液体稀释法10n10n-210n-1205.薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。885.薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物6.干重法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或80℃)、称重。一般干重为湿重的10%—20%，而一个细菌细胞一般重约10-12—10-13g。该法适合菌浓较高的样品。举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10–12~10–13g，液体培养物中细胞浓度达到2×109个/ml时，100ml培养物可得10~90mg干重的细胞。896.干重法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后7.比浊法原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。907.比浊法原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正8.生理指标法测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。918.生理指标法测含氮量24Table1.SomeMethodsusedtomeasurebacterialgrowth

MethodApplicationCommentsDirectmicroscopiccountEnumerationofbacteriainmilkorcellularvaccinesCannotdistinguishlivingfromnonlivingcellsViablecellcount(colonycounts)Enumerationofbacteriainmilk,foods,soil,water,laboratorycultures,etc.VerysensitiveifplatingconditionsareoptimalTurbiditymeasurementEstimationsoflargenumbersofbacteriainclearliquidmediaandbrothsFastandnondestructive,butcannotdetectcelldensitieslessthan107cellspermlMeasurementoftotalNorproteinMeasurementoftotalcellyieldfromverydensecultures

onlypracticalapplicationisintheresearchlaboratoryMeasurementofBiochemicalactivitye.g.O2uptakeCO2production,ATPproduction,etc.MicrobiologicalassaysRequiresafixedstandardtorelatechemicalactivitytocellmassand/orcellnumbersMeasurementofdryweightorwetweightofcellsorvolumeofcellsaftercentrifugationMeasurementoftotalcellyieldincultures

probablymoresensitivethantotalNortotalproteinmeasurements92Table1.SomeMethodsusedto第二节微生物的生长规律93第二节微生物的生长规律26由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长（synchronousgrowth），进行同步分裂的细胞称为同步细胞。同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。一、微生物的个体生长和同步生长94由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。一获得同步生长的方法：获得同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。95获得同步生长的方法：获得同步生长的方法主要有两类：28Helmstetter-Cummings法原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。96Helmstetter-Cummings法原理：一些细菌细Figure5.

Thesynchronousgrowthofabacterial

population.

Bycarefulselectionofcellsthathave

justdivided,abacterialpopulationcanbe

synchronizedinthebacterialcelldivisioncycle.

Synchronycanbemaintainedforonlyafewgenerations.

Figure.synchronousgrowth97Figure5.

Thesynchronousgro二、微生物的群体生长☆无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的，☆由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（Ｇenerationtime,G），代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间，有时也称为倍增时间。☆右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。右图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长的特征。1.无分支单细胞微生物的群体生长特征98二、微生物的群体生长☆无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌Bydefinition,bacterialgrowthiscellreplication–i.e.,growthoftheculture.Mostspeciesofbacteriareplicatebybinaryfission,whereonecelldividesinto2cells,the2cellsinto4,the4into8,etc.Ifthiscelldivisionoccursatasteadyrate–suchaswhenthecellshaveadequatenutrientsandcompatiblegrowingconditions–wecanplotnumbersofcellsvs.timesuchasonthegraphatright.Beforetoolong,wewillneedtoextendthepaperverticallyasthepopulationcontinuestodouble.Foraculturewherecellsdivideevery20minutes,onecellcanresultin16,777,216(i.e.,224)cellsafterjust8hours–barringnutrientdepletionorothergrowth-alteringconditions.1.无分支单细胞微生物的群体生长特征99Bydefinition,bacterialgrowtIfweweretoconvertourverticalaxistoalogarithmicscale–asonthegraphatright–wewillnotneedasmanysheetsofgraphpaper,andwewillfindthatasteadyrateofgrowthisreflectedasastraightline.(Ontheverticalaxis,thesamedistanceonthepaperiscoveredwitheachdoubling.)Thistypeofgraphpaperiscalledsemilogarithmicgraphpaperonwhichwewillbeplottingourclassresults.Thenumbersweplotwillfallonthegraphatthesameplacethelogarithmsofthesenumberswouldfallwhenplottedonconventionalgraphpaper.100IfweweretoconvertourvertTheexampleatrightshowsthetypeofgraphwemayobtainfromourclassdata.Wecanplotbothcolony-formingunits(CFUs)permlandabsorbanceonthesamegraph,rememberingthattheabsorbanceunitsshouldalsobeonalogarithmicscale.Ratherthan"connectingthedots,"wedrawthebeststraightlineamongourCFU/mlplotstorepresentthephasesofgrowth–lag,exponential,andthestartofthemaximumstationaryphase.101Theexampleatrightshowsthe★指数生长可以用下式表示：

b=B×2nB,b和t可由试验获得，n可通过上式计算得出，将等式两侧取对数重排后得：lgb=lgB+nlg2lgb-lgBlgb-lgB

lg20.301式中：B

为起始师细胞数目，

b

为指数生长某个时刻t时的细胞数目，

n

为世代数n==指数生长102★指数生长可以用下式表示：式中：n==指数生长35例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（B），经4h（

t）后增加到49，000，000（b），这样，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12★借助于n和t，还可以计算出不同培养条件下的代时G，

G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。103例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（B），经★代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。★代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为1~3h,然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。104★代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生一些细菌的代时菌名 培养基 培养温度 代时E.coli（大肠杆菌） 肉汤 37℃ 17minE.coli 牛奶 37 12.5 Enterobacteraerogenes（产气肠细菌） 肉汤或牛奶37 16~18 E.aerogenes 组合 37 29~44B. Cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤 30 18B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤 55 18.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶 37 66~87Streptococcuslactis（乳酸链球菌） 牛奶 37 26S.lactis 乳糖肉汤 37 48Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌） 肉汤 37 23.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344~46 Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 792~93 Nitrobacteragilis（活跃硝化杆菌） 组合 27 1200105一些细菌的代时菌名 培养基 培养温度 代时38BacteriumMe