肿瘤病因与发病学培训教学课件

2022/12/14肿瘤病因与发病学Pathogenesis,癌变机制Carcinogenesis2●长时间：数年、十几年、几十年●多因素:多种致癌因素●多基因:原癌基因、抑癌基因、凋亡调控基因…●多阶段：GDMUBL肿瘤发病学肿瘤细胞生物学特征获得持续的增殖信号生长抑制信号丢失或受阻代谢重编程抵抗凋亡永生化持续血管生成获得侵袭、转移能力逃避免疫监视基因组不稳定性肿瘤微环境改变表观遗传学改变2022/12/144一、细胞癌变学说的发展(1)慢性炎症学说与胚胎残余学说（20世纪50年代）慢性炎症学说：子宫颈炎与子宫颈癌炎症与肿瘤相关性文献：CNKI7912篇截止2018/12/4

肿瘤的发生、发展及治疗与炎症的关系

Medline:136300篇6(1)慢性炎症学说与胚胎残余学说（20世纪50年代）胚胎残余学说

如：颅咽管瘤—颅咽管上皮组织，

皮样囊肿—外、中胚层异位组织，

表皮样囊肿—外胚层异位组织，

畸胎瘤—三胚层，

脊索瘤—残留的脊索组织。

这些组织具有增殖分化的潜力，在一定的条件下发展为肿瘤

(2)基因突变学说与基因调控失常学说正常细胞在致瘤因子作用下发生基因突变并异常增殖并遗传下去证据肿瘤细胞染色体数量异常瘤细胞表型可以遗传环境致癌物诱导基因突变DNA修复障碍者，肿瘤发病率高78(2)基因调控失常学说基因未突变，表达调控异常而致瘤证据有些肿瘤染色体数目无异常肿瘤特异性抗原未被鉴定胚胎期基因的异常活性肿瘤细胞可被正常逆转

恶性肿瘤的逆转治疗

将肿瘤细胞逆转为普通细胞的关键基因9乳腺癌与HER2基因扩增人表皮生长因子受体2(HumanEpidermalgrowthFactorReceptor2，Her2)为原癌基因，与乳腺癌的发生、发展及预后密切相关，对治疗药物的选择至关重要(如赫赛酊,曲妥珠，Herceptin)。检测方法：

IHC：-,+，++，+++FISH：红色/绿色信号1.8-2.2CISHRT-PCR

乳腺癌患者Her2基因FISH法检测的临床应用研究10GDMCBL11(3)癌基因学说与抑癌基因学说Oncogene，癌基因活化使得细胞获得了自足的增殖信号1911年Rous用鸡肉瘤的无细胞滤液复制鸡肉瘤病毒癌基因与细胞癌基因1969年Huebner与Todaro提出癌基因学说12二、肿瘤细胞生物学特性2022/12/14（1）生长信号自给自足：原癌基因结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤。原癌基因的产物主要包括：①生长因子，如sis；②生长因子受体，如fms、erbB；③信号转导组分，如src、ras、raf；④细胞周期蛋白，如cyclinD；⑤细胞凋亡调控因子，如bcl-2；⑥转录因子，如myc、fos、jun。原癌基因产物：1.生长因子2.生长因子受体3.信号转导组分4.细胞周期蛋白5.细胞凋亡调节蛋白6.转录因子原癌基因功能相关肿瘤

sis生长因子

Erwing网瘤erb-B

受体酪氨酸激酶星形细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、

EGF受体肺癌、胃癌、唾腺癌fms受体酪氨酸激酶，CSF-1受体髓性白血病rasG-蛋白肺癌，结肠癌，膀胱癌，直肠癌src

非受体酪氨酸激酶

Rous肉瘤Abl-1

非受体酪氨酸激酶慢性髓性白血病rafMAPKKK，丝氨酸/苏氨酸激酶腮腺肿瘤vav信号转导连接蛋白白血病myc转录因子Burkitt淋巴瘤、肺癌、早幼粒myb转录因子结肠癌Fos转录因子骨肉瘤jun转录因子erb-A转录因子急性非淋巴细胞白血病bcl-1

cyclinD1B

细胞淋巴瘤原癌基因的类型原癌基因活化机制病毒癌基因启动子插入:SRC点突变:RAS,ErbB2基因扩增:UBE2C,SIS,MYC,ErbB2染色体重排或易位:MYC,BCR/ABL原癌基因低甲基化:RAS17Burkitt’slymphoma

c-myc基因染色体转位

GDMUBL1819原癌基因活化机制相关肿瘤Ras点突变肺癌，结肠癌Myc易位Burkitt淋巴瘤、肺癌bcl-2易位B细胞淋巴瘤erb-B2扩增乳腺癌、肺癌、胃癌Sis过度表达骨肉瘤（2）生长抑制信号的丢失与受阻抑癌基因Tumorsuppressorgene是一类对细胞生长起负调节作用的基因主要作用是抑制细胞的过度增殖丢失、突变或过甲基化时细胞恶性生长发现细胞融合实验HarrisH,etal.Suppressionofmalignancybycellfusion.Nature.1969Jul26;223(5204):363-8.“两次突变假说（twohithypothesis)”等位基因的杂合型丢失（lossofheterozygosity，LOH）20

抑癌基因的产物主要包括：①转录调节因子：如Rb、p53；②负调控转录因子：如Wnt；③周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI），如p21；④rasGTP酶活化蛋白：如NF-1；⑤DNA修复因子：如BRCA1、BRCA2；⑥磷酸脂酶：如PTEN；⑦细胞粘附分子：如DCC。四、抑癌基因学说Rb基因第一个被克隆的抑癌基因（1986）23Rb基因与E2F结合而调节细胞周期磷酸化/去磷酸化是其活性的调节机制（磷酸化后解除与E2F因子的结合）细胞周期G0、G1期，表现为去磷酸化，G2、S、M期则处于磷酸化状态RB基因缺失、突变失活，或者与肿瘤病毒产物结合而失活，诱导细胞增殖2425p53基因1983年被克隆，1989年确定为抑癌基因17p13.1，全长20kb，11外显子，10内含子，编码53kDa核蛋白与DNA和蛋白质结合，功能复杂（参与细胞周期，细胞凋亡，抑制肿瘤进展）具有突变热点区域缺失与突变与50%~60%人类肿瘤有关262728p16基因BRCA基因nm23基因APC基因

……29细胞周期调控基因Cyclins-CDKs-CDKIs

细胞周期调控与肿瘤

细胞周期与抗肿瘤治疗展望

细胞周期标记物在肿瘤中的应用30CyclinD鼻咽粘膜增生CyclinD鼻咽癌（3）基因组不稳定性（DNA修复基因）易感肿瘤的遗传性疾病与DNA修复基因异常有关Bloom综合征（先天性毛细血管扩张红斑及发育异常）着色性干皮病（患者在20岁之前会在紫外线暴露部位发生肿瘤，其中皮肤基底细胞癌，鳞状细胞癌及恶性黑素瘤的发生风险比正常人高出1000倍）Fanconi贫血人类DNA修复基因DNA修复基因与肝癌关系的研究进展31（4）凋亡调节基因紊乱Bcl-2及Bcl-2家族:Bcl2/Bax比值变化P53C-mycICE及ICE家族32BCL-2免疫组化染色P53基因突变PTEN基因突变Fas信号减弱，FasL表达上调：凋亡淋巴细胞逃避免疫反应。病毒表达抗凋亡蛋白抑制宿主细胞凋亡：

p35——BcL-2同源

HBX——结合P53E6——促进P53分解三氧化二砷诱导肿瘤凋亡As2O3作用PML基因治疗M3中国工程院院士王振义和中国科学院院士陈竺将As2O3

（俗称砒霜）与西药结合起来用于治疗白血病，使急性早幼粒细胞白血病患者的“五年无病生存率”从约25%跃升至约95%。这种联合疗法目前是全世界急性早幼粒细胞白血病的标准疗法34(5)肿瘤细胞获得永生化/无限增殖能力端粒及端粒酶与肿瘤干细胞telomereandtelomerase/CSC

35端粒1、概念：真核细胞线性染色体末端的一组重复DNA序列，通常由富含鸟嘌呤核苷酸(G)的短的串联重复序列组成。2、组成：

DNA：短的串联重复序列，不含功能基因。蛋白质：与单链富G端粒DNA结合的蛋白；与双链端粒DNA结合的蛋白3636GDMCBL37端粒酶1、概念：端粒酶是一种RNA与蛋白的复合体，它以自身RNA上的一个片段为模板通过逆转录合成端粒重复序列，并通过一种RNA依赖性聚合酶（如逆转录酶）机制加到染色体3’末端以延伸端粒。2、组成：RNA（作为模板）蛋白质（反转录酶）3、作用机制：在端粒DNA的复制时，端粒酶既有模板，又有逆转录酶这两方面的作用。其与端粒3´端结合后，以其RNA为模板，经反转录延长端粒，从而保护DNA双链末段免遭降解及相互融合。38

(6)血管生成与肿瘤

VascularformationandTumor多种生成因子促进血管生成释放、激活生长因子，重塑基质MMPS内皮细胞连接分子PECAM(CD31)补充平滑肌细胞PDGF诱导血管生成TNF-α刺激细胞外基质产生和促进血管生成因子释放二聚化多肽TGF-β诱导血管生成，形成，刺激血管生成FGF强诱导因子二聚化糖蛋白VEGF家族（5种）作用结构血管生成相关因子

血管生成因子和抑制因子共同控制血管生成的程度。大多数抑制物以活性形式存在，部分需细胞外蛋白水解酶作用后成为活性形式。主要有血管抑制素（angiostatin），内皮稳定素(endostatin)及血小板抑制4（PF-4）等。内源性血管生成抑制因子抑制血管生成

缺氧能诱导相关的缺氧诱导因子（hypoxiainducingfactor，HIF），缺氧可通过HIF使VEGF的过表达，因而刺激血管新生。缺氧能刺激血管生成因子的高表达

抑制肿瘤血管新生可抑制肿瘤生长，它可能具有高效、迅速、副作用小，也不会产生抗药物等优点。肿瘤间质血管显著增加(7)浸润和转移能力的获得包括六个步骤：原发肿瘤细胞游出并穿透组织基底膜；穿破血管或淋巴管壁进入血液循环；停留于靶器官淋巴管和毛细血管壁内皮细胞上；穿出血管侵入周围组织；继续生长、增殖；新生血管长入形成转移瘤；肿瘤扩散的分子基础从分子水平人为分为四步：分离：肿瘤细胞彼此分离，E-cadherin减少粘附：肿瘤细胞与胞外基质中层粘连蛋白（laminin，LN）和纤维连接蛋白（fibronectin，FN）相粘附；降解：即肿瘤细胞释放各种水解酶类，破坏其粘附部位的组织；移动：即水解酶类破坏粘附部位的组织，使肿瘤细胞得以向纵深移动远距离转移。一、肿瘤细胞与细胞外基质的黏附是转移的必要条件

黏附对肿瘤细胞的转移具双重性：一方面，黏附作用对转移起抑制作用；一方面，黏附是转移的先决条件。细胞黏附分子（celladhesionmolecules，CAMs）：是一类介导细胞-细胞、细胞-细胞外基质黏附的跨膜蛋白。

整合素家族（integrinfamily）：α6β1与肿瘤的侵袭性有关。

免疫球蛋白样黏附分子超家族（adhesionmoleculesoftheimmunoglobulinsuperfamily）：介导癌转移。

选择素家族（selectinfamily）

钙依赖黏附素家族（cadherinfamily）：抑制肿瘤的侵袭及转移。其它家族黏附分子家族：

细胞外基质是癌细胞转移的组织屏障，蛋白水解酶降解这种屏障。二、细胞外基质降解为肿瘤的转移形成通道

多种蛋白酶协同作用，并以级联反应的形式促进基质降解和细胞转移。细胞基质（extracellularmatrix，ECM）

与肿瘤扩散ECM是由胶原蛋白（collagens）、蛋白多糖（proteoglycans）和非胶原辅助糖蛋白（non-collageousaccessoryglycoproteins）三种大分子组成的三维网状结构。影响细胞的形态、分化、功能以及细胞内外的信息转换与相应细胞的粘附通过细胞表面的受体家族来实现的，其中以整合素家族（integrinsfamily）尤为重要。MMPs、TIMPs与肿瘤扩散基质金属蛋白酶类增强癌细胞的侵袭能力基底膜是阻止肿瘤转移的主要屏障，胶原是其主要组成成分之一，它能被基质金属蛋白酶（MMPs)降解。MMPs分为五类:

胶原酶类——MMP-1,8,13;

基质溶解素类——MMP-3，7，10，11，12；明胶酶类——MMP-2，-9；模型MMPs——MMP-14，15，16，17，24；其他——MMP19，20，23。

侵袭性恶性肿瘤的MMPs表达呈高水平。当MMPs的抑制物TIMPs表达增加时，癌细胞的侵袭能力弱。

金属蛋白酶抑制物TIMP-1、TIMP-2都是胶原酶基因家族的糖蛋白抑制物。TIMP-2主要与72000Ⅳ型胶原酶形成复合物而使酶活性丧失三、肿瘤细胞运动是转移的基本条件鼠淋巴瘤(RAW117-H10)鼠肝窦内皮细胞200C3b样因子旁分泌型产生细胞通过G蛋白发挥作用人恶性黑色素瘤（A2058）125自趋化素(autotoxin，ATX）人纤维肉瘤（HT1080）大鼠乳腺癌（MTLn3）产生细胞通过G蛋白及磷脂酶C（PLC）发挥作用鼠恶性黑色素瘤(B16－F1)55自分泌运动因子(autocrinemotitilyfactor，AMF)自分泌型靶细胞及作用产生细胞分子量/kD运动因子类型基因包括ras、myc、mos、raf、fes、erb-B-2等例如：

ras系统包括N-ras、K-ras和H-rasras活化不仅能使许多细胞癌变，同时还能使癌细胞具有转移的活性。四、有多个基因与转移相关（一）很多癌基因具有诱发或促进癌细胞转移的潜能

肿瘤转移抑制基因有nm23、WDNM1、WDNM2、Timp-1、E-cad、MHC-H-2K、Kiss-1等。例如：nm23基因有两种，即nm23-H1和nm-23-H2。nm23-H1的作用是抑制肿瘤转移，而nm23-H2可能与肺癌的分化程度相关。（二）某些基因具有抑制癌细胞转移的能力结直肠癌负相关E-CadNIH3T3负相关TIMP-1黑色素瘤负相关nm23人结肠癌正相关PLM59淋巴细胞癌正相关Tiam1人乳腺癌、结直肠癌正相关CD44人食管癌、直肠癌等正相关突变型DCC人乳腺癌、肺癌正相关突变型p53大鼠结肠癌正相关erb-B2NIH3T3正相关mosfesfmssrc神经纤维瘤正相关mycNIH3T3正相关ras肿瘤细胞类型与转移的关系基因与肿瘤转移相关的基因

五、上皮间质转化与肿瘤转移Epithelial-mesenchymaltransition,EMTMarkerE-cadherin,ZO-1,CKVimentin,FN,N-cadherinTwist,Snail,ZEB2022/12/1456（1）合成代谢加强、分解代谢降低

肿瘤组织蛋白质、核酸、脂类及核苷酸合成加强，氨基酸、核苷酸的分解代谢降低。

糖类分解加强，糖的消耗加强，糖酵解加强，糖类的合成减少。癌组织中糖、氨基酸、核苷酸等代谢均发生变化（8）肿瘤细胞代谢重编程（2）与增殖相关的酶类活性增强增殖相关的酶主要指核酸及蛋白质合成的酶（3）糖酵解速率增大

肿瘤无论在有氧、无氧的条件下均表现为糖酵解活跃，因此与之相关的酶活性均增强。（4）糖异生明显下降

当肝细胞癌变后，糖异生有关的酶活性明显下降，只有正常活性的1％。（5）合成糖原能力下降

肝癌时肝脏利用单糖合成糖原的能力降低，糖原减少，肝癌者可能发生低血糖。（6）氨基酸分解代谢减弱

机体为了补充肿瘤组织中蛋白质合成的需求，肌肉组织中的蛋白质分解加强，这是患者出现消瘦的原因之一。（7）核苷酸合成相关的酶活性增强

核苷酸合成相关的酶可能与肿瘤的恶性程度相关，恶性程度越大，酶的活性越高。（8）蛋白激酶及磷酸酶的活性均增强

蛋白激酶与细胞增殖相关，磷酸酶的活性升高可能是一种代偿机制，也许是为了对抗过高的蛋白激酶活性。（9）出现胎儿型同工酶肝癌前病变葡萄糖醛酸转移酶（O型）胃肠道肿瘤谷胱甘肽－S－转移酶（π型）多种恶性肿瘤谷胱甘肽－S－转移酶（P型）肝癌前病变、高分化肝癌谷胱甘肽－S－转移酶（A型）多种肿瘤碱性磷酸酶（非Regan型）多种肿瘤碱性磷酸酶（Regan型）肝癌DNA聚合酶（r）肝癌支链氨基酸转氨酶（I型）肝癌糖原磷酸化酶（胎儿型）肝癌果糖－1，6－二磷酸酶（肌型）肝癌、脑瘤丙酮酸激酶（M2型）肝癌醛缩酶（C型）肝癌醛缩酶（A型）肾癌、乳腺癌己糖激酶（III型）肝癌己糖激酶（II型）在肿瘤中的表达同工酶

肿瘤标记物（tumormarker）是指由肿瘤细胞产生、与肿瘤性质相关的一类分子，这类分子不存在于正常成人组织，而是在胚胎或肿瘤组织。意义：它们的存在或量变能提示肿瘤的性质，并有助于了解肿瘤的起源、分化，从而有助于肿瘤的诊断、分类、预后判断及转导治疗。肿瘤细胞具有比较特异的标记物肿瘤标记物应具有以下特点：①标记物的变化与肿瘤生长、转移等有直接的定性、定量的关系。②具有特异性，即能与正常细胞、良性肿瘤区别。③检测标记物的方法应简便。

多发骨髓瘤

多发骨髓瘤、慢性淋巴性白血病

22.5－45KDa

12KDa蛋白类

本固蛋白

β2微球蛋白

库兴氏综合症

胚胎绒毛膜、睾丸肿瘤

4.5KDa45KDa激素类

促肾上腺皮质激素

人绒毛膜促性腺激素

肝肿瘤

骨、肺、白血病、肉瘤

肝、胃、结肠肿瘤

肝、白血病

160Kda

95Kda

80KDa

135KDa

34KDa酶类标记物

醛缩酶

碱性磷酸酶

谷胱甘肽转移酶

乳酸脱氢酶

前列腺特异性抗原

卵巢、子宫内膜癌

卵巢、乳腺癌

糖蛋白>200KDa

糖蛋白400KDa糖类抗原标记物

CA125

CA19-9

肝癌

结肠、肺癌

结肠、直肠、乳腺癌

糖蛋白70KDa

80KDa糖蛋白600KDa胚胎性抗原标记物

甲胎蛋白

β癌胚抗原

癌胚抗原相关肿瘤性质肿瘤标记物分类前列腺前列腺酸性磷酸酶（PAP）甲状腺（中胚叶肉瘤）降钙素（CT）滋养层细胞、干细胞人绒毛膜促性腺激素(hCG)肝、干细胞胎儿甲种球蛋白（AFP）结肠、肺、乳腺、胰腺癌胚抗原（CEA）肿瘤的部位标志物临床上有用的肿瘤标记物Warburg效应德国生理学家Otto.Warburg(O.H.Warburg,1883～1970)，中文翻译是瓦尔堡，早在1924年就提出一个观点，认为癌症的产生是由于细胞糖无氧酵解增强加上氧消耗量降低造成的。这个被称为瓦尔堡(Warburg)假说。获1931年的诺贝尔奖。当线粒体功能受损后，细胞则通过增强无氧酵解来提供能量，葡萄糖代谢至丙酮酸(pyruvate)后不再通过线粒体的三羧酸循环进行有氧氧化，而是通过乳酸脱氢酶（LDH），转变成乳酸排出细胞。66（9）肿瘤微环境实质与间质细胞相互作用低氧炎症细胞因子2022/12/14(10)免疫逃避肿瘤相关抗原/肿瘤特异抗原T细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞PD1/PDL1系统与肿瘤免疫抑制2022/12/14陈列平教授2022/12/14(11)表观遗传学与肿瘤Epigenetics:非DNA突变引起的遗传变化甲基化、乙酰化、miRNA、lncRNA……2022/12/14表观遗传学DNA甲基化组蛋白翻译后修饰染色质重塑微小RNA调控甲基化乙酰化磷酸化苏素化泛素化甲基化修饰酶组蛋白赖氨酸甲基转移酶（HKMT）组蛋白精氨酸甲基转移酶(PRMT)SET家族基因miRNA真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA大小长约20~25个核苷酸成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译miRNA参与各种各样的调节途径71miRNA特点广泛存在于真核生物中,是一组不编码蛋白质的短序列RNA,它本身不具有开放阅读框架(ORF);通常的长度为18～25nt,但在3′端可以有1～2个碱基的长度变化;成熟的miRNA5′端有一磷酸基团,3′端为羟基,这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来；多数miRNA还具有高度保守性、时序性和组织特异性。72miRNAs与癌症约50%得到注解的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（fragilesite）。这说明miRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用，这些miRNAs所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人员将miRNA命名为“oncomirs”73充当抑癌基因作用的miRNAmir-125b-1:位于染色体的11q24脆性位点，乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌病人中11q924位点常有缺失，而这一位点并不存在已知的抑癌基因。miR-15a和miR-16-1:负调控BCL2，这两个miRNAs的缺失或下调，导致了BCL2表达的升高，促进了白血病、淋巴瘤和前列腺癌的发生。mir-143和mir-145:结肠癌中明显下调。其发夹结构的前体分子在肿瘤和正常组织中含量相似，这表明，可能是由于其成熟过程受到破坏。mir-143和mir-145的肿瘤抑制基因功能不仅仅局限于结肠癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、淋巴癌等细胞系中其表达量也明显下调

74肺癌病人的let-7表达显著降低，并且这导致这些病人更差的预后，非小细胞肺癌病人的let-7表达水平越低，其预后越差，术后生存期越短。体外组织培养实验表明，在人的肺癌细胞中瞬时的表达let-7可以抑制细胞的增殖，这也说明let-7在肺组织中可能是一个抑癌基因。实验表明，在人类细胞中let-7通过3’非翻译区域直接抑制癌基因Ras的表达。大约有15-30%的人类肿瘤都含有Ras突变，而激活的突变导致这个蛋白表达上升可以引起细胞转化。因此，能够调节Ras蛋白表达的let-7，可以控制细胞的增殖速度。75充当癌基因作用的miRNAmiR-21:胶质母细胞瘤中表达量比正常组织高5-100倍。反义核酸的研究发现这个miRNA通过抑制凋亡而并非影响细胞增殖控制细胞生长，这预示着这个miRNA具有癌基因的功能。另一项独立研究，利用芯片来检测肿瘤和正常组织的245个miRNAs的表达水平，也发现胶质母细胞瘤中miR-21表达升高。由于mir-21不是一个大脑特异性的基因，在乳腺癌样品中表达也有增加，这个基因可能在肿瘤发生中起到广泛的作用。76Metzler等人发现，在BIC基因上具有一段138个核苷酸的保守序列，编码mir-155的发夹结构。该研究组还发现在Burkitt淋巴瘤中，miR-155表达量上升了100倍，此外的研究也发现，Hodgkin淋巴瘤等肿瘤中miR-155水平也有提高。因此，mir-155可能是作为一个癌基因和MYC协同作用，而其正常功能是在B细胞的分化中起作用，其可能的靶基因是那些对抗MYC信号通路的基因。77miRNA鉴定及功能研究手段目前鉴定miRNA常用的方法包括直接克隆鉴定，miRNA芯片分析和生物信息学预测。计算机预测的miRNA必须经过RT-PCR或Northern试验分析才能鉴定，另外也可以通过miRNAmimics和inhibitors从功能上进行实验鉴定。78miRNAmimics是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。而miRNAinhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。79GDMCBL80MechanismofRNAi(shRNA/miRNA）miRNA与肿瘤microRNA

肿瘤发生

miR-9

神经母细胞瘤miR-10b乳腺癌miR-15、miR-15a白血病、垂体腺瘤

miR-16、miR-16-1

白血病、垂体腺瘤

miR-17-5p、miR-17-92肺癌、淋巴瘤miR-20a肺癌、淋巴瘤miR-21乳腺癌、胆管腺癌、头颈癌、白血病、宫颈癌miR-29、miR-29b白血病，胆管腺癌miR-31结肠直肠癌miR-34a胰腺癌

miR-96结肠直肠癌miR-98头颈癌

miR-103胰腺癌miR-107

白血病、胰腺癌

miR-125a、miR-125b神经母细胞瘤、乳腺癌miR-128胶质母细胞瘤miR-133b结肠直肠癌miR-135b结肠直肠癌82miR-143结肠癌、宫颈癌miR-145乳腺癌、结肠直肠癌miR-146甲状腺癌miR-155乳腺癌、白血病、胰腺癌miR-181、miR-181a、miR-181b、miR-181c肺癌、白血病、胶质母细胞瘤、甲状腺癌

miR-183直肠结肠癌miR-184

神经母细胞瘤miR-196a-2

胰腺癌miR-221胶质母细胞瘤、甲状腺癌、胰腺癌

miR-222甲状腺癌miR-223

白血病miR-301胰腺癌miR-376

胰腺癌let-7、let-7a、let-7a-1、hsa-let-7a-2、let-7a-3肺癌、结肠癌83MaturemiRNA的检测利用PAP（PolyAPolymerase）加尾法通用性高；适用于同一样本检测多种miRNA经济、方便GDMCBL84miRNAPrimerArray个性化PrimerArray提供的六种排布形式，如上所示（不同颜色代表检测样品，同色中的各孔代表检测的各个基因）：A.每96-well-Plate可进行8基因、12个样品的检测；B.每96-well-plate可进行16基因、6样品检测；C.每96-well-Plate可进行24基因、4样品检测；D.每96-well-Plate可进行32基因、3样品检测；E.每96-well-Plate可进行48基因、2样品检测；F.每96-well-Plate可进行96基因、单样品检测。85miRNATarget的分析

研究发现，在哺乳动物中，miRNAs的基因抑制作用是通过其5’一段长为6－8nt的核苷酸与mRNAs3’端非翻译区域相结合实现的。一般这段核苷酸位于miRNA序列5’的2~8个nt，被称为seed区。/pubmed应用微阵列芯片分析人不同分化鼻咽癌细胞株miRNA的表达.在线工具：MiRanda、TargetScan、PicTar、DIANA-microT软件/86肿瘤是一种多基因病生长因子基因生长因子受体基因非受体酪氨酸激酶基因蛋白酪氨酸激酶基因G蛋白基因转录因子基因凋亡相关基因细胞周期调控蛋白基因DNA修复基因细胞分化基因……2022/12/14三、癌变过程的多阶段性与多步多击性癌变过程的启动、促进与进展启动:致癌物引起染色体基因突变或基因外DNA突变促进:阈下剂量致癌剂刺激后促癌剂再多次刺激诱导癌变进展:转化细胞成瘤并出现异质性8889致癌物与促癌物的协同作用致癌的二阶段学说致癌物激发过程促癌物促进过程90癌变的发生是个多阶段的过程正常上皮

过度增生

早期腺瘤

中期腺瘤

晚期腺瘤

结肠腺癌癌变多阶段的分子基础体外转化实验中癌基因协同效应（invitro）Land实验表明，在绝大多数情况下单个癌基因并不足以引起细胞转化

H-Ras转染成纤维细胞后可使其发生停泊非依赖性生长而在软琼脂中产生集落，但在连续传代时细胞死亡，也不能在裸鼠体内产生肿瘤。把两个癌基因(如H-Ras与活化的Myc)一起导入成纤维细胞就能使其发生有效转化。Land据此认为H-Ras基因产物使细胞发生形态改变并降低对血清需求而导致其出现停泊非依赖性生长，而Myc基因产物则使细胞永生化。91转基因动物模型提供了癌基因协同效应的体内证据（invivo）1987年Sinn等利用转基因动物模型成功地证实了癌基因在体内的协同效应以小鼠乳腺肿瘤病毒MMTV作为调控序列，构建MMTV-c-Myc转基因，所产生的转基因小鼠在3～4个月时发生乳腺肿瘤，而且肿瘤呈散发性分布，局灶性成长而构建的MMTV-Ras转基因所形成的转基因鼠发瘤时间较MMTV-c-Myc早；当上述两种转基因鼠交配所获的F1代小鼠，其发生乳腺肿瘤的速率大大高于单一携带Myc或Ras的转基因鼠。92四、癌基因学说在肿瘤防治中的意义肿瘤的基因诊断从基因的角度对疾病作出诊断,又称DNA诊断基因诊断的利用例子：地中海贫血乳腺癌HER2FISHtest淋巴瘤染色体异位检测93IGH/BCL2t(14;18)(q32;q21)

染色体易位IGH/MYCt(8;14)(q24;q32)

染色体易位IGH/CCND1t(11;14)(q13;

q32)

染色体易位API2/MALT1t(11;18)(q21;q21)染色体易位IGH/MALT1t(14;18)(q32;q21)染色体易位BCR/ABLt(9;22)染色体易位【费城染色体】基因诊断的内容明确特定基因是否正常明确疾病相关基因的异常情况基因扩增情况基因酶切位点情况基因连锁分析基因转录产物分析94基因诊断基因诊断的方法DNA重组技术细胞成分示踪技术mRNA与蛋白的检测基因诊断流程95肿瘤基因诊断例子9697Her2基因检测流程:石蜡组织标本IHC检测再用FISH方法检测—1+3+2+—+Herceptin治疗+再用FISH方法检测Herceptin治疗FISH检测+—再用FISH方法检测+98疾病名称检测探针标记颜色探针定位探针名称乳腺癌GLPHer2/CSP17红/绿Her2：17q11.2-q12CSP17:17p11.1q11.1CSP17:17号染色体着丝粒正常:2红/2绿异常:红信号大于2为异常细胞(绿色信号不少于2个的细胞)Her-2基因FISH

探针组99DAPI染色后与HE切片对比图观察浸润部分导管内癌100结果判断统计Ratio值（计数浸润性部分的20个细胞）

Ratio值＝20个细胞核中红信号总数/绿信号总数

Ratio＜1.8为阴性结果

Ratio＞2.2或众多信号连接成簇时可不计算为阳性结果比值2～4为低度扩增

4～10为中度扩增

>10为高度扩增Ratio在1.8-2.2之间时，则需要再计数20个细胞核中的信号。如仍为临界值，则应在FISH检测报告中注明。GDMUBLA.无须计数的大簇团信号（高度扩增）B.

颗粒状信号（R>10，高度扩增）C.

须计数的颗粒状信号（R=3.5，低度扩增）ACBHer-2基因扩增状况102Her-2基因无扩增情况红信号数>2，同时绿信号非整倍体R<1.8，无扩增红信号与绿信号均为两点，R=1103荧光原位杂交与免疫组化检测Her-2结果比较104IHC01+2+3+FISH无扩增

1334020扩增

22102943总数(n=15)(n=5)(n=14)(n=29)（n=63）Her2表达IHC（2+）标本中，基因扩增率为71.41%Her2表达IHC（3+）标本中，基因扩增率为100%（文献报道：90-95%）105>30%的肿瘤细胞全部的细胞膜高强度着色免疫组化（3+）与FISH对比图×40×100浸润性导管癌Ⅱ级IHC：+++FISH：呈簇团状高度扩增×100106免疫组化（2+）与FISH对比图1.>30%的肿瘤细胞全部的细胞膜弱至中等着色×40浸润性导管癌Ⅱ级IHC：++FISH：Ratio>5，中度扩增×100107免疫组化（2+）与FISH对比图2.>30%的肿瘤细胞全部的细胞膜弱至中等着色×40×100浸润性导管癌Ⅱ级IHC：++FISH：Ratio＝1.45，无扩增GDMUBL108>30%的肿瘤细胞弱的着色免疫组化（1+）与FISH对比图1×40×100浸润性导管癌Ⅱ级IHC：+FISH：Ratio＝1.62，无扩增109免疫组化（1+）与FISH对比图2×40×100浸润性导管癌Ⅲ级IHC：+FISH：簇状扩增>30%的肿瘤细胞弱的着色110免疫组化（－）与FISH对比图1×100×40浸润性导管癌Ⅱ级IHC：－FISH：Ratio＝1.02，Her2基因无扩增<30%的肿瘤细胞弱的着色或不着色111免疫组化（－）与FISH对比图2浸润性导管癌Ⅱ级IHC：－FISH：呈簇状扩增肿瘤细胞不着色×40×100112FISH技术检测染色体易位在淋巴瘤分型中的应用GDMUBL113淋巴瘤的诊断与分型难HE＋IHC+cytogenesis=解决!GDMUBL114

不同类型的淋巴瘤有各自不同的染色体易位使控制细胞发育分化过程中的关键蛋白失活与淋巴瘤的发生密切相关GDMUBL115IGH/BCL2t(14;18)(q32;q21)

染色体易位IGH/MYCt(8;14)(q24;q32)

染色体易位IGH/CCND1t(11;14)(q13;

q32)

染色体易位API2/MALT1t(11;18)(q21;q21)染色体易位IGH/MALT1t(14;18)(q32;q21)染色体易位BCR/ABLt(9;22)染色体易位【费城染色体】目前开展的染色体易位检测（6种）：GDMUBL116

t(14;18)(q32;q21)

染色体易位意义：

t(14;18)易位后形成的IGH/BCL2基因能编码完整BCL2

蛋白，IGH基因附近的增强子使BCL2过表达

t(14;18)为FL的标志（低级别更易出现）,检出率达93%～100%DLBCL20%～30%出现易位影响检出率的原因：

石蜡标本中DNA的降解

FL3b接近DLBCL，其易位率低，影响总体检出率53CregionVregionJregion14q32region3MCRMBR18q21regionIGH/BCL2DualColor,DualFusionTranslocationProbe

检测探针标记颜色探针定位

IGH/BCL2green/orangeIGH:14q32

BCL2:18q21

正常:2O/2G

异常:1O/1G/1F阳性标准:>7%的细胞出现黄色融合信号118探针杂交示意图肿瘤细胞核IGH/BCL2双色双融合易位探针杂交后显示1O1G2F信号细胞核IGH/BCL2双色双融合易位探针杂交后显示2R2G信号GDMUBL119病例1：男，74y

腹腔肿物；FISH：54%的细胞可见融合信号；

诊断：FLⅡ~Ⅲ。4×40×100×GDMUBL120病例2：女、36

颈部肿物抗炎治疗后（出现变性坏死）诊断：DLBCLFISH：阳性，10%的细胞可见融合信号

40×IHC:BCL2100×肿瘤的基因治疗基因治疗概念将遗传物质转入机体细胞，达到治疗（预防）疾病的目的美国已经批准613项试验性基因治疗，欧洲批准了213项，我国也批准了3项，包括肿瘤和血友病。全世界有超过4000名患者参与了实验性基因治疗。

基因治疗方式基因原位修复基因增补121

基因治疗基因增补疗法需要考虑的因素靶点选择目的基因导入的途径与方法（invivoandexvivo)病毒介导法化学介导法物理介导法122基因治疗肿瘤基因治疗策略直接应用抗癌基因治疗抑癌基因如p53重组人p53腺病毒注射液（商品名今又生）。2003年10月16日，国家食品药品监督管理局批准重组人p53腺病毒注射液新药证书，意味着世界上第一个癌症基因治疗药物在中国诞生反义核酸或核酶“自杀基因”：HSV-TK增强肿瘤免疫原性：B7，MHC增强抗癌细胞免疫因子：ILs，TNF逆转肿瘤细胞耐药：多药耐药基因（MDR）