植酸酶毕赤酵母基因工程菌发酵条件研究(完整版)实用资料

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要范围,同时停加甘油。植酸酶毕赤酵母基因工程菌发酵条件研究（完整版）实用资料(可以直接使用，可编辑完整版实用资料，欢迎下载）3.4.5正交设计接种量、转速、生长pH值、D0四因素三水平的正交实验设计。表2因素和水平表Table2Thechartoffactorsandlevels接种量转速生长pHDO(%(rpm(%水平254005.030-40水平3105005.540—503.5植霞爵赢丽而靳盯—————————————~发酵结束后放罐,得到发酵液即含植酸酶的粗酶液。由于本实验仅仅是傲一尝试,所以只取少量发酵液进行实验。将发酵液过滤除菌,去掉酵母细胞。取上清液并将其放于平皿中,在40℃下真空浓缩,去除粗酶液中部分水,达到浓缩植酸酶的目的。以1:1的比例将浓缩液与灭菌的麦麸混合(v/w,mYg,放予40℃烘箱中处理5h,使含水量达到25%,即得到了植酸酶成品。测成品中的植酸酶酶活。4.试验结果4.1培养基4.1.1辅料(x1酶活力(KU/mL辅料名称图1.不周辅料对产酶的影响Fig.1TheeffectofcomplementSOilphytaseactivity图1结果表明,毕赤酵母基因工程菌在麦芽汁.麦麸培养基、麦芽汁.米糠培养基、麦芽汁一玉米粉培养基三种培养基中的酶活力。均高于对照,其中以麦芽汁.麦麸培养基的酶活力最高,麦芽汁一玉米粉培养基的酶活力最低,麦芽汁.米糠培养基的酶活力介于两者之间。因此选用麦麸作为培养基辅料,有利于酶活力的提高,即辅料x1为麦麸。4.1.2辅料添加量(X2酶活力(KU/mL麦麸添加量(g图2.麦麸添加量对产酶的影响Fig.2Theeffectofbran’squantityOilphytaseactivity图2结果表明,添加麦麸可以提高植酸酶的酶活力,随着麦麸在培养基中含量的增加,植酸酶的酶活力呈上升趋势。在1009麦芽粉中添加158麦麸和添加209麦麸的植酸酶的酶活力几乎差不多。但考虑到培养基成本的问题,选择麦麸的添加量为每1009麦芽粉添加159。辅料麦麸的添加量x2为159。4.1.3氨源补加生长阶段补加蛋白胨浓度(x3图3结果表明,在生长阶段补加蛋白胨,不论18h还是35h的菌体浓度都高于对照,酶活力也高于对照。可见,蛋白胨对菌体生长和酶活力的提高都有促进作用,蛋白胨浓度为3%时,酶活力最高,所以在生长阶段蛋白胨浓度即X3为3%。蛋白胨浓度(%图3.生长阶段添加蛋白胨与苗体浓度和产酶的关系Fig.3TheeffectofpeptoneconcentrationonYeastconcentrationandphytaseacth,ityatgrowthphase诱导阶段补加蛋白胨浓度(】(4酶活力(KU,mL蛋白胨的添加重(%图4.诱导阶段添加蛋白胨对产酶的影响FigATheeffectofpeptoneconcentrationonphytaseactivityatinducingphase图4结果表明,在诱导培养基中添加1%、2%、3%的蛋白胨,发酵液的酶活力略高予对照,而在诱导培养基中添加4%、5%的蛋白胨,其发酵液的酶活力明显低于对照。说明蛋白胨在~定浓度范围内,可提高酶活力。考虑到在诱导阶段补加蛋白膝对产酶没有显著影响,而且会增加培养基的成本,故在以后的实验中,在诱导表达阶段不补加蛋白胨即(4为0。4。2植酸酶基因工程菌摇瓶培养条件4.2.1种龄(YT致谢本文是在导师王红宁教授精心指导下完成的。三年来，王老师对我的生活、学习和研究等方面都给予了悉心的指导和关怀，培养了我独立科研的能力，而王老师开阔的思路、严谨求实、勇于攀登科技高峰的科学品质更潜移默化地影响了我，激励着我在科学的道路上继续前进ｌ在此论文完成之际，我向培养了我的导师致以最衷心的感谢！梁如玉副教授、廖德聪老师、陈惠副教授、柳萍老师、黄勇老师、赵海霞老师、吴琦博士、周生博士、李建文博士、邹立扣博士、胡惠琼博士，在我论文设计及完成过程中，提出了许多宝贵和富有建设性的意见，在此表示感谢！本课题组的许钦坤，玉米所的张建辉，以及本实验室的谢涛、李成忠、张瑞强、郑连军、王钢、陈萍、余祖华、陈建华、汪洋等同学在我实验过程中都给予了极大的帮助和关心，在我实验出现困难的时候，是他们给了我精神动力和智力支持，帮我顺利度过难关。在此，对他们一并表示最衷心的感谢。最后，感谢我的家人和朋友，他们一直相信我，一贯支持我，是我论文顺利完成的坚强后盾。要范围,同时停加甘油。3.4.5正交设计接种量、转速、生长pH值、D0四因素三水平的正交实验设计。表2因素和水平表Table2Thechartoffactorsandlevels接种量转速生长pHDO(%(rpm(%水平254005.030-40水平3105005.540—503.5植霞爵赢丽而靳盯—————————————~发酵结束后放罐,得到发酵液即含植酸酶的粗酶液。由于本实验仅仅是傲一尝试,所以只取少量发酵液进行实验。将发酵液过滤除菌,去掉酵母细胞。取上清液并将其放于平皿中,在40℃下真空浓缩,去除粗酶液中部分水,达到浓缩植酸酶的目的。以1:1的比例将浓缩液与灭菌的麦麸混合(v/w,mYg,放予40℃烘箱中处理5h,使含水量达到25%,即得到了植酸酶成品。测成品中的植酸酶酶活。4.试验结果4.1培养基4.1.1辅料(x1酶活力(KU/mL辅料名称图1.不周辅料对产酶的影响Fig.1TheeffectofcomplementSOilphytaseactivity图1结果表明,毕赤酵母基因工程菌在麦芽汁.麦麸培养基、麦芽汁.米糠培养基、麦芽汁一玉米粉培养基三种培养基中的酶活力。均高于对照,其中以麦芽汁.麦麸培养基的酶活力最高,麦芽汁一玉米粉培养基的酶活力最低,麦芽汁.米糠培养基的酶活力介于两者之间。因此选用麦麸作为培养基辅料,有利于酶活力的提高,即辅料x1为麦麸。4.1.2辅料添加量(X2酶活力(KU/mL麦麸添加量(g图2.麦麸添加量对产酶的影响Fig.2Theeffectofbran’squantityOilphytaseactivity图2结果表明,添加麦麸可以提高植酸酶的酶活力,随着麦麸在培养基中含量的增加,植酸酶的酶活力呈上升趋势。在1009麦芽粉中添加158麦麸和添加209麦麸的植酸酶的酶活力几乎差不多。但考虑到培养基成本的问题,选择麦麸的添加量为每1009麦芽粉添加159。辅料麦麸的添加量x2为159。4.1.3氨源补加生长阶段补加蛋白胨浓度(x3图3结果表明,在生长阶段补加蛋白胨,不论18h还是35h的菌体浓度都高于对照,酶活力也高于对照。可见,蛋白胨对菌体生长和酶活力的提高都有促进作用,蛋白胨浓度为3%时,酶活力最高,所以在生长阶段蛋白胨浓度即X3为3%。蛋白胨浓度(%图3.生长阶段添加蛋白胨与苗体浓度和产酶的关系Fig.3TheeffectofpeptoneconcentrationonYeastconcentrationandphytaseacth,ityatgrowthphase诱导阶段补加蛋白胨浓度(】(4酶活力(KU,mL蛋白胨的添加重(%图4.诱导阶段添加蛋白胨对产酶的影响FigATheeffectofpeptoneconcentrationonphytaseactivityatinducingphase图4结果表明,在诱导培养基中添加1%、2%、3%的蛋白胨,发酵液的酶活力略高予对照,而在诱导培养基中添加4%、5%的蛋白胨,其发酵液的酶活力明显低于对照。说明蛋白胨在~定浓度范围内,可提高酶活力。考虑到在诱导阶段补加蛋白膝对产酶没有显著影响,而且会增加培养基的成本,故在以后的实验中,在诱导表达阶段不补加蛋白胨即(4为0。4。2植酸酶基因工程菌摇瓶培养条件4.2.1种龄(YT致谢本文是在导师王红宁教授精心指导下完成的。三年来，王老师对我的生活、学习和研究等方面都给予了悉心的指导和关怀，培养了我独立科研的能力，而王老师开阔的思路、严谨求实、勇于攀登科技高峰的科学品质更潜移默化地影响了我，激励着我在科学的道路上继续前进ｌ在此论文完成之际，我向培养了我的导师致以最衷心的感谢！梁如玉副教授、廖德聪老师、陈惠副教授、柳萍老师、黄勇老师、赵海霞老师、吴琦博士、周生博士、李建文博士、邹立扣博士、胡惠琼博士，在我论文设计及完成过程中，提出了许多宝贵和富有建设性的意见，在此表示感谢！本课题组的许钦坤，玉米所的张建辉，以及本实验室的谢涛、李成忠、张瑞强、郑连军、王钢、陈萍、余祖华、陈建华、汪洋等同学在我实验过程中都给予了极大的帮助和关心，在我实验出现困难的时候，是他们给了我精神动力和智力支持，帮我顺利度过难关。在此，对他们一并表示最衷心的感谢。最后，感谢我的家人和朋友，他们一直相信我，一贯支持我，是我论文顺利完成的坚强后盾。中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2005,25(8:25～30植物耐盐相关基因克隆与转化研究进展3崔润丽2刁现民1,233(1河北省农林科学院谷子研究所国家谷子改良中心石家庄050031(2河北师范大学生命科学学院石家庄050016摘要土地盐渍化是农作物产量降低的一个重要因素。从盐分对植物的伤害、植物耐盐的机理、耐盐相关基因的克隆及转耐盐基因植物等方面论述了植物的耐盐机理及转耐盐基因植物的研究现状,分析了耐盐性状的复杂性,并对前景进行了展望。关键词盐害耐盐机理基因克隆转基因收稿日期:2005202131修回日期:20052052273河北省自然科学基金资助项目(C2004000697,河北省农林科学院资助项目(A032120210533通讯作者,电子信箱:xmdiao@土地盐渍化是限制农作物生长、重的非生物胁迫之一取两种措施,;,且随着大量化学物质的加入加重了土壤的次生盐渍化,因此培育耐盐的作物品种就日益重要。国内外学者研究了盐分对植物的伤害、植物耐盐的机理,克隆了一些耐盐相关基因,并通过耐盐相关基因转化,获得了一些耐盐性提高的转基因植物,展示了诱人的前景。本文从植物耐盐的机理、耐盐相关基因的克隆及转耐盐基因植物等几个方面进行综述,对该领域的前景进行了展望。1植物耐盐的机理盐分对植物胁迫分为渗透胁迫、离子伤害、离子不平衡或营养缺乏三类,渗透胁迫和离子伤害目前被认为是对植物危害的两个主要过程[1]。植物的耐盐性总的来说可分为形态耐盐和生理耐盐。形态耐盐性是特殊环境下的少数耐盐植物进化出特殊器官泌盐和稀盐,如海滩的红树和碱蓬属植物。对多数植物来说,则是生理耐盐。本文主要讨论生理性耐盐的研究进展。1.1盐胁迫下渗透机制的调节在盐胁迫下,由于外界渗透压较低,植物吸收水分,。植物为了避免这种,降低细胞的渗透势,从而使水分顺利地进入植物体内,保证植物正常生理活动的进行。渗透调节分为无机渗透调节和有机渗透调节。参与无机渗透调节的离子主要是Na+、K+、Ca2+和Cl2。赵可夫等[2]研究发现盐生植物的无机渗透剂以Na+、K+和Cl2为主,而非盐生植物高粱、芦苇等主要以K+和有机渗透物质为主。说明盐生植物和非盐生植物在渗透调节物质方面的不同。植物在逆境中会主动积累一些有机渗透物质,其中小分子化合物有如下几类:第一类是多元醇,如甘油、山梨醇、甘露醇、右旋肌醇甲醚等;第二类是糖类,如蔗糖、海藻糖等;第三类是氨基酸及其衍生物,如脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱等。这些物质对细胞无毒,对代谢过程无抑制作用,它们的积累在一定范围内可以维持盐胁迫下细胞的正常膨压和代谢功能。这些保护渗透物质在植物抗盐研究中已越来越受重视。1.2盐胁迫改变代谢途径在盐胁迫下,一些盐生植物能够通过改变其自身的代谢途径而适应高盐度的生存环境。一些肉质植物,如豆瓣绿属植物、马齿苋科植物以及禾本科植物冰草等,在盐渍或水分胁迫下可以改变光合碳同化途径,即由C3途径变为CAM途径。CAM植物在夜间开放气孔进行CO2吸收和固定,白天气孔关闭减少蒸腾量。这种转变的机理,赵可夫等[2]认为主要是Cl-活化了细胞中的RUBP羧化酶所导致的。并通过测量CO2固定和PEP羧化酶活性证实光合作用转变是受盐诱导的。中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.25No.82005整个光合作用途径的改变是一个十分复杂的过程,涉及到的基因很多,利用改变植物光合作用途径提高植物耐盐性十分困难。1.3盐胁迫下离子的区域化大量的研究表明,植物将吸收的Na+、Cl-等离子积累在液泡中,减少干扰细胞质和叶绿体等的生化代谢过程,这种作用称为离子的区域化作用。Flowers等[3]实验证明,盐生植物和非盐生植物的细胞对Na+都非常敏感,Na+、Cl-的区域化分配是植物对盐渍环境适应的结果。由于离子区域化,使得液泡中Na+浓度远远高于细胞质中的浓度。如高浓度NaCl条件下,生长多代的烟草悬浮细胞系液泡中,积累的NaCl浓度相当高,可达800mmol/L,而细胞质NaCl的浓度仍保持在100mmol/L[4]。研究表明,在NaCl胁迫下,Na+通过质膜进入细胞只有25%左右为主动运输,输,但Na+度的主动运输过程[5]+Cl-Niu[6]滨藜根和叶子质膜上H+2ATPase基因的表达。Dopont[7]证明当外界环境Na+浓度提高,植物通过Na+/H+逆向转运蛋白将Na+转运到液泡中,实现区域化,减少细胞质中的Na+浓度,且在滨藜中Na+/H+逆向转运蛋白活性是被NaCl诱导的。因此,深入研究液泡膜转运蛋白对揭示作物耐盐机理是至关重要的。1.4盐分增加质膜的透性盐分能增加质膜的透性,同时当盐胁迫时,植物体内会产生大量的自由基,从而引起膜质的过氧化,最终导致膜系统的破坏。80年代以来,人们对盐分胁迫下植物体内抗氧化防御系统进行了大量研究,并已确定它由一些能清除活性氧的酶系统和抗氧化物质组成,如超氧化物歧化酶(SOD、过氧化物酶(POD、过氧化氢酶(CAT和抗坏血酸(ASA等,它们协同作用共同抵抗盐分胁迫诱导的氧化伤害,而单一的抗氧化酶则不足以防御这种氧化胁迫。1.5盐渍条件下拒盐和对离子的选择吸收某些盐生植物能通过一些生理机制拒绝或减少对离子的吸收,从而减轻离子所造成的伤害。高粱在1000mmol/LNaCl中胁迫7天后,其根和茎部木质部液中Na+比穗轴木质部中Na+要高十几倍,小麦、甜菜、玉米等在盐的胁迫下其根Na+也要比地上部分高3～7倍[8]。说明根具有抑制Na+吸收和向地上运输的机能,对于这种限制移动的控制机制目前人们认为涉及以下过程:(1+,即使进,就是进入内皮细+Na+局限于细胞间隙中;(Na+被吸入液泡,并将其封闭在液泡,阻止Na+向叶片运输;(3植物体内把进入导管内的Na+向导管外排出,Na+聚积在与导管相邻的薄壁组织细胞中,同时将移动到地上部分的Na+从导管渗进筛管,再将其返送到根部。植物通过这种机制保持细胞质有极低渗透势,以抵消液泡渗透势的降低,对减轻高盐对植物损伤有重要作用。2耐盐相关基因的克隆2.1近年来克隆到的盐诱导基因近20年来,随着分子生物学的迅速发展,作物耐盐生理生化机制日益明确,使克隆与作物耐盐相关基因成为可能,近年来克隆到的部分基因见表1。表1近年来克隆到的部分盐诱导基因Table1Partialgenesclonedforsalttolerance基因来源功能资料来源基因登录号AhProTi榆钱菠菜脯氨酸转运蛋白申义国等[9]AF270651P5CS大豆脯氨酸合成酶Delauney等[10]AY492005SOS1拟南芥反转运蛋白基因Shi等[11]AF256224BADH细菌甜菜碱脱氢酶Larimer等[12]BX572595SsAPX盐地碱蓬过氧化物酶马常乐等[13]AY034893CDPKI拟海桑钙调蛋白基因Huang等[14]AY466385TaNHX1小麦Na+/H+反转运蛋白基因王子宁等[15]AY040245SacB枯草杆菌果聚糖蔗糖转移酶Rey等[16]NC006270DsALDP盐藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶张晓宁等[17]AY092823622005,25(8崔润丽等:植物耐盐相关基因克隆与转化研究进展2.2耐盐相关基因的分类根据基因产物的不同,可将现已克隆的基因分为以下几类。2.2.1渗透调节有关的基因这些基因在正常条件下表达量极低,但是在盐胁迫条件下会大量表达并产生一些小分子有机物,如脯氨酸、甜菜碱、糖醇等。通过这些小分子物质维持细胞渗透势,提高植物的耐盐性。(1脯氨酸合成相关基因1990年,Delauney等[10]在大豆中发现P5CS酶与渗透调节有关,由此提取mRNA,反转录获得cDNA,进一步筛选得到了P5CS基因。到目前为止,P5CS基因已经从紫花苜蓿、豌豆、拟南芥、水稻等物种中得到克隆和鉴定,不同生物的P5CS基因具有较高的同源性。在紫花苜蓿、豌豆、拟南芥、水稻中的研究表明:盐处理或干旱条件下P5CS基因转录水平有很大程度的提高,并最终导致了脯氨酸含量的增加[18]。(2成相关基因Falkenberg等[19]cDNA片段,并证明与脱酶(BADH的活性有关McCue等[20]从甜菜的λ10cDNA文库中克隆了3个负责编码BADH的cDNA,发现其氨基酸序列与菠菜的BADH具有83%的同源性。BADH和CMO等基因已应用到耐盐植物基因工程研究中。2.2.2与离子区域化相关的基因液泡膜上的Na+/H+反转运蛋白直接参与了Na+在液泡中的积累。王子宁等[15]以水稻Na+/H+反转运蛋白cDNA为探针,从小麦盐胁迫的cDNA文库中筛选和克隆了2个Na+/H+反转运蛋白基因,分别命名为TaNHX1和TaNHX2。这2个基因与已知的水稻、拟南芥和滨藜中的同类基因NHX的相似性约为70%。RT2PCR分析表明,小麦苗经400mmol/L的NaCl处理1h后TaNHX1基因的转录水平有所提高。Shi等[11]从拟南芥中克隆了1个Na+/H+反转运蛋白基因SOS1,并证明SOS1基因是Na+和K+在液泡中富集所必需的,与植物耐盐性直接相关。SOS1基因所编码的蛋白质跨膜结构域与已知的真核生物和细菌的该基因具有显著的同源性。Apes等[21]将1个编码液泡膜Na+/H+反转运蛋白的基因转入拟南芥,证明其耐盐性显著增强,可在含盐量为200mmol/L的NaCl土壤中生长。此外,还有其他关于Na+/H+反转运蛋白基因的报道,目前大家一致认为Na+/H+反转运蛋白基因对离子的区域化具有重要作用。2.2.3保护酶基因保护酶(尤其是SOD是人们研究在1989年就已经获得了,SOD基因,包括Fe2/SOD基因既有单拷,线粒体和叶绿体中的SOD是在核内合成后再分泌到细胞器中的。多数SOD基因的表达都具有组织特异性,并受许多环境因素的影响。赵风云等[22]的研究表明,水稻的Mn2SOD基因(sodA1可由ABA、干旱、盐胁迫诱导,而Fe2SOD基因则由ABA诱导,质体的Cu/Zn2SOD基因(sodCp由盐胁迫在光下诱导而黑暗条件下则不诱导。这些现象说明不同的SOD基因表达受不同的因素诱导,因此仅转入1个或1种类型的SOD基因难以提高植物的耐盐能力。3转基因耐盐植物研究进展尽管人们已经发现并克隆了许多与耐盐相关的基因,但仅有少量基因被用于转化工作。近年来获得的主要转耐盐相关基因植物见表2。表2近年获得的主要转耐盐相关基因(或转录因子植物Table2Recenttransgenicplantsforsalttolerance基因转入植物转基因植物的表现资料来源BADH小麦、烟草抗渗透耐盐、耐旱能力明显提高刘凤华等[23]mtlD/gutD水稻耐盐能力较转它们的单基因植物明显增强刘俊君等[24]P5CS水稻幼苗抗盐能力显著增强苏金等[25]gutD玉米具有较高的耐盐性,可在1.75%NaCl培养基上生长刘岩等[26]SOD紫花苜蓿显著提高植物的耐盐性Apes等[21]NHXVP1烟草抗性提高,可在盐胁迫条件下生长赵风云等[22]AtNHX1拟南芥基因转录产物在根、嫩枝、花中的含量提高McKersie等[27]AhproTi拟南芥可耐受200mmol/LNaCl,并可持续生长申义国等[9]DsALDP烟草在100～200mmol/LNaCl下仍保持醛缩酶活性张晓宁等[17]SOS1水稻显著提高耐盐性Ohta等[28]Apx大麦显著提高耐盐性Ishitani[29]72中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.25No.82005目前获得的一些转基因植物耐盐性虽有提高,但这只是相对于对照植株而言的,转入均是单个基因或相关的两个基因,并没有得到生产大田能利用的抗盐植株。目前比较一致的观点是:植物的耐盐性是多种生理性状的综合表现,是由位于不同染色体上的多个基因控制的,因此培育有实践意义的转基因植物可能需要同时转入多个基因。3.1导入编码产生渗透调节物质的酶基因刘凤华等[23]利用农杆菌介导法,将BADH基因导入草莓和烟草中获得转基因植株,鉴定表明:转基因植株的耐盐性较对照明显提高,并利用PCR检测证明耐盐性的提高是由于外源BADH表达的结果。苏金等[25]获得的转基因水稻提高了脯氨酸水平,秧苗对100～150mmol/LNaCl具有一定的抗性。除脯氨酸和甘氨酸甜菜碱外,其他渗透调节物质,如甘露醇和山梨醇合成的关键酶12磷酸甘露醇脱氢酶(mtlD和62磷(]等[26]将这2,分别获得在1.75%NaCl培养基中有一定耐盐能力的转基因植株。3.2导入与离子区域化效应有关的基因Ohta等[28]将Na+/H+反转运蛋白基因转入水稻,在水稻中超表达该基因,发现其木质部蒸腾流中Na+的含量明显降低,植物的耐盐性增强,显示可以通过限制Na+在植物细胞中的积累来提高植物的耐盐性。赵风云等[22]从SuaedaSalsa中克隆到Na+/H+反转运蛋白基因,并证明该基因对植物的耐盐性至关重要。Apes等[21]将一编码液泡Na+/H+反转运蛋白基因转入拟南芥使其超表达,结果表明,该转基因植株能够在NaCl含量为200mmol/L的土壤中生长发育,比对照耐盐性显著提高,可见转入与离子区域化效应有关的基因可显著提高植物的耐盐性。4导入耐盐植物的总DNA将耐盐植物的总DNA直接导入大田作物来提高其耐盐性也是近几年来遗传工程研究中的一个重要方面。林栖凤等[30]利用花粉管通道技术,将海岸耐盐植物红树的DNA导入茄子,获得的转化后代已在海滩上试种,可以用含盐量2.5%的海水浇灌,约90%的植株能开花结果,完成生长周期,并对其在盐胁迫下的生长情况、蒸腾速率、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性以及叶片气孔的电镜观察等进行了研究,实验结果表明,导入红树DNA培育的茄子耐盐能力明显增强,已繁殖到第三代,而对照植株几乎全部死亡。综上所述,尽管不同的研究者从诸多方面对植物的耐盐机理作了大量的研究,并已达到了一定的广度和深度,但由于植物耐盐性是一个受多基因控制的复杂的数量性状,它受植物种类、品种基因型和内部生理生化反应的影响,离实际生产和应用还有相当大的距离。我们虽然了解了一些盐胁迫条件下作物的反应变化,但我们却不能确定哪一种反应是主要的,利用的可能性有多大,产生的耐盐效应有多大。在转基因植物方面,虽然得到了一些转基因植物,但如何协调好外源基因与内源基因的关系,控制好基因表达时间和表达量,避免对作物的消极影响等问题还有待进一步研究。,。参考文献[1]LevittJ.ResponseofPlantstoEnvironmentalStress(VolII.2nded.NewYork:AcademicPress,1980.102～106[2]赵可夫,李法曾.中国盐生植物.北京:科学出版社,1999.191～200ZhaoKF,LiFZ.HalophyteinChina.Beijing:SciencePress,1999.191～200[3]FlowersTJ,HarveyDMR.Ionsrelationofsalttolerance.AustralianJournalofPlantPhysiology,1997,24:89～91[4]张福锁.植物营养生态生理学和遗传学.北京:中国科学技术出版社,1993.206～230ZhangFS.Pl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以提高植酸酶的酶活力,随着麦麸在培养基中含量的增加,植酸酶的酶活力呈上升趋势。在1009麦芽粉中添加158麦麸和添加209麦麸的植酸酶的酶活力几乎差不多。但考虑到培养基成本的问题,选择麦麸的添加量为每1009麦芽粉添加159。辅料麦麸的添加量x2为159。4.1.3氨源补加生长阶段补加蛋白胨浓度(x3图3结果表明,在生长阶段补加蛋白胨,不论18h还是35h的菌体浓度都高于对照,酶活力也高于对照。可见,蛋白胨对菌体生长和酶活力的提高都有促进作用,蛋白胨浓度为3%时,酶活力最高,所以在生长阶段蛋白胨浓度即X3为3%。蛋白胨浓度(%图3.生长阶段添加蛋白胨与苗体浓度和产酶的关系Fig.3TheeffectofpeptoneconcentrationonYeastconcentrationandphytaseacth,ityatgrowthphase诱导阶段补加蛋白胨浓度(】(4酶活力(KU,mL蛋白胨的添加重(%图4.诱导阶段添加蛋白胨对产酶的影响FigATheeffectofpeptoneconcentrationonphytaseactivityatinducingphase图4结果表明,在诱导培养基中添加1%、2%、3%的蛋白胨,发酵液的酶活力略高予对照,而在诱导培养基中添加4%、5%的蛋白胨,其发酵液的酶活力明显低于对照。说明蛋白胨在~定浓度范围内,可提高酶活力。考虑到在诱导阶段补加蛋白膝对产酶没有显著影响,而且会增加培养基的成本,故在以后的实验中,在诱导表达阶段不补加蛋白胨即(4为0。4。2植酸酶基因工程菌摇瓶培养条件4.2.1种龄(YT致谢本文是在导师王红宁教授精心指导下完成的。三年来，王老师对我的生活、学习和研究等方面都给予了悉心的指导和关怀，培养了我独立科研的能力，而王老师开阔的思路、严谨求实、勇于攀登科技高峰的科学品质更潜移默化地影响了我，激励着我在科学的道路上继续前进ｌ在此论文完成之际，我向培养了我的导师致以最衷心的感谢！梁如玉副教授、廖德聪老师、陈惠副教授、柳萍老师、黄勇老师、赵海霞老师、吴琦博士、周生博士、李建文博士、邹立扣博士、胡惠琼博士，在我论文设计及完成过程中，提出了许多宝贵和富有建设性的意见，在此表示感谢！本课题组的许钦坤，玉米所的张建辉，以及本实验室的谢涛、李成忠、张瑞强、郑连军、王钢、陈萍、余祖华、陈建华、汪洋等同学在我实验过程中都给予了极大的帮助和关心，在我实验出现困难的时候，是他们给了我精神动力和智力支持，帮我顺利度过难关。在此，对他们一并表示最衷心的感谢。最后，感谢我的家人和朋友，他们一直相信我，一贯支持我，是我论文顺利完成的坚强后盾。中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2005,25(8:25～30植物耐盐相关基因克隆与转化研究进展3崔润丽2刁现民1,233(1河北省农林科学院谷子研究所国家谷子改良中心石家庄050031(2河北师范大学生命科学学院石家庄050016摘要土地盐渍化是农作物产量降低的一个重要因素。从盐分对植物的伤害、植物耐盐的机理、耐盐相关基因的克隆及转耐盐基因植物等方面论述了植物的耐盐机理及转耐盐基因植物的研究现状,分析了耐盐性状的复杂性,并对前景进行了展望。关键词盐害耐盐机理基因克隆转基因收稿日期:2005202131修回日期:20052052273河北省自然科学基金资助项目(C2004000697,河北省农林科学院资助项目(A032120210533通讯作者,电子信箱:xmdiao@土地盐渍化是限制农作物生长、重的非生物胁迫之一取两种措施,;,且随着大量化学物质的加入加重了土壤的次生盐渍化,因此培育耐盐的作物品种就日益重要。国内外学者研究了盐分对植物的伤害、植物耐盐的机理,克隆了一些耐盐相关基因,并通过耐盐相关基因转化,获得了一些耐盐性提高的转基因植物,展示了诱人的前景。本文从植物耐盐的机理、耐盐相关基因的克隆及转耐盐基因植物等几个方面进行综述,对该领域的前景进行了展望。1植物耐盐的机理盐分对植物胁迫分为渗透胁迫、离子伤害、离子不平衡或营养缺乏三类,渗透胁迫和离子伤害目前被认为是对植物危害的两个主要过程[1]。植物的耐盐性总的来说可分为形态耐盐和生理耐盐。形态耐盐性是特殊环境下的少数耐盐植物进化出特殊器官泌盐和稀盐,如海滩的红树和碱蓬属植物。对多数植物来说,则是生理耐盐。本文主要讨论生理性耐盐的研究进展。1.1盐胁迫下渗透机制的调节在盐胁迫下,由于外界渗透压较低,植物吸收水分,。植物为了避免这种,降低细胞的渗透势,从而使水分顺利地进入植物体内,保证植物正常生理活动的进行。渗透调节分为无机渗透调节和有机渗透调节。参与无机渗透调节的离子主要是Na+、K+、Ca2+和Cl2。赵可夫等[2]研究发现盐生植物的无机渗透剂以Na+、K+和Cl2为主,而非盐生植物高粱、芦苇等主要以K+和有机渗透物质为主。说明盐生植物和非盐生植物在渗透调节物质方面的不同。植物在逆境中会主动积累一些有机渗透物质,其中小分子化合物有如下几类:第一类是多元醇,如甘油、山梨醇、甘露醇、右旋肌醇甲醚等;第二类是糖类,如蔗糖、海藻糖等;第三类是氨基酸及其衍生物,如脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱等。这些物质对细胞无毒,对代谢过程无抑制作用,它们的积累在一定范围内可以维持盐胁迫下细胞的正常膨压和代谢功能。这些保护渗透物质在植物抗盐研究中已越来越受重视。1.2盐胁迫改变代谢途径在盐胁迫下,一些盐生植物能够通过改变其自身的代谢途径而适应高盐度的生存环境。一些肉质植物,如豆瓣绿属植物、马齿苋科植物以及禾本科植物冰草等,在盐渍或水分胁迫下可以改变光合碳同化途径,即由C3途径变为CAM途径。CAM植物在夜间开放气孔进行CO2吸收和固定,白天气孔关闭减少蒸腾量。这种转变的机理,赵可夫等[2]认为主要是Cl-活化了细胞中的RUBP羧化酶所导致的。并通过测量CO2固定和PEP羧化酶活性证实光合作用转变是受盐诱导的。中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.25No.82005整个光合作用途径的改变是一个十分复杂的过程,涉及到的基因很多,利用改变植物光合作用途径提高植物耐盐性十分困难。1.3盐胁迫下离子的区域化大量的研究表明,植物将吸收的Na+、Cl-等离子积累在液泡中,减少干扰细胞质和叶绿体等的生化代谢过程,这种作用称为离子的区域化作用。Flowers等[3]实验证明,盐生植物和非盐生植物的细胞对Na+都非常敏感,Na+、Cl-的区域化分配是植物对盐渍环境适应的结果。由于离子区域化,使得液泡中Na+浓度远远高于细胞质中的浓度。如高浓度NaCl条件下,生长多代的烟草悬浮细胞系液泡中,积累的NaCl浓度相当高,可达800mmol/L,而细胞质NaCl的浓度仍保持在100mmol/L[4]。研究表明,在NaCl胁迫下,Na+通过质膜进入细胞只有25%左右为主动运输,输,但Na+度的主动运输过程[5]+Cl-Niu[6]滨藜根和叶子质膜上H+2ATPase基因的表达。Dopont[7]证明当外界环境Na+浓度提高,植物通过Na+/H+逆向转运蛋白将Na+转运到液泡中,实现区域化,减少细胞质中的Na+浓度,且在滨藜中Na+/H+逆向转运蛋白活性是被NaCl诱导的。因此,深入研究液泡膜转运蛋白对揭示作物耐盐机理是至关重要的。1.4盐分增加质膜的透性盐分能增加质膜的透性,同时当盐胁迫时,植物体内会产生大量的自由基,从而引起膜质的过氧化,最终导致膜系统的破坏。80年代以来,人们对盐分胁迫下植物体内抗氧化防御系统进行了大量研究,并已确定它由一些能清除活性氧的酶系统和抗氧化物质组成,如超氧化物歧化酶(SOD、过氧化物酶(POD、过氧化氢酶(CAT和抗坏血酸(ASA等,它们协同作用共同抵抗盐分胁迫诱导的氧化伤害,而单一的抗氧化酶则不足以防御这种氧化胁迫。1.5盐渍条件下拒盐和对离子的选择吸收某些盐生植物能通过一些生理机制拒绝或减少对离子的吸收,从而减轻离子所造成的伤害。高粱在1000mmol/LNaCl中胁迫7天后,其根和茎部木质部液中Na+比穗轴木质部中Na+要高十几倍,小麦、甜菜、玉米等在盐的胁迫下其根Na+也要比地上部分高3～7倍[8]。说明根具有抑制Na+吸收和向地上运输的机能,对于这种限制移动的控制机制目前人们认为涉及以下过程:(1+,即使进,就是进入内皮细+Na+局限于细胞间隙中;(Na+被吸入液泡,并将其封闭在液泡,阻止Na+向叶片运输;(3植物体内把进入导管内的Na+向导管外排出,Na+聚积在与导管相邻的薄壁组织细胞中,同时将移动到地上部分的Na+从导管渗进筛管,再将其返送到根部。植物通过这种机制保持细胞质有极低渗透势,以抵消液泡渗透势的降低,对减轻高盐对植物损伤有重要作用。2耐盐相关基因的克隆2.1近年来克隆到的盐诱导基因近20年来,随着分子生物学的迅速发展,作物耐盐生理生化机制日益明确,使克隆与作物耐盐相关基因成为可能,近年来克隆到的部分基因见表1。表1近年来克隆到的部分盐诱导基因Table1Partialgenesclonedforsalttolerance基因来源功能资料来源基因登录号AhProTi榆钱菠菜脯氨酸转运蛋白申义国等[9]AF270651P5CS大豆脯氨酸合成酶Delauney等[10]AY492005SOS1拟南芥反转运蛋白基因Shi等[11]AF256224BADH细菌甜菜碱脱氢酶Larimer等[12]BX572595SsAPX盐地碱蓬过氧化物酶马常乐等[13]AY034893CDPKI拟海桑钙调蛋白基因Huang等[14]AY466385TaNHX1小麦Na+/H+反转运蛋白基因王子宁等[15]AY040245SacB枯草杆菌果聚糖蔗糖转移酶Rey等[16]NC006270DsALDP盐藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶张晓宁等[17]AY092823622005,25(8崔润丽等:植物耐盐相关基因克隆与转化研究进展2.2耐盐相关基因的分类根据基因产物的不同,可将现已克隆的基因分为以下几类。2.2.1渗透调节有关的基因这些基因在正常条件下表达量极低,但是在盐胁迫条件下会大量表达并产生一些小分子有机物,如脯氨酸、甜菜碱、糖醇等。通过这些小分子物质维持细胞渗透势,提高植物的耐盐性。(1脯氨酸合成相关基因1990年,Delauney等[10]在大豆中发现P5CS酶与渗透调节有关,由此提取mRNA,反转录获得cDNA,进一步筛选得到了P5CS基因。到目前为止,P5CS基因已经从紫花苜蓿、豌豆、拟南芥、水稻等物种中得到克隆和鉴定,不同生物的P5CS基因具有较高的同源性。在紫花苜蓿、豌豆、拟南芥、水稻中的研究表明:盐处理或干旱条件下P5CS基因转录水平有很大程度的提高,并最终导致了脯氨酸含量的增加[18]。(2成相关基因Falkenberg等[19]cDNA片段,并证明与脱酶(BADH的活性有关McCue等[20]从甜菜的λ10cDNA文库中克隆了3个负责编码BADH的cDNA,发现其氨基酸序列与菠菜的BADH具有83%的同源性。BADH和CMO等基因已应用到耐盐植物基因工程研究中。2.2.2与离子区域化相关的基因液泡膜上的Na+/H+反转运蛋白直接参与了Na+在液泡中的积累。王子宁等[15]以水稻Na+/H+反转运蛋白cDNA为探针,从小麦盐胁迫的cDNA文库中筛选和克隆了2个Na+/H+反转运蛋白基因,分别命名为TaNHX1和TaNHX2。这2个基因与已知的水稻、拟南芥和滨藜中的同类基因NHX的相似性约为70%。RT2PCR分析表明,小麦苗经400mmol/L的NaCl处理1h后TaNHX1基因的转录水平有所提高。Shi等[11]从拟南芥中克隆了1个Na+/H+反转运蛋白基因SOS1,并证明SOS1基因是Na+和K+在液泡中富集所必需的,与植物耐盐性直接相关。SOS1基因所编码的蛋白质跨膜结构域与已知的真核生物和细菌的该基因具有显著的同源性。Apes等[21]将1个编码液泡膜Na+/H+反转运蛋白的基因转入拟南芥,证明其耐盐性显著增强,可在含盐量为200mmol/L的NaCl土壤中生长。此外,还有其他关于Na+/H+反转运蛋白基因的报道,目前大家一致认为Na+/H+反转运蛋白基因对离子的区域化具有重要作用。2.2.3保护酶基因保护酶(尤其是SOD是人们研究在1989年就已经获得了,SOD基因,包括Fe2/SOD基因既有单拷,线粒体和叶绿体中的SOD是在核内合成后再分泌到细胞器中的。多数SOD基因的表达都具有组织特异性,并受许多环境因素的影响。赵风云等[22]的研究表明,水稻的Mn2SOD基因(sodA1可由ABA、干旱、盐胁迫诱导,而Fe2SOD基因则由ABA诱导,质体的Cu/Zn2SOD基因(sodCp由盐胁迫在光下诱导而黑暗条件下则不诱导。这些现象说明不同的SOD基因表达受不同的因素诱导,因此仅转入1个或1种类型的SOD基因难以提高植物的耐盐能力。3转基因耐盐植物研究进展尽管人们已经发现并克隆了许多与耐盐相关的基因,但仅有少量基因被用于转化工作。近年来获得的主要转耐盐相关基因植物见表2。表2近年获得的主要转耐盐相关基因(或转录因子植物Table2Recenttransgenicplantsforsalttolerance基因转入植物转基因植物的表现资料来源BADH小麦、烟草抗渗透耐盐、耐旱能力明显提高刘凤华等[23]mtlD/gutD水稻耐盐能力较转它们的单基因植物明显增强刘俊君等[24]P5CS水稻幼苗抗盐能力显著增强苏金等[25]gutD玉米具有较高的耐盐性,可在1.75%NaCl培养基上生长刘岩等[26]SOD紫花苜蓿显著提高植物的耐盐性Apes等[21]NHXVP1烟草抗性提高,可在盐胁迫条件下生长赵风云等[22]AtNHX1拟南芥基因转录产物在根、嫩枝、花中的含量提高McKersie等[27]AhproTi拟南芥可耐受200mmol/LNaCl,并可持续生长申义国等[9]DsALDP烟草在100～200mmol/LNaCl下仍保持醛缩酶活性张晓宁等[17]SOS1水稻显著提高耐盐性Ohta等[28]Apx大麦显著提高耐盐性Ishitani[29]72中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.25No.82005目前获得的一些转基因植物耐盐性虽有提高,但这只是相对于对照植株而言的,转入均是单个基因或相关的两个基因,并没有得到生产大田能利用的抗盐植株。目前比较一致的观点是:植物的耐盐性是多种生理性状的综合表现,是由位于不同染色体上的多个基因控制的,因此培育有实践意义的转基因植物可能需要同时转入多个基因。3.1导入编码产生渗透调节物质的酶基因刘凤华等[23]利用农杆菌介导法,将BADH基因导入草莓和烟草中获得转基因植株,鉴定表明:转基因植株的耐盐性较对照明显提高,并利用PCR检测证明耐盐性的提高是由于外源BADH表达的结果。苏金等[25]获得的转基因水稻提高了脯氨酸水平,秧苗对100～150mmol/LNaCl具有一定的抗性。除脯氨酸和甘氨酸甜菜碱外,其他渗透调节物质,如甘露醇和山梨醇合成的关键酶12磷酸甘露醇脱氢酶(mtlD和62磷(]等[26]将这2,分别获得在1.75%NaCl培养基中有一定耐盐能力的转基因植株。3.2导入与离子区域化效应有关的基因Ohta等[28]将Na+/H+反转运蛋白基因转入水稻,在水稻中超表达该基因,发现其木质部蒸腾流中Na+的含量明显降低,植物的耐盐性增强,显示可以通过限制Na+在植物细胞中的积累来提高植物的耐盐性。赵风云等[22]从SuaedaSalsa中克隆到Na+/H+反转运蛋白基因,并证明该基因对植物的耐盐性至关重要。Apes等[21]将一编码液泡Na+/H+反转运蛋白基因转入拟南芥使其超表达,结果表明,该转基因植株能够在NaCl含量为200mmol/L的土壤中生长发育,比对照耐盐性显著提高,可见转入与离子区域化效应有关的基因可显著提高植物的耐盐性。4导入耐盐植物的总DNA将耐盐植物的总DNA直接导入大田作物来提高其耐盐性也是近几年来遗传工程研究中的一个重要方面。林栖凤等[30]利用花粉管通道技术,将海岸耐盐植物红树的DNA导入茄子,获得的转化后代已在海滩上试种,可以用含盐量2.5%的海水浇灌,约90%的植株能开花结果,完成生长周期,并对其在盐胁迫下的生长情况、蒸腾速率、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性以及叶片气孔的电镜观察等进行了研究,实验结果表明,导入红树DNA培育的茄子耐盐能力明显增强,已繁殖到第三代,而对照植株几乎全部死亡。综上所述,尽管不同的研究者从诸多方面对植物的耐盐机理作了大量的研究,并已达到了一定的广度和深度,但由于植物耐盐性是一个受多基因控制的复杂的数量性状,它受植物种类、品种基因型和内部生理生化反应的影响,离实际生产和应用还有相当大的距离。我们虽然了解了一些盐胁迫条件下作物的反应变化,但我们却不能确定哪一种反应是主要的,利用的可能性有多大,产生的耐盐效应有多大。在转基因植物方面,虽然得到了一些转基因植物,但如何协调好外源基因与内源基因的关系,控制好基因表达时间和表达量,避免对作物的消极影响等问题还有待进一步研究。,。参考文献[1]LevittJ.ResponseofPlantstoEnvironmentalStress(VolII.2nded.NewYork:AcademicPress,1980.102～106[2]赵可夫,李法曾.中国盐生植物.北京:科学出版社,1999.191～200ZhaoKF,LiFZ.HalophyteinChina.Beijing:SciencePress,1999.191～200[3]FlowersTJ,HarveyDMR.Ionsrelationofsalttolerance.AustralianJournalofPlantPhysiology,1997,24:89～91[4]张福锁.植物营养生态生理学和遗传学.北京:中国科学技术出版社,1993.206～230ZhangFS.PlantNutritionEcophysiologyandGenetics.Beijing:ChinaScienceandTechnologyPress,1993.206～230[5]王宝山,赵可夫,邹奇.作物耐盐机理研究进展及提高作物耐盐性的对策.植物学通报,1997,33(6:423～426WangBSH,ZhaoKF,ZouQ.ChineseBulletinofBotany,1997,33(6:423～426[6]NiuXM,ZhuJK,NarasimhanML,etal.PlasmamembraneH+2ATPasegeneexpressionisregulatedbyNaClincellofthehalophyteAtriplexnummalariaL.Planta,1993,190:433～438[7]DopontFM.Salt2inducedchangesiniontransport:regulationofprimarypumpsandsecondarytransporters.In:ClarksonDTed.TransportandReceptorProteinsofPlantMembranes.NewYork:PlenumPress,1992.91～100[8]MicheletB,BoutryM.TheplasmamembraneH+2ATPaseahighlyregulatedenzymewithmultiplephysiologicalfunctions.PlantPhysiol,1995,108:1～6[9]申义国,闫冬青,张万科,等.榆钱菠菜脯氨酸转运蛋白基因的克隆及转拟南芥的耐盐性.植物学报,2002,44(8:956～962ShenYG,YanDQ,ZhangWK,etal.ActaBotanicaSinica,2002,44(8:956～962[10]DelauneyAJ,VermaDPS.AsoybeangeneencodingΔ12pyrroline2s2carboxylatereductasewasisolatedbyfunctional822005,25(8崔润丽等:植物耐盐相关基因克隆与转化研究进展complementationinE.coliandisfoundtobeosmoregulated.MolGenGendt,1990,221:299～305[11]ShiH,IshitaniM,KimC,etal.TheArabidopsisthalianasalttolerancegeneSOS1encodesaputativeNa+/H+antiporter.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(12:6896～6901[12]LarimerFW,ChainP.CompletegenomesequenceofthemetabolicallyversatilephotosyntheticbacteriumRhodopseduomonaspalustris.NatBiotechnol,2004,22(1:55～61[13]马常乐,王萍萍,曹子谊,等.盐地碱蓬APX基因的克隆及盐胁迫下的表达.植物生理与分子生物学学报,2002,28(4:261～266MaCHL,WangPP,CaoZY,etal.JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology,2002,28(4:261～266[14]HuangJ,MullapudiN.FirstglimpseintothepatternandscaleofgenetransferintheApicomplexa.IntJParasitol,2004,34(3:265～274[15]王子宁,张劲松,郭北海,等1小麦Na+/H+反转运蛋白基因的克隆和特性.植物学报,2002,44(10:12