第七章发酵过程控制发酵工程课件

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发酵工程精品课程http://biotech.ecust.e1第七章发酵过程的代谢控制发酵过程控制是发酵的重要部分控制难点：过程的不确定性和参数的非线性同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的发酵过程的代谢控制/jpkc/fjgc第七章发酵过程的代谢控制发酵过程控制是发酵的重要部分发酵2第一节发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次一发酵过程的种类分批培养补料分批培养半连续培养连续培养发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc第一节发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次一31、分批发酵简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc1、分批发酵发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究4分批培养中微生物的生长迟滞期对数生长期稳定期死亡期发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc分批培养中微生物的生长迟滞期对数生长期稳定期死亡5微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快，比生长速率几近常数。这个时期称为对数生长期发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期在迟滞期，6随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速7分批培养的优缺点优点操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握缺点产率低，不适于测定动力学数据发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc分批培养的优缺点优点操作简单，周期短，染菌机会少，生产过82、补料分批培养

在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc2、补料分批培养在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养9补料分批培养的优缺点优点在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。缺点由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc补料分批培养的优缺点优点在这样一种系统中可以维持低的103、半连续培养在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。某些品种采取这种方式，如四环素发酵优点放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。缺点代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc3、半连续培养在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放114、连续培养发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc4、连续培养发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，12连续培养的优缺点优点控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于μ＝D，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学缺点菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc连续培养的优缺点优点控制稀释速率可以使发酵过程最优化。13二发酵过程工艺控制的目的有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc二发酵过程工艺控制的目的有一个好的菌种以后要有一个配合14发挥菌种的最大生产潜力考虑之点菌种本身的代谢特点生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率菌代谢与环境的相关性温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc发挥菌种的最大生产潜力考虑之点发酵过程的代谢控制发酵过程工艺15微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式，比如糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成副产物，而这些前体有可能流向不同的反应方向，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方向进行。发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式，比如糖代谢产16微生物的生长与产物合成有密切相关性，不仅表现在菌体量的大小影响产物量的多少，而且菌体生长正常与否，即前期的代谢直接影响中后期代谢的正常与否。特别是对于次级代谢产物的合成更具有复杂性因此对发酵过程的了解不能机械的，割裂的去认识，而要从细胞代谢水平和反应工程水平全面的认识发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc微生物的生长与产物合成有密切相关性，不仅表现在菌体量的大小影17发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如菌本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因素等等。因此发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。为了全面的认识发酵过程，本章首先要告诉大家分析发酵过程的基本方面，在此基础上再举一些例子，说明如何综合分析发酵过程及进行优化放大。发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如菌本身的遗传特性、物质运18三发酵过程研究的方法和层次1、研究方法单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验优点一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。缺点如果考察的条件多，实验时间会比较长各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc三发酵过程研究的方法和层次1、研究方法单因子实验：对19数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。优点同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最202、研究的层次初级层次的研究：一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适pH等要求。摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高的效率。发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc2、研究的层次发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究21代谢及工程参数层次研究：一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以得到的代谢情况比较可信。发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc代谢及工程参数层次研究：发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的22我们学院的国家生物工程中心创制的全参数发酵罐除了装备有常规发酵罐的温度、溶氧、pH电极，得到发酵全过程的这些参数外，还有罐体称重，补料计量装置和尾气采集分析系统，更重要的是，有一套独特的数据处理软件，软件的开发是长期科研成果的结晶，可以得到14个发酵过程参数，并且可以输入和绘制人工测定的参数，对发酵过程的分析起到了重要的作用发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc我们学院的国家生物工程中心创制的全参数发酵罐除了装备有常规发23发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次h24鸟苷发酵过程曲线发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc鸟苷发酵过程曲线发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研25生产规模放大：在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐的优化条件在大型反应器上得以实现,达到产业化的实现。一般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不同所致。发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次/jpkc/fjgc生产规模放大：发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究26第二节发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc第二节发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析是生产控制的27代谢参数按性质分可分三类：物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、、核酸量等生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc代谢参数按性质分可分三类：发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分28从检测手段分可分为：直接参数、间接参数直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc从检测手段分可分为：直接参数、间接参数发酵过程的代谢控制发酵29直接参数又可分为:在线检测参数和离线检测参数在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度。发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc直接参数又可分为:在线检测参数和离线检测参数发酵过程的代30一发酵过程主要分析的项目目前发酵过程主要分析项目如下1、pHpH与微生物的生命活动密切相关——酶催化活性pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映——基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc一发酵过程主要分析的项目目前发酵过程主要分析项目如下1、312、排气氧、排气CO2和呼吸熵排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率（OUR）。排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc2、排气氧、排气CO2和呼吸熵排气氧的浓度表征了进气的氧被微32RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，生长阶段的不同而不同。测定RQ值一方面可以了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料CER表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量呼吸熵＝呼吸熵反映了氧的利用状况发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgcRQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，生长阶段的不同而33

一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。对于这种工艺，后期的补料控制是关键。过程中发现，在补糖开始时，不但CER、OUR大幅度提高，连RQ也提高约10％，表明通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥343、糖含量微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。糖的消耗反映产生菌的生长繁殖情况反映产物合成的活力菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。糖含量测定包括总糖和还原糖。

总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc3、糖含量微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。发酵过程的354、氨基氮和氨氮氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N），单位是mg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。氨氮指无机氨中的氮（NH3-N）。氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc4、氨基氮和氨氮氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N），单位是365、磷含量微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc5、磷含量微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中376、菌浓度和菌形态菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌形态显微镜观察菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc6、菌浓度和菌形态发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析htt38发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析http://biote39发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析http://biote40菌浓测定方法测粘度压缩体积法（离心）静置沉降体积法光密度测定法OD600~660适合于细菌、酵母发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc菌浓测定方法发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析http:/417、产物浓度

在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积累情况都要通过产物量的测定来了解，产物浓度直接反映了生产的状况,是发酵控制的重要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生产速率，从而分析发酵条件如补料、pH对产物形成的影响。发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc7、产物浓度在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积累情况42二产物量的测定（一）产物量的特殊表示法1、抗生素效价的表示抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（U）来表示效价表示方法：重量折算法重量单位类似重量单位特殊单位发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc二产物量的测定（一）产物量的特殊表示法1、抗生43重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个单位，如青霉素0.6微克＝1U重量单位：规定某些抗生素活性部分1μg=1u如链霉素、卡那霉素、红霉素等定义活性部分1μg＝1u发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个单位，如青霉素0.6微克＝44类似重量单位：规定抗生素的某种盐1mg=1000u如金霉素、四环素的盐酸盐定一为1μg＝1u特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位制霉菌素1mg=3700u多粘菌素B1mg=10000u发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc类似重量单位：规定抗生素的某种盐1mg=1000u如金霉素、452、酶活力的表示法酶活力用单位来表示。由于酶通常不是很纯，不能用重量来表示酶的量。同一种酶用不同的方法测定会有不同的酶活单位，容易造成混乱，为此国际上作了统一规定，规定在250C下，以最适的底物浓度，最适的缓冲液离子强度，以及最适的pH诸条件下，每分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性单位。发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc2、酶活力的表示法酶活力用单位来表示。由于酶通常不是很纯，不46（二）产物量的测定1、化学法（1）滴定法产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可用滴定法如青霉素在碱性条件下加入过量的I2，反应生成青霉噻唑酸碘，用Na2S2O3滴定多余的碘，可计算出青霉素的单位柠檬酸可以用NaOH滴定来计算柠檬酸产量发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc（二）产物量的测定1、化学法（1）滴定法柠檬酸可以用NaO47（2）比色法产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓度成正比，可以用比色法测定。淀粉酶活力测定：在1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（3，5-二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生颜色，它在540nm处所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc（2）比色法淀粉酶活力测定：在1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶48（3）测压法产物特定反应放出或摄入气体，使系统有压力变化，可以通过测定压力变化得知产物量。2、物理法许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生素的含量。谷氨酸γ－氨基丁酸＋CO2发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc（3）测压法2、物理法谷氨酸γ－氨基丁酸＋CO2发酵过程的代49化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于过程分析缺点产品中存在的杂质会干扰测定结果，因此抗生素成品的测定用生物法测定。

适用于抗生素效价的测定

生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准，其原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法灵敏度高，需用的检品量较小，这是其它方法不能比的。但此法得到结果比较慢，需经过16~18小时培养。生物法常用于发酵终了产品效价的测定。3、生物法发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于过程分析3、生物法发50常用的生物法测定抗生素，采用杯碟法“杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径为6mm，高10mm的圆筒形管子，管子的重量尽可能相等。碟是摊布培养基的玻璃培养皿。操作方法是：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每碟15ml（下层），待其凝固。此外，将融化的培养基冷却到500C左右混入试验菌，将混有菌的培养基5ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc常用的生物法测定抗生素，采用杯碟法“杯”是放被测抗生素的不锈51在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待检样品，加满后在370C培养16~18小时。在培养中,一方面试验菌开始生长另一方面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度越高，抑菌圈越大，发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待检样品，加满后在37052r:抑菌圈的半径(毫米）M：抗生素在管中的量（单位）C：最低抑菌浓度（单位/毫升）H：培养基的厚度（毫米）L：管子的高度（毫米）D：抗生素的扩散系数（毫米/小时）T：细菌生长到肉眼所用的时间（小时）发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgcr:抑菌圈的半径(毫米）发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分53抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学关系logM=(1/9.21DT)r2+log(C.4πDTH)抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径的平方呈正比。此外还受C、H、D、T的影响但是C、H、D、T是无法测量的，在实际计算中要设法消去发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学关系抗生素的总量的对数值与54一般的消去方法有二剂量法标准曲线法发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc一般的消去方法有发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析http55两剂量法：标准品低单位总量:m抑菌圈半径SL标准品高单位总量:M抑菌圈半径：SH样品高单位总量:M’抑菌圈半径UH样品低单位总量:m’抑菌圈半径：UL已知：令：得出：→→发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc两剂量法：标准品低单位标准品高单位样品高单位样品低单位已知：56logM’—logM＝_logM’/M=同理logm’—logm=logm’/m==logθ=logθ2logθ=发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgclogM’—logM＝_logM’/M=同理logm’—lo57logM’—logm’=logM’/m’==logKlogM—logm=logM/m==logK2logK=发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgclogM’—logm’=logM’/m’==logKlogM58标准曲线法优点：在一个碟子上可以同时做两个样品的效价，当要做的样品量大时，采取标准曲线法可以提高效率。假设选用的浓度为：3U，4U，5U，6U,7U中心点是5U1122发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc标准曲线法优点：在一个碟子上可以同时做两个样品的效价，当要做59每个浓度做三个碟子。5U为中心点，每个碟子中有3个杯中加中心点浓度，其余3个加其它浓度。测得抑菌圈后，将浓度和抑菌圈平均直径做标准曲线。发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc每个浓度做三个碟子。发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析ht60logMr发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgclogMr发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析http://61管碟法影响因素的讨论：斜率小D、T大,误差小截距小C、D、T、H小，误差小发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc管碟法影响因素的讨论：斜率小D、T大,误差小发酵过程的62logMrlogM1r1r1r1发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgclogMrlogM1r1r1r1发酵过程的代谢控制发酵过程的63培养基厚度H越小，其它条件相同时r越大。影响H的因素：培养基的厚度细菌生长到肉眼所需的时间T越大在其它条件相同时，r越大影响T的因素：菌体本身，及影响菌体生长的条件如：接种量，培养温度、及营养环境其它影响因素：上层铺得平整、菌液加入时的温度、钢圈的放置、滴液发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分析/jpkc/fjgc培养基厚度其它影响因素：上层铺得平整、菌液加入时的温度、钢圈64ThankYou!/jpkc/fjgcThankYou!http://biotech.ecus65发酵工程精品课程/jpkc/fjgc华东理工大学·生物工程学院

发酵工程精品课程http://biotech.ecust.e66第三节微生物培养过程的参数检测

在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据。黑箱灰箱检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等检测代谢中间物，分析代谢流向、RNA检测一参数在线检测发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc第三节微生物培养过程的参数检测黑箱67由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特殊要求：插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏）传感器性能要稳定，受气泡影响小。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特68带计算机数据采集与控制的生物反应系统P188发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc带计算机数据采集与控制的生物反应系统P188发酵过程控制微生69原理：化学或物理信号电信号放大记录显示仪控制器（与设定参数比较）发出调节信号控制器动作发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc原理：化学或物理信号电信号70介绍几种常用的在线检测的传感器及其工作原理

pH电极溶氧电极它们是基础电极，以它们为基础可以制作各种离子电极和酶电极发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc介绍几种常用的在线检测的传感器及其工作原理pH电极发酵过程71（一）pH测量pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物过程控制是一个非常重要的参数。1、pH的定义影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，但对于稀溶液为了避免在氢离子活度很小时表达方式上的麻烦引进pH=-lg[H+][H+]=0.00001时用pH5表示发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc（一）pH测量pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物722、pH测量方法

pH试纸曾经是一种广泛采用的方法优点：方便，易操作缺点：它主观性较强质量差异，不同厂家不同批号的pH试纸测出的pH值会有较大的差别，有时甚至达0.5~1。对于一些要求较高的场合就适用pH试纸pH电极发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc2、pH测量方法pH试纸曾经是一种广泛采用的方法pH试纸发73（1）pH电极测量原理pH电极实际上是由参比电极与指示电极组成的一个自发电池，该电池的表达式可写为：参比电极溶液X指示电极该电池的参比电极的输出电位恒定，指示电极的输出电位随被测体系中氢离子活度而变化。因此整个自发电池的电动势就是被测体系中氢离子活度的函数。

E[α]=E0-ln1/=E0-2.303pH式中E0对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从电位差计的E值可测出pH值。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc（1）pH电极测量原理pH电极实际上是由参比电极与指示电极组74甘汞电极（a）232型（b）217型1－导线；2－加液口；3-KCl溶液；4－素烧瓷芯；5－铂丝；6－Hg；7－Hg2Cl2一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘汞不会漏失，小管和大管之间充满KCl溶液，末端用多孔陶瓷渗入到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。参比电极发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc甘汞电极（a）232型（b）217型1－导线；2－加液口；75

由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐——氯化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半电池可表示为Hg(L)Hg2Cl2(S)Cl-(L)电极电位产生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：2Cl-+2HgHg2Cl2+2e-其电极电位为εCl/HgCl,Hg=ε+ln1/α

由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活度有关而不受被测溶液的酸碱度影响发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐——氯化亚汞以及含氯76（2）指示电极对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的电极都可用来测定溶液的pH。

离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构其中敏感性膜部分随组成材料的不同而各有特色。测定pH值的玻璃电极的敏感膜是厚度为10－1～10－3mm的玻璃薄膜，其电阻为50～500mΩ。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc（2）指示电极对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变化而77指示电极的关键是敏感膜H+H+H+H+H+H+KCl溶液待测溶液浓度差引起电位差——浓差电极玻璃敏感膜发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc指示电极的关键是敏感膜H+H+H+H+H+H+KCl溶液待测78（3）膜电位膜电位是由于膜两侧离子活度的差异而产生，故可看作是一种浓差电位。玻璃电极在使用前必须先在水中浸泡一段时间，玻璃膜表面吸收水分溶解，并且其中的一价阳离子（如Na+离子）与水中H+离子发生离子交换反应。SiO-Na++H+SiO-H++Na+

使膜表面形成以SiO-H+为主要成分的水合硅胶层，厚度约为10-4~10-5mm发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc（3）膜电位膜电位是由于膜两侧离子活度的差异而产生，故可看作79液试水合硅胶层

干玻璃层水合硅胶层内参比溶液α1α1’α2’α2ε1—--△ε--—ε2以α1、α2分别表示试液内与内参比溶液中H+离子活度，α1’、α2’分别表示外侧与内侧硅胶层表面H+离子活度，

由于水合硅胶层表面与内（内参比溶液）、外（试液）溶液中的H+离子从活度大的一方向小的一方迁移，使玻璃膜的外、内侧分别产生相界电位ε1和ε2。经水浸泡后的玻璃膜截面成为三层结构，如图:则有：外侧:ε1=K1+内侧：ε2=K2+发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc液试水合硅胶层干玻璃层水合硅胶层内80可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，故K1=K2，水合硅胶层表面一价阳离子点已基本被质子占据，故α1’=α2’，于是玻璃膜内、外侧之间的电位差△ε膜=ε1-ε2=

由于内参比溶液的H+活度α2一定，故玻璃膜电位与待测溶液的H+离子活度（pH值）成线性关系。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，故K1=K2，水合硅胶81△ε膜=常数+

在25℃下：△ε膜=常数-0.0591pH（试液）但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差别，即使α1=α2时，△ε膜≠0，这差别所产生的电位叫不对称电位（ε不对称），这样整个玻璃电极（指示电极）的电位应是内参比电位、膜电位与不对称电位之和。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc△ε膜=常数+在25℃下：但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有82ε玻璃=ε0+△ε膜+ε不对称其中，ε0与ε不对称对于特定的电极是恒定的，故玻璃电极的电极电位与试液pH值呈线性关系。（4）玻璃电极的性能存在不对称电势不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于膜内外表面状态不完全一样引起的，它与温度、玻璃组成、敏感膜厚度及加工状况等因素有关。不对称电势可以用已知pH值的标准缓冲液来校正

发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgcε玻璃=ε0+△ε膜+ε不对称其中，ε0与ε不对称83零电势或等电势点电极电位为零时的溶液pH值称为零电势pH值，该值取决于内参比溶液的pH值。含有0.025mol/l的KCl和等摩尔浓度的磷酸混合缓冲液的等电势点为pH=7，在pH<7和pH>7时，玻璃电极的极性发生改变。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc零电势或等电势点发酵过程控制微生物培养过程的参数检测http84玻璃电极的测量范围玻璃电极的实际转换系数并不是在整个pH范围都是常数，因而响应曲线会偏离直线，实际的pH响应曲线如图测量值pH在碱性范围内pH>10k降低，测量值偏高在酸性范围内pH<1k升高，测量值偏低…发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc玻璃电极的测量范围测量值pH在碱性范围内pH>10k降低85（5）玻璃电极的使用限制对于蛋白质等粘度较大的测量体系，容易在玻璃电极敏感膜上产生沉积，应设法缩短电极的沉浸时间或设法对电极表面进行清洗，工业测试中常用特制毛刷或超声波清洗电极表面。强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，如氢氟酸溶液会破坏电极脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破坏水合硅胶层发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc（5）玻璃电极的使用限制发酵过程控制微生物培养过程的参数检测86（6）复合电极将两支电极都装在一根玻璃管中，这种电极叫复合电极，工业上在线检测大都使用这种电极。它结构紧凑，便于安装。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc（6）复合电极发酵过程控制微生物培养过程的参数检测http:87pH复合电极的结构屏蔽引线用于减少噪声（电磁波、感应）。当电极插入被测溶液中后，参比电极隔膜被测体系玻璃敏感膜内参比电极之间达到电导通，组成原电池，其原理与双电极pH计的工作原理完全相同，只是结构更紧凑，使用更方便。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgcpH复合电极的结构发酵过程控制微生物培养过程的参数检测htt88（二）敏化离子选择性电极以离子选择性电极为基础电极，通过化学反应或生化反应使离子选择性电极的响应得到敏化，叫作敏化离子选择性电极。包括有气敏电极和酶电极等。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc（二）敏化离子选择性电极以离子选择性电极为基础电极，通过89气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎水的透气膜，在透气膜和这种离子选择性电极之间充以中间溶液，透气膜不允许溶液中的离子通过，而只允许被测定的气体通过，直到透气膜内外两边该气体的分压相等。进入透气膜的气体与中间溶液起反应，从而使中间溶液中的某一被离子选择性电极响应的物质的量发生变化，并通过选择性电极电位反映出来，达到间接表征被测气体含量的目的。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极发酵过程控制微生物培养过90

能用气敏电极测定气体有CO2、NH3、SO2、NO2、H2S、HCN、HF、Cl2、Br2、I2的蒸气等，其中以氨电极比较成熟，应用较广。

1、NH4＋的测量氨是酶反应中最常见的产物和反应物，氨离子可用氨气敏电极来测定。常用的氨电极为：发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc能用气敏电极测定气体有CO2、NH3、SO2、NO2、H2911－电极管；2－透气膜；3－0.1mol/LNH4Cl溶液；4－pH玻璃电极；5－Ag/AgCl参比电极；6，7－玻璃膜；8－可卸电极头；9－内参比溶液，10－内参比电极在电极管内装有玻璃电极——Ag-AgCl电极，底部装有一微孔透气膜，玻璃电极的敏感膜紧贴于透气膜上，中间有一极薄的液层，当氨通过透气膜渗入内充液薄层，即发生如下反应NH3+H2O=NH4++OH-发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc1－电极管；2－透气膜；3－0.1mol/LNH4Cl溶液；92内充液中NH4+远大于生成的NH4+，故其变化可以忽略不计，而薄层的pH则由于OH-的生成而升高，因此由玻璃电极检出OH-的浓度，即可检出NH3的浓度，电极电位与氨的浓度是对数响应。透气膜一般是0.1mm厚的微孔聚四氟乙烯，内充液为0.1mol/L的NH4Cl溶液。氨电极使用的上限为1mol/L,下限为10-6mol/L。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc内充液中NH4+远大于生成的NH4+，故其变化可以忽略不计，932、CO2的测量（1）CO2电极（测溶液中的CO2）结构与氨电极类似。测量CO2时，气体透过电极膜，CO2和水反应，达到以下平衡：CO2+H2OHCO3-+H+产生的氢离子引起pH的变化，就可以测出溶解CO2的浓度。如果CO2扩散在水或NaHCO3的水溶液中，它们的pH值会依据下列的式子而变化：发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc2、CO2的测量（1）CO2电极（测溶液中的CO2）结构与氨94在纯水中pH=常数＋lg

在NaHCO3溶液中pH=常数-lgpCO2在NaHCO3溶液中测量能方便地确定pH和pCO2之间的对应关系。使用特殊的气体渗透膜，它能够使CO2扩散到NaHCO3溶液中去，溶液中pH变化就是CO2实际分压的测量值

发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc在纯水中pH=常数＋lg在NaHCO3溶液中pH95(2)尾气CO2的测量常用的尾气测定仪是不分光红外线二氧化碳测定仪（简称IR），其精度高，可达±0.5%，量程的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞培养时常被采用。不分光红外线CO2气体分析原理是：除了单原子气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段（即微米级）具有不同的红外吸收光谱，CO2的红外吸收峰在2.6~2.9μm和4.1~4.5μm之间有两个吸收峰，根据吸收峰值可以求出CO2的所含浓度。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc(2)尾气CO2的测量常用的尾气测定仪是不分光红外线二氧化碳96（3）尾气氧的仪器分析采用热磁氧分析仪测定原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。将排气通入热磁氧分析仪，就可测出排气氧的含量。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc（3）尾气氧的仪器分析发酵过程控制微生物培养过程的参数检测h97通过RQ值的测定，可以分析微生物可能利用的基质——氧化型的或还原型的，分析微生物生长阶段，分析补料的速率是否合理例如，储炬等发现RQ的变化与菌体生长、营养状况以及产生抗生素密切相关。如20h菌丝开始发生膨大，而此时RQ达到峰值开始下降；40h左右RQ降至谷底开始回升，正是在这段时间产生抗生素启动。由于RQ具有以上的关联特性，他们尝试在avemectin发酵过程中利用RQ作为补料控制的参考之一。3、排气氧、排气CO2和呼吸熵发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc通过RQ值的测定，可以分析微生物可能利用的基质——氧化型的或98酶电极与气敏电极相似，是在离子选择性电极的表面覆盖一个涂层，把酶固定在涂层内，通过酶反应产生的物质的测定，可以推算出反应物的量。例如脲酶电极，把脲酶固定在NH3气敏电极或CO2气敏电极的表面，在脲酶的催化下，尿素可以发生如下的分解反应：CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2通过NH3或CO2气敏电极测定NH3或CO2的分压即可达到间接测定尿素的目的。4、酶电极发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc酶电极与气敏电极相似，是在离子选择性电极的表面覆盖一个涂层，99（三）溶氧的测定

对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，了解发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键方面。现在发酵中溶氧测定大多用溶氧电极来测定。溶氧电极可分为极谱型和原电池型。极谱型需极化电压及放大器，耗氧少，受气流影响小原电池型简单便宜，适于中小罐。耗氧较大，受气流和气泡影响大。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc（三）溶氧的测定对于好氧微生物来100现在国内外测定溶液中的溶解氧基本上用极谱型的复膜氧电极。复膜氧电极可分为敞口式封闭式发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc现在国内外测定溶液中的溶解氧基本上用极谱型的复膜氧电极。发酵101敞口式在电极的玻璃管上有一个小孔，使玻璃管与环境相通，这样在蒸汽灭菌时电极玻璃管内外压力相等，有利于保护电极封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸汽灭菌时玻璃管受压大现在使用的大多数是敞口式电极发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc敞口式在电极的玻璃管上有一个小孔，使玻璃管与环境相1021、复膜氧电极的工作原理阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由铅、锡、铝等组成。当给电极施加极谱电压（0.6~0.8V负电压）时，溶液中的氧就在阴极被还原。当产生的电流与溶液中氧含量成正比时，此时的电极电流为饱和电流，此时的电压为极谱电压。氧浓度与饱和电流成正比关系。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc1、复膜氧电极的工作原理阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由103在阴极表面发生的电极反应：1/2O2+H2O+e-2OH-阴极上失去电子后，阳极反应产生的电子流向阴极，于是在二电极之间形成电流，将氧的信号转变成电信号。氧浓度越高，电流越大。阳极上的反应是：Pb+2ACO-Pb(ACO)2+2e-化学信号转变成电信号发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc在阴极表面发生的电极反应：阴极上失去电子后，阳极反应产生的电1042、电极的构造在阴极银（铂）片的前面包一张半透膜，氧可以透过半透膜达到阴极上进行电极反应。该半透膜固定在阴极表面。小孔用于压力补偿。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc2、电极的构造在阴极银（铂）片的前面包一张半透膜，氧可以透过1053、溶氧电极的影响因素（1）电极的灵敏度电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定条件下当膜成为氧扩散的控制因素时，氧分压的变化与电流输出的稳态有以下对应式：IS=NFA(pm/dm)pO2式中IS——电极电流N——电子数F——法拉第常数A——阴极表面积Pm——氧在复膜中的穿透系数PO2——被测溶液中的氧分压dm——膜的厚度发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc3、溶氧电极的影响因素（1）电极的灵敏度电极的阴极表面覆盖了106增加灵敏度因素：增加膜穿透系数pm减小膜厚度dm增加阴极表面积A扩散速度因为电极表面的氧浓度与液体主流中的氧浓度存在浓度梯度搅拌速度、通气量和培养液粘度发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc增加灵敏度因素：扩散速度因为电极表面的氧浓度与107（2）温度的影响电极还会受温度的影响氧在溶液中的溶解度随温度上升而下降温度上升使膜穿透系数增加，且氧的内相扩散增加，增加了电化学反应速率。由于后者影响比较显著，因此随着温度的上升，电极输出电流呈指数上升。所以电极须有温度补偿功能，才能真正反映出氧溶解度变化的情况。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc（2）温度的影响电极还会受温度的影响发酵过程控制微生物培养过1084、电极的标定一般测定中应进行以下二点标定（1）零点标定用饱和Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降稳定后，调节零点旋钮显示零值。

（2）饱和校正（满刻度）进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至100%即为饱和值。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc4、电极的标定一般测定中应进行以下二点标定（1）零点标定用饱1095.摄氧率r的测定(1)用溶氧电极测定r要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的变化。测定前先用纯水标定电极，得到单位电流代表的溶氧浓度：

I饱——在饱和氧浓度C*时的电流值I残——氧浓度为零时电极所具有的电流发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc5.摄氧率r的测定(1)用溶氧电极测定r要求电极响应时间短，110若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，保持搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。此时，由于耗氧，CL下降，仪表上电流值也不断下降。R=(-△i/△t)

△t——停止供气后CL下降到最低点时所需时间△i——在△t时间内的电流变化发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，保持搅拌，在罐顶通氮111(2)用热磁氧分析仪测定原理是氧具有高顺磁性，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少，根据排气中的氧含量，可以算出摄氧率设进口氧含量为21%r=每小时通气量×（0.21-出口氧%）*22.4×1000*V发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc(2)用热磁氧分析仪测定原理是氧具有高顺磁性，氧气的磁化率比1126、氧传递系数kLa的测定设备的KLa可以用亚硫酸钠法来测定，但它是在非发酵过程中测定的，不能完全代表发酵过程中的KLa值。其它测定方法有(1)用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定值表示此时供氧和需氧达到平衡，即r=KLa(C*-CL)式中C*可以查得，CL可以用溶氧电极测得，r也可算出，因此可求得KLa值发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc6、氧传递系数kLa的测定设备的KLa可以用亚硫酸钠法来测定113例：一装料为7L的发酵罐，通气量1l/L.m，操作压力为0.3Kg/cm2，在某发酵时间内发酵液的溶氧浓度为饱和氧浓度的25%，空气进入时的氧含量为21%，废气排出时的氧含量为19.8%（1atm时氧饱和浓度C*=0.2mmol/L）求此时菌的摄氧率r=1*7*60/22.4*103*(0.21-0.198)/7KLa＝r/0.26(98)发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc例：一装料为7L的发酵罐，通气量1l/L.m，操作压力为0.114(2)单用溶氧仪测定用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时供氧和需氧达到平衡，溶氧是一条水平线。这是停止通气，保持搅拌，在罐顶通入氮气，赶掉氧气。由于微生物对氧的利用，溶氧迅速下降，过一段时间溶氧下降缓慢，待溶氧到最低点后在恢复通气。这样可以得到溶氧随时间变化的曲线发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc(2)单用溶氧仪测定用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时供氧和115△CL/△t=KLa(C*-CL)-rCL=-1/KLa(△CL/△t+r)+C*将CL对△CL/△t+r作图，得到一条直线，斜率为-1/KLa因此可求得KLa,延长直线与纵坐标相交点为C*溶解氧浓度随通气变化的情况KLa的求取发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc△CL/△t=KLa(C*-CL)-r溶解氧浓度随通气变化的116二参数的离线检测进展（一）利用高效液相（HPLC）分析代谢中间产物通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有的放矢的控制发酵过程发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc二参数的离线检测进展（一）利用高效液相（HPLC）117例：鸟苷生产在鸟苷发酵中，发现发酵到40小时后鸟苷合成速率下降，但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖,使发酵过程pH下降，补入氨水增多。那么糖耗到哪里去了呢？于是进行以下一些测定与分析发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc例：鸟苷生产在鸟苷发酵中，发现发酵到40小时后鸟苷合成速率下118什么因素导致pH下降？1、有机酸的积累有机酸积累pH下降补加氨水在正常代谢情况下，细胞通过EMP途径和TCA循环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累若发酵后期有机酸积累会引起加入的[NH4+]积累，相应出现产苷速率下降。——代谢不正常发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc什么因素导致pH下降？1、有机酸的积累发酵过程控制微生物培养119测定以下中间物发酵后期丙酮酸积累发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc测定以下中间物发酵后期丙酮酸积累发酵过程控制微生物培养过程的1202、氨基酸的积累在有机酸分析的基础上进一步通过HPLC测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有机酸和[NH4+]积累。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc2、氨基酸的积累发酵过程控制微生物培养过程的参数检测http121氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在8小时之前已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在48小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累量达到初始量的12.6倍之多，其它十余种氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸1223、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于EMP途径代谢流的增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（GS）造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc3、分析原因发酵过程控制微生物培养过程的参数检测http:/123丙酮酸积累氨水补加增加[NH4+]积累抑制GS抑制TCA循环丙酮酸积累激活磷酸果糖激酶EMP流量增加恶性循环丙氨酸积累发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc丙酮酸积累氨水补加增加[NH4+]积124（二）代谢流迁移的酶学证明糖代谢途径关键酶糖酵解途径（EMP）在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶的时序分析发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc（二）代谢流迁移的酶学证明发酵过程控制微生物培养过程的参数12512小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，所以PFK的活力相对较低。24小时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平稳。但是到40小时以后，鸟苷形成速率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，PFK相对酶活增加，这表明此时通过EMP途径的糖代谢通量已有了明显的增加。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，所以PFK126丙酮酸激酶时序分析发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc丙酮酸激酶时序分析发酵过程控制微生物培养过程的参数检测htt127丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在24小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素磷酸戊糖途径（HMP）关键酶磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6－磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化6－磷酸葡萄糖脱氢生成6－磷酸葡萄糖酸内酯。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在24小时就基本上达1286－磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析由图可以看到，早期6－磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过HMP途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持EMP和HMP途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到40小时后，6－磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在HMP途径通量下降而EMP途径通量增加。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc6－磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析由图可以看到，早期6－磷酸葡萄糖129三羧酸(TCA)循环的关键酶三羧酸循环是“消耗”丙酮酸的途径，三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的关键酶为柠檬酸合成酶，其催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸循环中的第一个限速步骤。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc三羧酸(TCA)循环的关键酶三羧酸循环是“消耗”丙酮酸的途径130柠檬酸合成酶时序分析发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc柠檬酸合成酶时序分析发酵过程控制微生物培养过程的参数检测ht131从图可以看到，TCA循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时，TCA循环的通量并没有发生明显的增加。即代谢流迁移发生在EMP和HMP之间，主要是由于EMP和HMP途径之间的分配平衡被打破所造成的。EMP途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc从图可以看到，TCA循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中132丙氨酸脱氢酶的时序分析发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc丙氨酸脱氢酶的时序分析发酵过程控制微生物培养过程的参数检测h133在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓解了EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。结果加入EMP途径的抑制剂，克服了代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产量发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢酶134（三）与产物合成相关的酶和中间物测定例：螺旋霉素生物合成的代谢研究发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc（三）与产物合成相关的酶和中间物测定例：螺旋霉素生物合成的代135图3螺旋霉素生物合成代谢网络途径

发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc图3螺旋霉素生物合成代谢网络途径发酵过程控制微生物培养过136图1螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图

哪个代谢中间物过多积累发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc图1螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图哪个代谢中间物过137在发酵后期有FO-Ⅱ积累，要减少FO-Ⅰ转化为FO-Ⅱ必须降低C3酰化酶的活力，但这与SPⅡ、SPⅢ合成有矛盾在发酵结束时，SP-Ⅰ还有一定的积累，如能最大限度的转化为SP-Ⅱ、SP-Ⅲ，即加强步骤3对发酵效率和发酵效价是有积极意义的。而FO-Ⅱ、NSP-Ⅱ的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤4的通量。但由于这几个步骤的转化都是由C3酰化酶催化反应，这给改变通量带来一定的困难。发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc在发酵后期有FO-Ⅱ积累，要减少FO-Ⅰ转化为FO-Ⅱ必须138图2有机酸前体的动态流量分布图发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc图2有机酸前体的动态流量分布图发酵过程控制微生物培养过程的139在图2中，乙酸和丁酸在从40小时开始积累并在64小时达到最高值，对照图3螺旋霉素生物合成代谢网络途径[9]，我们可以推测在发酵中前期在图3中的步骤1也即大环成环步骤有一定程度的“瓶颈”影响，从而导致乙酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺旋霉素的效价。我们测定了内酯环合成相关的酶活——前体的活化发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc在图2中，乙酸和丁酸在从40小时开始积累并在64小时达到最高140酰基激酶和酰基CoA合成酶活性趋势测定酶活并建立酶活趋势曲线。分析：两种酶在发酵过程中都有两个活性高峰期,但出现的时间相差很大。酰基激酶的活性高峰期主要集中在发酵中前期酰基CoA合成酶的活性高峰期主要集中在发酵中后期。此外，酰基CoA合成酶的活性远小于酰基激酶的活性。

发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc酰基激酶和酰基CoA合成酶活性趋势发酵过程控制微生物培养过程141图1酰基激酶和酰基CoA合成酶活性趋势

酰基激酶酰基CoA合成酶发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/fjgc图1酰基激酶和酰基CoA合成酶活性趋势酰基激酶酰基Co142酰基激酶在发酵初期出现一个活性高峰，推测其参与了初级代谢；后一个活力峰出现在发酵中期，且与酰基CoA合成酶的第一个活力峰出现时间相一致，意味着酰基激酶对次级代谢同样有着重要作用。在螺旋霉素的生物合成中，酰基CoA合成酶的活性主要集中在发酵中后期，推测合成酶主要参与次级代谢。由于合成酶的活性较小，推测其可能是大环合成的“瓶颈”，如果提高其活性，就有可能大幅度提高发酵效价。

发酵过程控制微生物培养过程的参数检测/jpkc/f