基因工程目的基因的获取课件

第五章目的基因的获取目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。第五章目的基因的获取目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达1需要克隆的DNA片段编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系需要克隆的DNA片段编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系2目的基因的获取化学合成法基因组DNA文库;cDNA文库聚合酶链式反应直接从染色体DNA中分离目的基因的获取化学合成法基因组DNA文库;cDNA文库聚合酶3第一节基因组DNA片段化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切第一节基因组DNA片段化一、限制性内切酶法用限制性内4由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺5二、随机片断化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。（1）限制性内切酶的选用原则二、随机片断化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和61）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。（Sau3A—BamHI）1）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）672.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。（3）DNA溶液小孔喷射注射器法可将100kb以上的DNA剪切成10kb左右的片段。2.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断81976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。第二节化学合成目的基因要求：1、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2、分子量较小的目的基因的制备1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的9由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列*化学合成法获取目的基10一、目前常用的方法磷酸二酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。磷酸三酯法、一、目前常用的方法磷酸二酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化11①保护dNTP的5’端P或3’端-OH③用酸或碱的脱保护（1）原理1.磷酸二酯法②带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。①保护dNTP的5’端P或3’端-OH③用酸或碱的脱保12（2）合成过程下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。（2）合成过程下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的13原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接，然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具体的合成和延伸过程如图。

2.亚磷酸三酯法

原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH与一14基因工程目的基因的获取课件15化学合成的DNA片断一般在200bp以内。二、化学合成DNA片断的组装用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。1.互补连接法预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。（2）5’端磷酸化（1）互补配对（合成的DNA单链的5’端是-OH）化学合成的DNA片断一般在200bp以内。二、化学合成DN16T4DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA双链（3）连接酶连成完整双链T4DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的D172.互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物2.互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互181.直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的优点2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA3.合成探针序列4.定点突变合成合成带有定点突变的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低1.直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的优点2.合成引19DNA合成仪5.合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptorDNA合成仪5.合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点人工接20第三节PCR扩增获得目的基因以前讲过关于PCR相关的知识，在这里不在累述。第三节PCR扩增获得目的基因以前讲过关于PCR相关的知识21PCR可以把

指定的基因片段

数量放大染色体PCR

基因放大连琐反应聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)PCR可以把指定的基因片段数量放大染色体PCR基因放22第四节从基因文库、cDNA文库获取目的基因第四节从基因文库、cDNA文库获取目的基因23一、基因文库的构建1.基因文库（genelibrary）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，因此，称之为基因组文库（genomiclibrary）或基因文库（genelibrary）。一、基因文库的构建1.基因文库（genelibrary）24组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分25（2）目前常用的载体2.构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：容量为24kpcosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kb（2）目前常用的载体2.构建基因文库的载体选26断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。①物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。②酶切法：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切27（2）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接直接连接、人工接头或同聚物加尾。④人工接头法（adapter）同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接②平端连接③同聚物加尾连接（2）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接直28BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接BamHⅠ切割反应GGATCCT4DNA连接酶GATC29不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg30目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶重组体315´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶

5´3´

3´5´

5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´

5´

3´

3´5´

5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA

T(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体5´3´载体DNA5´3´目的基因限制酶或机械剪切限制酶32人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接头及其应用CCGAATTCG5´-EcoRⅠEco33基因工程目的基因的获取课件344.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）例如：从人基因组DNA（总长度为3×109bp）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为99％，那么这个基因组文库要多大？ln（1－0.99）

N=———————————————=9.2×106ln（1－1.5×103／3×109）4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所35若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9×105,而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右,均可满足建库要求。

三种常用基因组文库克隆载体的比较载体种类装载量转染率λ噬菌体粘性质粒(Cosmid)

酵母人工染色体(YAC)9～22kb30～45kb100～1000kb105～106转化子／μgDNA104～106转化子／μgDNA

～500转化子／μgDNA若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×361.cDNAlibrary二、cDNA文库的构建利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。2.cDNA(complementaryDNA，互补DNA)是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。1.cDNAlibrary二、cDNA文库的构建利用某种37（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。4.构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（totalRNA）提取3.cDNA文库的特点提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。（1）不含内含子序列。4.构建cDNA文库的一般步骤（1）38分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化①原理②mRNA的分离纯化Column（柱）分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。利39基因工程目的基因的获取课件40反转录酶mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成oligo(dT)引导的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。反转录酶mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTT41随机引物引导的cDNA合成法

(randomlyprimedcDNAsynthesis)：

根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。随机引物引导的cDNA合成法(randomlyprime42用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’3’5’5’引物cDNA第一链3’5’引物②降解mRNA模板或RNaseH碱用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mR43③cDNA第二链合成剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。a.自身引导合成法：③cDNA第二链合成剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一44cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一45去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导46b.置换合成法：原理：以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链。获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失b.置换合成法：原理：获得的双链cDNA5’端也会有47优点：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化

c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA优点：a）合成cDNA的效率高48c.引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列c.引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列49d.引物-衔接头法d.引物-衔接头法50在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。(4)cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶(5)双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。51基因工程目的基因的获取课件525.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）1n1n5.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRN53基因组DNA文库cDNA文库三、基因组DNA文库与cDNA文库的比较基因组DNA文库cDNA文库三、基因组DNA文库与cDNA文541基因组DNA文库的优点相对于cDNA文库，基因组文库的优点：cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列，

cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难；从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。1基因组DNA文库的优点相对于cDNA文库，基因组文库的552cDNA文库的主要优点①cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。②cDNA文库的筛选比较简单易行。③每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。④cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。⑤cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。2cDNA文库的主要优点①cDNA文库以mRNA为材料，特563cDNA克隆的主要的缺点cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。3cDNA克隆的主要的缺点cDNA文库所包含的遗传信息要57四、基因文库的筛选与鉴定重组体(recombinant，转化子transformant)：就是掺入或导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。四、基因文库的筛选与鉴定重组体(recombinant，转化581、表型筛选法（一）基因文库的筛选(2)插入失活筛选法(3)显色反应选择法(α-互补法)2、PCR筛选法(1)抗药性筛选3、菌落原位杂交法4、免疫筛选法1、表型筛选法（一）基因文库的筛选(2)插入失活筛选法(3)59（二）基因文库的鉴定1、限制性核酸内切酶分析

2、SouthernBlotting3、DNA序列测定法（二）基因文库的鉴定1、限制性核酸内切酶分析2、Southe60第五章目的基因的获取目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。第五章目的基因的获取目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达61需要克隆的DNA片段编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系需要克隆的DNA片段编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系62目的基因的获取化学合成法基因组DNA文库;cDNA文库聚合酶链式反应直接从染色体DNA中分离目的基因的获取化学合成法基因组DNA文库;cDNA文库聚合酶63第一节基因组DNA片段化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切第一节基因组DNA片段化一、限制性内切酶法用限制性内64由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺65二、随机片断化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。（1）限制性内切酶的选用原则二、随机片断化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和661）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。（Sau3A—BamHI）1）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）6672.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。（3）DNA溶液小孔喷射注射器法可将100kb以上的DNA剪切成10kb左右的片段。2.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断681976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。第二节化学合成目的基因要求：1、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2、分子量较小的目的基因的制备1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的69由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列*化学合成法获取目的基70一、目前常用的方法磷酸二酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。磷酸三酯法、一、目前常用的方法磷酸二酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化71①保护dNTP的5’端P或3’端-OH③用酸或碱的脱保护（1）原理1.磷酸二酯法②带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。①保护dNTP的5’端P或3’端-OH③用酸或碱的脱保72（2）合成过程下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。（2）合成过程下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的73原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接，然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具体的合成和延伸过程如图。

2.亚磷酸三酯法

原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH与一74基因工程目的基因的获取课件75化学合成的DNA片断一般在200bp以内。二、化学合成DNA片断的组装用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。1.互补连接法预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。（2）5’端磷酸化（1）互补配对（合成的DNA单链的5’端是-OH）化学合成的DNA片断一般在200bp以内。二、化学合成DN76T4DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA双链（3）连接酶连成完整双链T4DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的D772.互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物2.互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互781.直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的优点2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA3.合成探针序列4.定点突变合成合成带有定点突变的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低1.直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的优点2.合成引79DNA合成仪5.合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptorDNA合成仪5.合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点人工接80第三节PCR扩增获得目的基因以前讲过关于PCR相关的知识，在这里不在累述。第三节PCR扩增获得目的基因以前讲过关于PCR相关的知识81PCR可以把

指定的基因片段

数量放大染色体PCR

基因放大连琐反应聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)PCR可以把指定的基因片段数量放大染色体PCR基因放82第四节从基因文库、cDNA文库获取目的基因第四节从基因文库、cDNA文库获取目的基因83一、基因文库的构建1.基因文库（genelibrary）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，因此，称之为基因组文库（genomiclibrary）或基因文库（genelibrary）。一、基因文库的构建1.基因文库（genelibrary）84组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分85（2）目前常用的载体2.构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：容量为24kpcosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kb（2）目前常用的载体2.构建基因文库的载体选86断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。①物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。②酶切法：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切87（2）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接直接连接、人工接头或同聚物加尾。④人工接头法（adapter）同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接②平端连接③同聚物加尾连接（2）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接直88BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接BamHⅠ切割反应GGATCCT4DNA连接酶GATC89不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg90目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶重组体915´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶

5´3´

3´5´

5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´

5´

3´

3´5´

5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA

T(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体5´3´载体DNA5´3´目的基因限制酶或机械剪切限制酶92人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接头及其应用CCGAATTCG5´-EcoRⅠEco93基因工程目的基因的获取课件944.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）例如：从人基因组DNA（总长度为3×109bp）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为99％，那么这个基因组文库要多大？ln（1－0.99）

N=———————————————=9.2×106ln（1－1.5×103／3×109）4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所95若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9×105,而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右,均可满足建库要求。

三种常用基因组文库克隆载体的比较载体种类装载量转染率λ噬菌体粘性质粒(Cosmid)

酵母人工染色体(YAC)9～22kb30～45kb100～1000kb105～106转化子／μgDNA104～106转化子／μgDNA

～500转化子／μgDNA若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×961.cDNAlibrary二、cDNA文库的构建利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。2.cDNA(complementaryDNA，互补DNA)是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。1.cDNAlibrary二、cDNA文库的构建利用某种97（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。4.构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（totalRNA）提取3.cDNA文库的特点提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。（1）不含内含子序列。4.构建cDNA文库的一般步骤（1）98分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化①原理②mRNA的分离纯化Column（柱）分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。利99基因工程目的基因的获取课件100反转录酶mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成oligo(dT)引导的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。反转录酶mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTT101随机引物引导的cDNA合成法

(randomlyprimedcDNAsynthesis)：

根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。随机引物引导的cDNA合成法(randomlyprime102用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’3’5’5’引物cDNA第一链3’5’引物②降解mRNA模板或RNaseH碱用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mR103③cDNA第二链合成剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。a.自身引导合成法：③cDNA第二链合成剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一104cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一105去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导106b.置换合成法：原理：以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链。获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失b.置换合成法：原理：获得的双链cDNA5’端也会有107优点：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化