纳豆芽孢杆菌答辩 课件

纳豆芽孢杆菌发酵聚谷氨酸过程中专业：*****研究生：*****指导老师：*****教授

*****副教授

二○一四年五月二十二日谷氨酸脱氢酶钙调机制研究陕西师范大学硕士毕业论文答辩汇报内容研究背景与意义1谷氨酸脱氢酶钙调节机制研究3谷氨酸脱氢酶基因的验证2钙离子对发酵的调控作用4结论与展望5研究背景与意义1研究背景与意义

γ-PGA是由L-谷氨酸(L-glutamicacid)或D-谷氨酸(D-glutamicacid)单体通过α-氨基与γ-羧基缩合而成的多肽分子，其结构式如图所示。微生物发酵法化学合成法(γ-PGA、α-PGA)

γ-PGAL-GluD-Glu+γαγα微生物发酵聚谷氨酸概述研究背景与意义聚谷氨酸产生菌纳豆食品纳豆激酶聚谷氨酸γ-PGA发现于1937年，从一种致病的革兰氏阳性细菌炭疽芽孢杆菌的荚膜中分离得到。其后发现了多种芽孢杆菌均能产生这种物质，主要包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。由于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的易培养性和生物安全性，目前对于这两种菌生产γ-PGA的研究报道较多。在聚谷氨酸的发酵生产中，纳豆芽孢杆菌作为一类从纳豆发酵食品中分离出来的主要菌株，在生产食品级γ-PGA中发挥了巨大的作用。纳豆芽孢杆菌研究背景与意义金属离子对聚谷氨酸发酵的影响金属离子生产菌株调控作用Mn2+B.licheniformisNCIMB11709、B.subtilisNX-2产生不同程度的γ-PGA的D-异构体；延长细胞活力K+Bacillussp.RKY3激发菌体细胞的生长及γ-PGA的产生Mg2+Bacillussp.RKY3激发菌体细胞的生长及γ-PGA的产生Na+B.subtilis

chungkookjung有效减少泡沫，降低粘度，改善溶氧及传质；降低γ-PGA的分子量大小Ca2+Bacillussubtilis

HSF1410降低γ-PGA发酵液的粘度；提高γ-PGA产量；不会引起γ-PGA分子量的变化表1-1不同金属离子对发酵的调控作用研究背景与意义L-Glu主要是由α-酮戊二酸和NH4+由GDH催化合成，接着，ATP被谷氨酸依赖的ATP水解酶水解为ADP和Pi，然后磷酸基团结合到小分子γ-PGA的C-末端，之后D-或者L-谷氨酸的氨基端与C端磷酸化了的小分子γ-PGA发生亲核攻击，生成Pi并延伸γ-PGA链。

前期研究发现，Ca2+添加后，菌体内α-酮戊二酸节点上的谷氨酸脱氢酶与未加入Ca2+相比，酶活显著提高，因此α-酮戊二酸更多地流向了与NH4+形成谷氨酸，合成更多的γ-PGA。谷氨酸依赖的ATP酶PGA聚合酶聚谷氨酸的生物合成途径图1-1γ-PGA生物合成途径谷氨酸脱氢酶研究背景与意义α-酮戊二酸+NH3+NAD(P)HL-谷氨酸+NAD(P)（NADH，NADPH，NAD(P)H三种辅酶依赖型）GDHBacillussubtilis谷氨酸脱氢酶微生物调控机制立题依据γ-PGA是一种由微生物发酵生产而得的高分子物质，具有良好的水溶性、生物相容性和生物可降解性，因此在食品、农业、化妆品、制药业以及环保等领域应用非常的广泛。国内微生物发酵法生产规模小，成本高，发酵水平低，造成γ-PGA产品价格昂贵，严重制约着这种生物高聚物的实际应用水平。因此，如何降低γ-PGA生产成本、提高γ-PGA的产量，是目前γ-PGA研究领域中的重要课题之一。该研究以γ-PGA合成中底物谷氨酸供给调控机制为突破口，打破以往局限于γ-PGA合成酶及其调控的研究策略，不仅可初步阐明钙调节GDH活性和谷氨酸合成机制，而且为γ-PGA合成机制研究提供更广泛的理论和实验证据，也有利于为进一步提高γ-PGA合成水平提供人为控制的技术策略。谷氨酸脱氢酶基因的验证Strains/plasmidDescriptionSource/referenceB.subtilisHSF1410Isolatedfrom“natto”黄柏祺,2010E.coliDH5αF-endA1glnV44thi-1recA1gyrA96deoRnupGΦ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169hsdR17(rK-mK+)λ–Hanahan,1985E.coliBL21(DE3)F-ompTgaldcmlonhsdSB(rB-mB-)λ(DE3[lacIlacUV5-T7gene1ind1sam7nin5])Studier,F.W.,1986plasmidspET28a(+)ExpressvectorKmrT7lacHis-Tag(N,C)T7-tag11(I)thrombin陕西省微生物研究所万一研究员T-VectorpMD™19(Simple)ClonevectorAprTakara表2-1菌株与质粒实验材料谷氨酸脱氢酶基因的验证构建过程：PCR获得gdhA基因，TA克隆于T载体中；将表达载体与含目的片段的T载体分别经双酶切，T4连接酶过夜连接得到含目的基因的重组质粒。体外表达：将重组质粒电击导入大肠杆菌BL21宿主菌中，经IPTG诱导表达目的蛋白，SDS法验证目的蛋白的表达。图2-1pET28a/gdhA构建过程示意图实验方法谷氨酸脱氢酶基因的验证结果与分析1.gdhA克隆、生物信息学分析及载体构建对pET28a/gdhA双酶切，出现两条DNA片段，一条是pET28a载体片段（约5.3kb），一条是gdhA谷氨酸脱氢酶基因片段（约1.3kb）。生物信息学显示，此gdhA谷氨酸脱氢酶基因有1275个碱基，可编码424个氨基酸残基，蛋白分子式C2084H3312N570O630S19，分子量47.05kDa，等电点5.58，总原子数6615，脂溶指数87.59，疏水性平均值-0.255，是一个亲水性蛋白。图2-2基因组提取、gdhAPCR扩增与重组质粒双酶切电泳图谷氨酸脱氢酶基因的验证图2-3gdhA蛋白质二级结构分析图结果：gdhA蛋白序列中，α-螺旋192个，没有β-螺旋，延伸链68个，β-转角36个，其余为无规则卷曲128个。分析：预测表明该蛋白的二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲。谷氨酸脱氢酶基因的验证2.gdhA基因的体外诱导表达结果：E.coliBL21表达宿主成功目的蛋白，且目的蛋白的表达量随着诱导时间的增长而增加，而未经诱导的菌体内不含该目的蛋白。该诱导表达蛋白分子量约47kDa，与gdhA谷氨酸脱氢酶的分子量（47.05kDa）大小一致。分析：证明该目的蛋白的编码基因gdhA为正确的谷氨酸脱氢酶基因。图2-4IPTG诱导后菌体全蛋白电泳图谷氨酸脱氢酶基因的验证小结与讨论（1）成功从纳豆芽孢杆菌HSF1410中克隆得到gdhA谷氨酸脱氢酶基因，基因全长1,275bp，GC含量44.16%。序列比对发现该基因与NCBI上报道的Bacillussubtilissubsp.nattogudB谷氨酸脱氢酶序列具有100%同源性。（2）构建重组表达质粒pET28a/gdhA，成功于大肠杆菌BL21中进行gdhA目的蛋白的表达，蛋白表达水平随着时间的增长而增大。所获得的目的蛋白分子量与预测的gdhA编码蛋白分子量相一致，确证gdhA确为谷氨酸脱氢酶基因。（3）可在此基础上继续进行融合蛋白的纯化与酶活验证实验，以确认所得到的目的蛋白具有谷氨酸脱氢酶活性为宜。

谷氨酸脱氢酶钙调节机制研究（1）液体种子培养基：液体LB培养基，pH7.0，121℃蒸汽灭菌20min；（2）发酵培养基：葡萄糖20g/l，谷氨酸钠10g/l，NH4Cl1g/l，酵母粉1g/l，K2HPO43g/l，MgSO40.2g/l，pH7.0，121℃蒸汽灭菌20min。培养基实验仪器与设备UV-Vis分光光度计（TU-1810型）北京普析通用仪器有限责任公司PikoRealreal-timePCRsystem美国Thermo公司微量核酸蛋白测定仪（NanodropND2000型）美国Thermo公司其他仪器及设备见第二章2.1.2。谷氨酸脱氢酶钙调节机制研究实验技术路线推测与假设谷氨酸脱氢酶钙调节机制研究结果与分析图3-1粗酶液中添加不同浓度CaCl2时GDH活性结果：GDH比活力均在190U/mg左右，方差分析后可知，添加不同浓度Ca2+对粗酶液中谷氨酸脱氢酶活性变化影响不显著（p=0.934>0.05）。分析：钙离子对GDH没有体外直接激活作用。1.钙离子对谷氨酸脱氢酶的体外调节作用谷氨酸脱氢酶钙调节机制研究2.钙离子对谷氨酸脱氢酶的体内调节作用（1）不同钙离子浓度下谷氨酸脱氢酶酶活分析图3-2发酵液中添加不同浓度CaCl2时GDH活性结果：随着Ca2+浓度不断增大，GDH比活力逐步升高。方差分析可知，发酵过程中添加不同浓度Ca2+对GDH活性变化影响显著（p=0.000<0.05）。分析：猜测Ca2+在生物体内调节了GDH基因的转录水平，使得酶的表达量提高。谷氨酸脱氢酶钙调节机制研究①总RNA提取及引物退火温度优化实验图3-3总RNA电泳图图3-4gapdh基因和gdhA的PCR产物对提取的总RNA进行甲醛变性胶电泳，23S及16S条带清晰完整，说明提取的RNA完整性很好。Tm=60℃时，分别对gapdh，gdhA基因进行扩增，产物条带清晰，长度正确，无引物二聚体。验证引物特异性良好，退火温度适宜。谷氨酸脱氢酶钙调节机制研究②扩增效率测定基因名线性回归方程R2扩增效率gapdhY=-3.338X+43.0790.996999.336%gdhAY=-3.423X+33.5380.998395.955%表3-2内参及目的基因相对标准曲线图3-5相对标准曲线、扩增曲线及熔解曲线结果：PCR体系稳定，引物扩增效率高，实验重复性好。熔解曲线单一峰，峰型尖锐无杂峰，说明定量PCR体系结果真实可靠。分析：两基因扩增效率均在95-105%范围内，相差不大，表明可以采用相对定量的方法测定目的基因的相对表达量。谷氨酸脱氢酶钙调节机制研究③钙离子对gdhA谷氨酸脱氢酶基因转录水平的影响图3-6不同CaCl2浓度组gdhA相对表达量图3-7gdpdh与gdhA扩增曲线及熔解曲线结果：CaCl2浓度分别为0、0.05、0.1、0.15、0.2‰（w/v）时，gdhA相对表达量之比为：1:1.18:1.27:1.57:1.76。分析：证实了猜想Ca2+可在菌体生长过程中进入细胞内，通过调控gdhA的mRNA转录水平，增加GDH在菌体中的表达量，使酶活性提高。汇报内容研究背景与意义1谷氨酸脱氢酶钙调节机制研究3谷氨酸脱氢酶基因的验证2钙离子对发酵的调控作用4结论与展望5钙离子对发酵的调控作用材料与仪器全自动氨基酸分析仪（L-8900型）日本HITACHI公司其余实验材料和仪器均参考第三章。实验方法消解液的制备不同浓度钙离子发酵培养取200μL消解液氮气吹干，0.2M盐酸定容至5mL，过滤后进样分析取上清发酵液加入浓盐酸110℃消解22h1.生物量的测定：OD6002.γ-PGA产量及NH4Cl消耗量测定上述离心后的上清发酵液适当稀释后直接过滤，进样分析未消解液的制备通过计算获得γ-PGA产量和NH4Cl消耗量钙离子对发酵的调控作用结果与分析1.钙离子对发酵液中菌体生物量的影响图4-1不同CaCl2浓度组对发酵液中生物量的影响结果：随着Ca2+浓度的升高发酵液中生物量不断下降。这说明Ca2+对纳豆芽孢杆菌的生长繁殖具有逆影响。分析：生物量也是影响γ-PGA产量的重要因素，生物量的下降势必会造成γ-PGA的产量的降低。钙离子对发酵的调控作用2.钙离子对γ-PGA产量的影响图4-2不同CaCl2浓度组中γ-PGA的产量结果：当发酵液中Ca2+浓度逐渐升高时，γ-PGA产量呈先升高后降低的趋势。当CaCl2浓度为0.1‰时，γ-PGA产量可达最大为9.68g/L。分析：γ-PGA产量的变化是Ca2+对GDH活性的调控与对发酵生物量的影响两者共同作用的结果。钙离子对发酵的调控作用3.钙离子对发酵液中NH4Cl消耗量的影响图4-3不同CaCl2浓度组中NH4Cl的消耗量结果：当发酵液中Ca2+浓度升高时，NH4Cl的消耗量呈先升高后降低的趋势。当CaCl2浓度为0.1‰时，NH4Cl的消耗量可达最大0.766g/L。分析：该结果γ-PGA产量变化结果相一致。钙离子对发酵的调控作用4.钙离子对γ-PGA产量调控的可能原因分析Ca2+增加胞内GDH表达量菌体生长繁殖具有抑制作用钙离子对发酵的调控作用小结与讨论（1）实验表明在发酵过程中Ca2+对菌体的生长繁殖具有一定的抑制作用。（2）实验表明在发酵过程中Ca2+对γ-PGA产量及底物NH4Cl消耗量具有影响作用。CaCl2浓度为0.1‰时，γ-PGA产量可达最大9.68g/L，底物NH4Cl消耗量同样为最大0.766g/L。（3）本研究分析了Ca2+对γ-PGA产量调控的可能原因，以期为Ca2+调控γ-PGA发酵提供理论依据。汇报内容研究背景与意义1谷氨酸脱氢酶钙调节机制研究3谷氨酸脱氢酶基因的验证2钙离子对发酵的调控作用4结论与展望5结论与展望结论本文以纳豆芽孢杆菌HSF1410为实验材料，研究了GDH的Ca2+调控机制以及Ca2+对发酵的调控影响，得出的结论如下：（1）获得gdhA谷氨酸脱氢酶基因，序列比对得知gdhA与NCBI上已报道的B.subtilisnattogudB谷氨酸脱氢酶基因序列具有100%同源性；构建重组表达质粒pET28a/gdhA，于大肠杆菌BL21中成功进行体外表达，所获目的蛋白与预测的gdhA编码蛋白分子量一致，确证gdhA确为谷氨酸脱氢酶基因。（2）明确了GDH的Ca2+调节机制。Ca2+对GDH无体外直接激活作用，而是在发酵过程中进入胞内，通过调控gdhA的mRNA转录水平，增加了GDH在菌体中的表达量，从而使细胞内GDH活性升高。结论与展望（3）考察了发酵过程中Ca2+对菌体生物量、γ-PGA产量以及NH4Cl消耗量的影响。结果表明：在发酵过程中，Ca2+对菌体的生长繁殖具有一定的抑制作用；且对γ-PGA产量和NH4Cl消耗量均具有影响作用。实验发现，发酵液中CaCl2最佳添加量为0.1‰，此时γ-PGA产量可达最大9.68g/L。（4）本研