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乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的监测

缪晓辉2009.5一、HBV耐药的有关定义二、各种耐药检测技术的评价三、需要重视的几个问题一、HBV耐药的有关定义

病毒学突破（virologicbreakthrough）病毒反跳（viralrebound）生化学突破（biochemicalbreakthrough）HBV基因型耐药（genotypicresistance）HBV表型耐药（phenotypicresistance）临床耐药（clinicalresistance）HBV耐药的有关定义

病毒学突破（virologicbreakthrough）指在核苷类药物治疗过程中，患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA水平与最低值相比上升或超过1个log10（10倍）。HBV耐药的有关定义

病毒反跳（viralrebound）指核苷类药物治疗过程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治疗前水平。

HBV耐药的有关定义

生化学突破（biochemicalbreakthrough）指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平一度复常，但在继续治疗中血清ALT水平又再次升高。肝脏生活指标很多，但是在此仅指ALT。HBV耐药的有关定义

HBV基因型耐药（genotypicresistance）指HBV基因组中的某些位点发生改变，导致这种药物对HBV的抑制作用下降或消失。这种HBV基因变异与HBV的耐药性有直接因果关系，通过这些变异位点的检测可判断HBV有无耐药性。HBV耐药的有关定义

HBV表型耐药（phenotypicresistance）通过体外细胞培养方法，直接测定HBV对某种药物的敏感性，或者在体外直接测定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药，即表型耐药。通常以IC50来评估IC50＜5倍:敏感IC50在5～10倍:部分耐药IC50

＞10倍:耐药HBV耐药的有关定义

临床耐药（clinicalresistance）指临床出现病毒复制不能被抑制，或HBV复制一度被抑制后又出现HBVDNA反跳，同时伴有ALT升高，或肝炎复发的其他临床证据。二、各种耐药检测技术及评价病毒学反跳或突破的监测HBV基因型耐药监测HBV表型耐药检测临床耐药监测病毒学学反跳跳或突突破的的监测测基于对对血清清HBVDNA载载量的的动态态监测测需重视视以下下三点点：1.HBVDNA载载量检检测手手段的的敏感感性2.检检测技技术的的可靠靠性和和稳定定性3.监监测的的间隔隔时间间HBV基因因型耐耐药监监测时机非必须须不主张张常规规、广广泛应应用基因型型耐药药相关关变异异的命命名基因型型耐药药相关关变异异在在HBV多多聚酶酶序列列中的的位置置HBV基因因型耐耐药的的主要要技术术碱基序序列分分析法法直接测测序克隆测测序聚合酶酶链式式反应应及限限制性性片段段长度度多态态性技技术(PCR-RFLP)反向杂杂交分分析技技术（（INNO—LiPA））基因芯芯片技技术实时荧荧光定定量PCR技术术探针定定点突突变PCR技术术引物末末端碱碱基定定点突突变扩扩增技技术熔解曲曲线法法基质辅辅助激激光解解吸电电离飞飞行时时间质质谱(MALDI-TOFMS)直接测测序法法末端终止法化学裂解法DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。①简便、快速、准确可靠。②安全、无放射性污染。③模板用量大大减少。④测序能力增强。HBVYMDD变变异直直接测测序结结果图图谱直接DNA测序序的局局限性性1.设备贵贵、技技术高高、耗耗材、、费时时。2.必必须有有充足足目的的基因因片段段。3.突突变株株比例例小于于20%时时，由由于竞竞争抑抑制作作用不不能被被扩增增。直接测测序法法检测测HBVYMDD变异异1.JPG克隆测序法法克隆测序法法优点：1.有助于于发现混合合株并可大大致确定不不同序列毒毒株之间的相对对比。2.提高了了检测的灵灵敏度。局限性：1.技术难难度较高。。2.检测周周期更长。。3.检测的的费用大大大增加。碱基变异可可能导致：：①原有位位点消失②产生新新的位点③识别位位点移位利用错配引引物使PCR产物中中产生特特异异的酶切位位点结果:酶酶切切片段长、、短变化和和多、少变变化聚合酶链式式反应及限限制性片段段长度多态态性技术(PCR-RFLP)限制性内切切核酸酶的的作用它们能识别别DNA的的特异序列列，并在识识别序列内内或其旁切切割双链DNA。如如：NdeI限制酶的识识别序列和和切割位点点：CATATGGTATACNlaIll限制酶的识识别序列和和切割位点点：CATGNNNGTACNNNPCR-RFLP检检测HBVYMDD变异PCR错配引物设设计PCR-RFLP检检测HBVYMDD变异PCR-RFLP检检测HBVYMDD变异PCR-RFLP技技术的评价价优点：简单、广泛泛易开展。。缺点：1.限制性性内切酶种种类有限。。2.错配引引物将导致致退火温度度降低、非非特异条带带增多。3.引物非非完全匹配配，可能导导致扩增效效率降低、、检测敏感的下降降。反向杂交分分析技术（（INNO—LiPA）INNO——LiPA诊断HBVYMDD变异异DNA芯片片技术BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysisDNA芯片片技术诊断断HBVYMDD变异DetectionofYMDDMotifMutantsbyOligonucleotideChipsinLamivudine-UntreatedPatientswithChronicHepatitisBVirusInfection。JKoreanMedSci2004;19:541-546.DNA芯片片技术优点局局限性大通量技技术和设设备的要求求高快速检检测成成本高灵敏度高可平行检测测实时荧光定定量PCR在基因变变异中的应应用探针定点突突变PCR技术Taqman-MGB探针引物末端碱碱基定点突突变扩增技技术高分辨熔解解曲线法Taqman-MGB探针定定点突变PCR技术术Taqman-MGB探针技技术检测YMDD变异HBVDNA>105copies/mlW:M=1:1HBVDNA>105copies/mlW:M=10:1HBVDNA<105copies/mlW:M=10:1：W：M探针定点突突变PCR技术优点不不足灵敏度高需要相对较较贵的荧光光PCR仪仪特异性好需要多条荧荧光探针，，成本高费时短影响因素多多，存在一一定误判引物末端碱碱基定点突突变扩增技技术引物末端碱碱基定点突突变扩增技技术

检测测YMDD变异熔解曲线法法检测YMDD变异异特异性探针针，其Tm值不同溶解曲线分分析基质辅助激激光解吸电电离飞行时时间质谱(MALDI-TOFMS)原理MALDI-TOFMS检检测

HBVYMDD变异异的原理酶切分子量量.JPG基质辅助激激光解吸电电离飞行时时间质谱(MALDI-TOFMS)优点：高灵敏度、、准确度、、分辨率能发现相对对比例小于于1%的变变异株。局限性：设备昂贵，，目前国内内难以用于于临床检测测。HBV耐药药不同检测测技术的比比较AdvancesinMolecularDiagnosisofHBVInfectionandDrugResistance。。Int.J.Med.Sci.20052(1)：8-161Sensitivityherereferstothelowestlevel(%)atwhichanassaycandetectmixturesofmutantandwild-typevirus.2Informationcontentisconsideredasameasureofatest’sabilitytoprovidebroad,relevantinformationaboutpossiblenewmutations.3Updateabilityassessestheeaseatwhichatestcanbedaptedtoincorporatethedetectionofanewmutation.na,notapplicable.nd,notdetermined.HBV表型型耐药检测测有两种途径径：1.细胞外外HBV聚聚合酶活性性分析。2.细胞药药物敏感性性实验。细胞外HBV聚合酶酶活性分析析目前常用的的研究HBV聚合酶酶活性模型型是将HBV基因组组插入杆状状病毒载体体，继而转转染昆虫细细胞而表达达HBV颗颗粒，应用用亲和层析析法纯化HBV颗粒粒后，在细细胞外评价价药物对聚聚合酶活性性的影响。。细胞外HBV聚合酶酶活性分析析细胞药物敏敏感性实验验该方法类似似于细菌药药物敏感试试验。目前前多采用病病毒载体将将含有被检检测的含HBV变异异位点的全全基因组导导入肝细胞胞源性细胞胞株，然后后将各种浓浓度的核苷苷类药物加加入培养液液，经过一一定时间培培养后检测测细胞上清清中的HBVDNA含量。。细胞药物敏敏感性实验验细胞药物敏敏感性实验验该技术在操操作上非常常繁琐，目目前仅限于于研究之需需，主要用用于药物开开发研究，，尚不能用用于常规临临床分析。。临床耐药监监测YMDD变变异前后病病毒载量和和ALT的的变化HBVMDD变异异与病毒学学突破判断临床耐耐药时的建建议1.结合合核苷类药药物的应用用史、起始始病毒载量量、是否合合并其他肝肝病等。2.注意甄甄别依从性性不良。3.结合基基因变异位位点。三、需要重重视的几个个问题慎重对待天天然耐药的的结论。不要过分依依基因型耐耐药检测技技术。正确对待基基因分型技技术。YMDD自自然变异的的几组数据据AkarsuM等等采用InnoLipa法法检测71例未经抗抗病毒的成成年慢性乙乙肝携带者者，结果有有13例检检测到YMDD变异异株。LeeCZ等采用用引物末端端碱基定点点突变扩增增技术对28例拉米米夫定治疗疗前的CHB患者血血清进行了了YMDD变异毒株株检测，发发现有16例（57.1%））存在YMDD自然然变异毒株株。日本Kobayashi等检检测18例例无症状HBV携带带者,发现现5例YMDD变异异,占27.78%。本实验室关关于YMDD自然变变异

的2组数据19