ELISA试剂的选用和质检

ELISA试剂的选用和质检

卫生部临床检验中心王露楠影响试剂盒质量的因素试剂盒的选用试剂盒的质检方法目前试剂盒存在的问题影响试剂盒质量的因素1．原材料(1)固相材料商品ELISA试剂盒中基本上都使用聚苯烯塑料微孔板，其对ELISA试剂盒的影响在于孔间的显色差异。(2)抗原--自然抗原、合成抗原和基因重组抗原。纯度：纯度不高可致试剂盒的特异性不强。立体结构：合成抗原一般都是多肽抗原，缺乏完整抗原所具有的立体结构决定簇，用于相应的抗HCV和抗HIV抗体的检测有可能导致结合上述决定簇的抗体漏检。影响试剂盒质量的因素(3)抗体多克隆抗体(多抗)：制备简单，含针对抗原的多种决定簇，但抗体的亲和力和特异性相对要低于单抗，且每次制备的抗体在其亲和力和特异性上均有区别。单克隆抗体(单抗)：可无限大量的得到针对单一决定簇的抗体，缺点是结合的单一性。当建立双抗夹心ELISA测定方法时，如包被和指示抗体使用同一单抗，则由于结合位点的缺乏，很容易造成假阴性结果，尤其是在使用一步法时“钩状”效应(Hookeffect)的出现。因此，在使用单抗建立双抗夹心ELISA方法时，包被和指示抗体常使用针对抗原的不同决定簇的单抗，包被抗体可为混合单抗，从而使得固相抗体在免疫测定中能更为完全地结合待测物中的特异抗原。影响试剂盒质量的因素(4)酶结合物ELISA试剂盒的核心部分，通常ELISA试剂盒的有效使用期限即是根据酶结合物的稳定性而定的。辣根过氧化物酶(HRP)：易于提取，价格相对低廉；性质稳定，耐热及有机溶剂的作用，与抗原或抗体偶联后，活性很少受损失。碱性磷酸酶(ALP)：碱性磷酸酶用于ELISA必须注意的是含磷酸盐的缓冲液对其酶活性的抑制作用F半乳糖甘酶影响试剂盒质量的因素(5)色原底物：HRP最常用的色原底物有邻苯二胺(OPD)和四甲基联苯胺(TMB)。邻苯二胺(OPD)：OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，当pH值降为1.0时，最大吸收波长为492nm，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。四甲基联苯胺(TMB)：氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数。试剂盒中常为已配好的A、B两种液态试剂，即一定浓度双氧水溶液和TMB。它们在溶液中相对不稳定，因此在使用ELISA试剂盒时，如底物A·或／和B出现颜色，或各取一滴混合后显色，说明该试剂盒的底物溶液已变质或已受污染，必须废弃。·影响试剂盒质量的因素2．试剂盒的方法学设计双抗原夹心法测抗体(抗HIV、Tp)

洗板待测抗体底物温育显色酶标抗原EE洗板YYYYYY固相抗原EYYYEEEYYYEEE影响试剂盒质量的因素间接法测抗体（抗HCV、Tp)

洗板待测抗体底物温育显色EY酶标抗体EYEY洗板YYYYYYYYYEYEYEYYYYEYEYEY固相抗原影响试剂盒质量的因素双抗体夹心法测抗原-两步法固相抗体温育待测抗原底物温育显色YYYEY酶标抗体EYEYYYYYYYEYEYEYYYYEYEYEY影响试剂盒质量的因素双抗体夹心法测抗原-一步法待测抗原底物温育显色固相抗体YYYEY酶标抗体EYEYYYYEYEYEY洗板YYYEYEYEYEYYYYEYEYEY影响试剂剂盒质量量的因素素3．试剂剂盒的运运输和贮贮存ELISA试剂剂盒的效效期一般般为6个个月，这这是指在在贮存温温度为2～8ºC的情况况下，但但一个试试剂盒从从出厂至至用户手手中，均均要经历历运输(如送检检、检定定、发货货等)及及运输中中的贮存存，某一一环节的的不当，，均会影影响试剂剂盒的临临床使用用质量。。试剂盒的的选用1．根据据可能影影响试剂剂盒质量量的因素素，从以以下几个个方面来来判断该该试剂盒盒是否符符合我们们的要求求效期固相材料料的来源源包被抗体体或抗原原的性质质(单抗抗、多抗抗或合成成多肽或或重组多多肽)显色底物物(是TMB还还是OPD)测定模式式(一步步法或二二步法)试剂盒的的选用2．同行行对有关关试剂盒盒的使用用效果个别的使使用效果果在实际工工作中，，其它实实验室对对某种试试剂盒的的实际使使用效果果，往往往具有很很强的说说服力。。综合的使使用评价价对一种试试剂盒的的综合使使用评价价，是指指多个实实验室对对这种试试盒实际际应用效效果的综综合分析析。ELISA试剂剂盒的质质检1.包装装、储存存状态内外包装装、效期期、试剂剂瓶是否否漏液，，真空包包装是否否破损，，试剂是是否齐全全等等2.采用用血清盘盘(panel)质检检血清盘由由一定数数量的阴阴、阳性性样本组组成，可可用来判判断试剂剂盒的灵灵敏度、、特异性性和符合合率，如如HBsAg、、抗HCV和抗抗HIV等血清清盘。ELISA试剂剂盒的质质检ELISA试剂剂盒的质质检-HBsAgELISA试剂剂盒的质质检-抗HCVELISA试剂剂盒的质质检-TPELISA试剂剂盒的的质检检3.采采用弱弱阳性性定值值质控控血清清进行行质检检对不同同厂家家或同同一厂厂家不不同批批号试试剂盒盒采用用同一一弱阳阳性定定值质质控血血清检检测，，可比比较出出不同同厂家家或不不同批批号试试剂盒盒的检检测灵灵敏度度(测测定下下限)的差差异，，对判判断试试剂盒盒的质质量及及其稳稳定性性具有有重要要的参参考价价值。。检验结结果的的正确确与否否，是是试剂剂盒质质量、、人员员素质质、仪仪器设设备状状态和和室内内质控控措施施等的的综合合反应应，任任何一一个环环节出出现问问题，，都会会导致致检测测的失失败。。目前试试剂盒盒存在在的问问题--抗HCV目前试试剂盒盒存在在的问问题--抗HCV试剂的的不足足之处处1.主要是是在低危人人群中仍发发现大量的的不确定和和假阳性结结果，再则则仍有较长长的“窗口口期”。2.核心区抗原原的减少程程度把握不不好的话，，有可能会会导致漏检检的发生。。3.由于这些试试剂所使用用HCV抗抗原只是病病毒的部份份重组多蛋蛋白或合成成肽抗原，，加之，固固相对这些些蛋白或多多肽的吸附附能力的局局限性，使使得固相上上能捕获抗抗体的抗原原决定基的的数量有限限，从而影影响测定的的敏感性。。目前试剂盒盒存在的问问题

--抗HCV两家试剂检检测结果不不一致1.不同试试剂厂家的的ELISA试剂盒所用用包被抗原原的差异：：目前抗HCV检测ELISA试剂盒均均采用HCV的基因因工程或合合成多肽抗抗原（核心心区、NS3、NS4和NS5等）包包被固相，，以间接法法进行测定定，由于上上述HCV抗原的组组合、来源源及用量等等方面的差差异。2.所用包包被抗原成成份相互之之间抗原决决定簇的覆覆盖，这种种覆盖将严严重影响ELISA测定的敏敏感性。目前试剂盒盒存在的问问题

--抗HCV对策----通常的的做法是：：初检阴性性的血袋再再用与不同同厂家的国国产试剂复复检，如仍仍为阴性，，血即为合合格。或初初检使用国国产ELISA试剂剂，复检采采用进口试试剂。对策----应采取取的办法：：在血站筛筛检献血员员血时，初初检阴性尤尤其是S/CO值较较高的血液液，最好使使用不同ELISA试剂盒复复检，这样样才能最大大程度的减减少经输血血HCV感感染的发生生。目前试剂盒盒存在的问问题

--抗HCV抗HCVELISA出现假假阳性的主主要原因有有：1.类风湿湿因子（RF）的干干扰2.高免疫疫球蛋白血血症3.标本中中超氧化物物歧化酶（（SOD））的干扰4.用于固固相包被的的HCV基基因工程抗抗原不纯目前试剂盒盒存在的问问题

--抗HIV采用双抗原原夹心一步步法检测抗抗HIV----“钩状效效应”所致致的假阴性性问题。1.原因：：HIV感感染者中有有些抗体滴滴度很高，，采用可出出现双抗原原夹心一步步法检测，，可出现类类似双抗体体夹心一步步法检测抗抗原的“钩钩状效应””现象。2.措施：：在血站筛筛检献血员员时，应使使用二步法法试剂盒进进行检测，，或是对标标本进行双双份同时检检测，一份份原标本，，一份1:10或1:100稀释标本本，从而避避免漏检。。目前试剂盒盒存在的问问题

--抗HIVELISA测定结果果的解释1.一般来来说，一个个感染HIV的患者者，使用商商品ELISA试剂剂盒测定，，结果应为为阳性，因因为在这些些试剂盒中中所用的包包被抗原主主要为gag编码蛋蛋白和病毒毒包膜蛋白白，针对这这些蛋白的的抗体在HIV感染染的机体免免疫应答中中出现最早早，而ELISA的的测定敏感感性足以将将其早期测测出，因此此如果怀疑疑有可能的的HIV感感染，但ELISA测定结果果为阴性，，则HIV感染的可可能性很小小。2.实验操操作或试剂剂有问题或或不能确定定可能出现现感染的确确切日期，，如果HIV抗体ELISA测定为阴阴性，就不不必立即重重复检测。。3.对于处处于阳性判判断值（Cut-off）边边缘即稍低低于Cut-off的样本，，难于判断断是否为感感染早期，，或实际为为非感染者者的样本，，此时,可可以再次取取血测定和和/或用另另一种ELISA试试剂盒检测测，从而明明确测定结结果。这种种情况下，，如果测定定结果仍处处于Cut-off边缘，则则建议数月月后再次测测定,如仍仍无改变,则说明无无HIV感感染.其它它如免疫印印迹,PCR测定HIVRNA也为为此种情况况下的HIV感染验验证实验.目前试剂盒盒存在的问问题

--梅毒螺旋体体抗体检测方法1.检测非非特异性抗抗体----使用类脂质质抗原的血血清学试验验：RPR、TRUST2.检测特特异性抗体体----使用密螺旋旋体抗原的的血清学试试验：FTA-ABS、TPHA、TPPA、、ELISA、、WB目前试剂盒盒存在的问问题

--HBsAg检测灵敏度度据文献报道道，到目前前为止在献献血员中所所发现的HBsAg携带者者最低含量量为0.2n