CVC与真菌生物被膜-课件

CVC相关性念珠菌感染与治疗策略山东大学齐鲁医院重症医学科丁士芳内容念珠菌生物被膜形成生物被膜念珠菌耐药机制念珠菌生物被膜危害棘白菌素药物治疗CVC相关念珠菌感染优势生物被膜相关念珠菌感染ThePathogenesisofCandidaInfectionsinaHumanSkinModel:ScanningElectronMicroscopeObservations.ISRNDermatol.2011;2011:150642Candidaalbicans-EndothelialCellInteractions:aKeyStepinthePathogenesisofSystemicCandidiasis.INFECTIONANDIMMUNITY,2008,76(10):4370–4377BiofilmformationbythefungalpathogenCandidaalbicans:development,architecture,anddrugresistance[J].JBacteriol,2001,183(18):5385Candidaalbicansmorphogenesisandhostdefence:discriminatinginvasionfromcolonization.NatRevMicrobiol.;10(2):112–122.Hyphalgrowthinhumanfungalpathogensanditsroleinvirulence.IntJMicrobiol.2012;2012:517529.血和主动脉瓣培养为近平滑念珠菌，静脉联合滴注两性霉素B和科塞斯，2周后症状消失、血培养无真菌生长Candidaparapsilosisbioprostheticvalveendocarditisinducingaorticvalvestenosis.。TexHeartInstJ.2013;40(4):502-4伪膜性口咽部念珠菌感染OralCandidaalbicansisolatesfromHIV-positiveindividualshavesimilarinvitrobiofilm-formingabilityandpathogenicityasinvasiveCandidaisolates.BMCMicrobiol.2011Nov4;11:247.NIHinPA-03-047报道80%微生物感染与生物被膜形成相关多数研究以浮游念珠菌为主，念珠菌危害主要与其形成生物被膜有关念珠菌生物被膜相关感染随时间延长，形成类似生物被膜白色念珠菌皮肤感染模型生根发芽，咬定青山不放松ThePathogenesisofCandidaInfectionsinaHumanSkinModel:ScanningElectronMicroscopeObservations.ISRNDermatol.2011;2011:150642Candidaalbicans-EndothelialCellInteractions:aKeyStepinthePathogenesisofSystemicCandidiasis.INFECTIONANDIMMUNITY,2008,76(10):4370–4377热带念珠菌白色念珠菌beta-glucan与念珠菌生物被膜beta-1,3和beta-1,6glucans(50to60%),mannoproteins(30to40%),andchitin(0.6to9%).PutativeRoleof-1,3GlucansinCandidaalbicansBiofilmResistance.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,2007,51(2):510–520NatRevMicrobiol.;10(2):112–122念珠菌生物被膜相关感染BiofilmFormationbytheFungalPathogenCandidaalbicans:Development,Architecture,andDrugResistance。OURNALOFBACTERIOLOGY,Sept.2001,p.5385–5394 Vol.183,No.18产生物被膜的念珠菌菌株附着的有机玻璃或硅胶片，在0.05%(v/v)

Calcofluor-White浸染1min，该染料特异性与真菌细胞壁中的几丁质和葡聚糖特异性结合荧光显微镜下观察早期(0to11h),微小菌落中期(12to30h),类似细胞壁构成无定形物质覆盖菌落成熟期(38to72h),菌落被覆盖生物材料影响念珠菌生物被膜构成BiofilmFormationbytheFungalPathogenCandidaalbicans:Development,Architecture,andDrugResistance。OURNALOFBACTERIOLOGY,Sept.2001,p.5385–5394 Vol.183,No.18代谢活跃细胞，胞浆内FUN-1呈橘红色，ConA主要与真菌细胞壁多糖中的甘露糖结合，成绿色a单个白色念珠菌粘附b8h后，白念趋向粘附聚集c11h后，形成微菌落d成熟期，微菌落被类似细胞壁物质覆盖硅胶片形成厚约10~12um白色念珠菌菌株层，其上形成厚约450um、富含念珠菌菌丝和细胞外基质的基质层强行剥离基质层，可见念珠菌菌落念珠菌形成生物被膜存在差异瑞典临床微生物实验室2005年9月-2006年8月收集393株念珠菌，40%白色念珠菌形成生物被膜，88.7%非白念形成生物膜(p＜0.05)非白念容易形成复杂、厚密生物被膜Prevalenceofbiofilmformationinclinicalisolatesofcandidaspeciescausingbloodstreaminfection.Mycoses.2013May;56(3):264-72.beta-glucan在产生物被膜念珠菌的作用形成生物被膜念珠菌细胞壁β-1,3glucan含量显著高于静止期和对数生长期念珠菌(P<0.001)PutativeRoleof-1,3GlucansinCandidaalbicansBiofilmResistance.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,2007,51(2):510–520生物被膜念珠菌细胞膜固醇成分改变生物被膜与浮游白念珠菌麦角固醇水平在6h时相同，生物膜成熟期减少50%，而浮游细胞在6～12h减少18%，其他固醇水平在两者之间也有明显差异麦角固醇比例改变影响抗真菌药物进入念珠菌通透性，进而防止或阻滞抗真菌药物进入念珠菌细胞壁改变固醇成分比例影响生物被膜内念珠菌对氟康唑耐药性MechanismofFluconazoleResistanceinCandidaalbicansBiofilms:Phase-SpecificRoleofEffluxPumpsandMembraneSterols.InfectImmun.2003August;71(8):4333–4340.念珠菌耐抗真菌药物机制(1)细胞外基质阻止药物渗透入深部组织；(2)营养和生长速度限制，敏感性下降；(3)药物与生物被膜接触，诱导表达耐药基因与浮游念珠菌比较，生物被膜念珠菌对氟康唑耐药性高达1000倍Astickysituation:

untangling

the

transcriptional

network

controlling

biofilm

development

in

Candida

albicans.

Transcription.

2012;3(6):315-22.TRENDSinMicrobiologyVol.11No.1January2003金刚罩！铁布衫！反导系统！钢筋混凝土构成的社区群体,阻挡药物穿透ThedensityofthematurebiofilmmayactasaphysicalbarrierECMisproducedto“soak”anddepleteantifungalagents.念珠菌生物被膜影响氟康唑分布

念珠菌耐抗真菌药物机制B绝大部分氟康唑分布在非白色念珠菌生物被膜、非白色念珠菌细胞壁或细胞浆内极少或无氟康唑分布生物被膜念珠菌细胞壁结合氟康唑是浮游念珠菌的4~5倍，意味相当一部分氟康唑分布在生物被膜和细胞壁，不能进入细胞浆，增加念珠菌耐药性Roleofmatrixglucaninantifungalresistanceofnon-albicanscandidabiofilms.AntimicrobAgentsChemother.2013Apr;57(4):1918-20抗真菌药物对生物被膜念珠菌疗效两性霉素B对生物被膜念珠菌MIC增加脂质体两性霉素B对生物被膜念珠菌MIC无显著变化氟康唑和伏立康唑对浮游念珠菌MIC低，对生物被膜念珠菌MIC极高米卡芬净和卡泊芬净对浮游和生物被膜念珠菌MIC无显著差异MICsinCandidabiofilmsincrease100–1000timescomparedwithplanktoniccells.AntifungalSusceptibilityofCandidaBiofilms:UniqueEfficacyofAmphotericinBLipidFormulationsandEchinocandins.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,June2002,p.1773–1780Vol.46,No.6真菌耐药机制细胞膜通透性改变，Erg11基因突变和过表达，作用唑类药物的Cdr1,Cdr2(ABCT)过表达，特异性作用氟康唑的Mdr1(MF)过表达多烯类耐药少见，可通过ERG3功能缺失，导致麦角固醇合成障碍，不能形成药物-脂质复合体，避免内容物丢失Clinical,Cellular,andMolecularFactorsThatContributetoAntifungalDrugResistance.CLINICALMICROBIOLOGYREVIEWS,.1998,11(2):382–402FungalBiofilmResistance.InternationalJournalofMicrobiology.2012,528521,抗生物被膜活性药物改善患者预后Riskfactorsandoutcomesofcandidemiacausedbybiofilm-formingisolatesinatertiarycarehospital.PLoSOne.2012;7(3):e33705.

生物被膜组无生物被膜组Pvalue住院死亡率51.2%(43/84)31.7%(39/123)0.004感染相关死亡率44.1%(37/84)27.6%(34/123)0.012005年-2007年，84例为形成生物被膜念珠菌血症，123例为不能形成生物被膜念珠菌血症两者患者30天生存率不同(p=0.004)生物被膜念珠菌血症患者分别接受卡泊芬净和氟康唑治疗，其30天生存率不同(p=0.05)重症患者侵袭性念珠菌感染

危险因素：解剖生理屏障完整性破坏Revisitingthesourceofcandidemia:skinorgut?ClinInfectDis2001;33:1959–67.侵袭性念珠菌感染常由肠道念珠菌大量繁殖进入血流所致最易受累：肾、心、脑、肺重症患者侵袭性念珠菌感染

危险因素：解剖生理屏障完整性破坏据美国CDC统计,ICU医院获得性感染约20%为血流感染(BSI)，87%与中心静脉导管(CVC)有关血管内导管分离的病原体，白色念珠菌占第二位ICU患者最突出特点是其解剖生理屏障完整性破坏,定植体表皮肤和体腔粘膜表面的条件致病真菌，以及环境中真菌侵入原本无菌深部组织和血液NucciM,AnaissieE.Revisitingthesourceofcandidemia:skinorgut?ClinInfectDis2001;33:1959–67.股静脉置管血管内侵袭性操作相关真菌血症导管感染方式：(1)皮肤表面细菌、真菌在穿刺时或之后，通过皮下致导管皮内段至导管尖端定植，随后引起局部或全身感染(2)另一感染灶微生物血行播散到导管、黏附定植，引起CRBSI(3)微生物污染导管接头和内腔(手污染)，导致腔内细菌繁殖、感染世界临床药物,2011年,第07期中国真菌学杂志，2006年，第1卷，第五期VallésJ,etal.InfectDisClinNorthAm,2009,23:557-569中心静脉导管相关真菌血症与生物膜24h大鼠颈内静脉置管白色念珠菌生物被膜模型生物被膜内存活念珠菌、菌丝DevelopmentandcharacterizationofaninvivocentralvenouscatheterCandidaalbicansbiofilmmodel.InfectImmun.2004Oct;72(10):6023-31.扫描电镜显示中心静脉导管腔内形成念珠菌生物被膜相关感染念珠菌孢子形成假菌丝、菌丝和细胞外基质(A)×50;(B)×1000唑类药物作用机制ckCYP51活性部位(白色)；氟康唑结合位点(蓝色)；伏立康唑结合位点(黄色).伏立康唑结合位点比氟康唑多RegulatoryCircuitryGoverningFungalDevelopment,DrugResistance,andDisease.MICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGYREVIEWS,June2011,p.213–267Vol.75,No.2Stress,

drugs,and

evolution:the

role

of

cellular

signaling

in

fungal

drugresistance.EukaryotCell.2008;7(5):747-64.Dodds-AshleyES,etal.ClinInfectDis.2006;43:S28-39.NettJetal.Antimicrob.AgentsChemother.2007;51:510-520破坏生物被膜有助改善氟康唑疗效超大剂量氟康唑(为浮游念珠菌MIC1000倍)对生物被膜念珠菌感染无效大剂量β-1,3glucanase能破坏念珠菌生物被膜小剂量β-1,3glucanase不能破坏念珠菌生物被膜小剂量β-1,3glucanase联合超大剂量氟康唑，清除念珠菌生物被膜伏立康唑与氟康唑交叉耐药性采用最新K-B法判断标准耐氟康唑念珠菌，对伏立康唑保持高的耐药率伏立康唑BIResultsfromtheARTEMISDISKGlobalAntifungalSurveillanceStudy,1997to2007:a10.5-yearanalysisofsusceptibilitiesofCandidaSpeciestofluconazoleandvoriconazoleasdeterminedbyCLSIstandardizeddiskdiffusion.JClinMicrobiol.2010;48(4):1366-77.两性霉素B作用机制AntifungalResistanceandNewStrategiestoControlFungalInfections.InternationalJournalofMicrobiologyVolume2012,ArticleID713687,26pagesPharmacokineticsandPharmacodynamicsofAmphotericinBDeoxycholate,LiposomalAmphotericinB,andAmphotericinBLipidComplexinanInVitroModelofInvasivePulmonaryAspergillosis.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY.2010,54(8):3432–3441ProcNatlAcadSciUSA.2011;108(17):6733–6738.70–100nmindiameter千里之堤溃于蚁穴两性霉素B主要在肝、脾、肺、骨髓和肾脏分布两性霉素B脂质体剂型分布在肝、脾、肺、骨髓，较少分布在肾脏两性霉素B与氟康唑

不能抑制生物被膜念珠菌生长C.kruseiATCC6258C.parapsilosisATCC22019C.albicansHK1Sa(A)Control(B)exposedto600ug/mlamphotericinBfor4h(C)exposedto600ug/mlfluconazolefor4hThewrinkled,shrunk,ruptured,andballooningeffectofthedrugonyeastcellsInVitroMethodToStudyAntifungalPerfusioninCandidaBiofilms.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,2005,43(2):818–825两性霉素B脂质体抑制生物被膜念珠菌生长RabbitModelofCandidaalbicansBiofilmInfection:LiposomalAmphotericinBAntifungalLockTherapy.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,2004,48(5):1727–17327d兔颈静脉生物膜模型3d兔颈静脉生物膜模型对照两性霉素B脂质体1mg/100ul氟康唑1mg/100ul念珠菌感染兔CVC3天后，每天导管内局部灌注8h，连续7天氟康唑生物被膜有所减少，但念珠菌感染部位生物被膜形态与对照组相似(念珠菌生长)脂质体两性霉素B几乎完全清除CVC表面生物被膜相关念珠菌，1~2处残存感染部位缺乏生物被膜(无念珠菌生长)脂质体两性霉素B有效治疗生物被膜念珠菌感染，但机制不明，脂质体无真菌抑制作用棘白菌素类药物作用机制Stress,

drugs,and

evolution:the

role

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cellular

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in

fungal

drugresistance.EukaryotCell.2008;7(5):747-64.Resistancetoechinocandin-classantifungaldrugs.DrugResistUpdat.2007June;10(3):121–130.Stress,

drugs,and

evolution:the

role

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cellular

signaling

in

fungal

drugresistance.EukaryotCell.2008;7(5):747-64.Resistancetoechinocandin-classantifungaldrugs.DrugResistUpdat.2007June;10(3):121–130.Fungalechinocandinresistance.FungalGenetBiol.

2010;47(2):117-26.ChoiHWetal.AntimicrobAgentsChemother2007;51:1520-23棘白菌素类抗真菌药物作用靶点为真菌细胞壁β-1.3-葡聚糖，生物被膜基质中含有β-1.3-葡聚糖通过减少、抑制β-葡聚糖产生，破坏生物被膜完整性，有利控制念珠菌生物被膜感染卡泊芬净抑制生物被膜念珠菌存活InVitroActivityofCaspofunginagainstCandidaalbicansBiofilms.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY.2002,46(11):3591–3596卡泊芬净治疗组(0.5ug/ml)生物被膜内念珠菌菌丝少、孢子形态异常未治疗组，存在大量活性代谢念珠菌(从绿色到红色，以红色为主)；卡泊芬净治疗组(0.5ug/ml)，为弥漫性绿色，提示存在大量死亡念珠菌UppuluriPetal.Antimicrob.AgentsChemother.2011;55:3591-3593抗真菌药物抑制生物被膜相关念珠菌播散超大剂量氟康唑不能抑制生物被膜内白色念珠菌生长高浓度两性霉素B仅仅中等程度抑制生物被膜内白色念珠菌生长卡泊芬净抑制生物被膜内白色念珠菌生长作用最强抗真菌药物对生物被膜念珠菌疗效绿色念珠菌细胞壁，红色代表有活性念珠菌。黄色提示念珠菌无活性，A-D依次为对照组、卡泊芬净、脂质体两性霉素B、伏立康唑卡泊芬净治疗组念珠菌细胞壁严重破坏，且无活性；两性霉素B脂质体治疗组念珠菌胞浆内弥漫性黄染，提示念珠菌无活性；伏立康唑组念珠菌亦无活性，但形态破坏较卡泊芬净组轻AntifungalSusceptibilityofCandidaBiofilms:UniqueEfficacyofAmphotericinBLipidFormulationsandEchinocandins.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,June2002,46(6):1773–1780浮游白色念珠菌暴露抗真菌药物24h后形态变化抗真菌药物对生物被膜念珠菌疗效A-D依次为对照组、卡泊芬净、脂质体两性霉素B、伏立康唑卡泊芬净治疗组念珠菌细胞壁严重破坏，且无活性两性霉素B脂质体治疗组念珠菌胞浆内弥漫性黄染，提示念珠菌无活性，且念珠菌皱缩尽管伏立康唑组有少量无活性念珠菌，且细胞壁轻度受损，但伏立康唑组念珠菌受影响最小AntifungalSusceptibilityofCandidaBiofilms:UniqueEfficacyofAmphotericinBLipidFormulationsandEchinocandins.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,June2002,46(6):1773–1780生物被膜相关白色念珠菌生长48h暴露抗真菌药物48h后形态变化抗真菌药物对生物被膜念珠菌疗效评价伏立康唑、泊沙康唑、卡泊芬净、阿尼芬净治疗白色念珠菌、近平滑念珠菌生物被膜感染疗效伏立康唑和泊沙康唑MIC分别为>256and>64mg/liter卡泊芬净和阿尼芬MIC分别为<1and<2mg/literDifferentialActivitiesofNewerAntifungalAgentsagainstCandidaalbicansandCandidaparapsilosisBiofilms.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY.2008,51(1)：357–360白色念珠菌近平滑念珠菌棘白菌素类药物治疗重症患者念珠菌感染优势5,(6)-carboxyfluoresceindiacetate(CFDA),羧基荧光素二醋酸酯5(6)-CFDA是膜透性染料，可通过孵化进入细胞。一旦进入细胞后，CFDA被细胞内酯酶水解形成羧基荧光素bis-(1,3-dibutylbarbituricacid)trimethineoxonol(DiBAC),DiBAC4(3)是一种检测细胞膜电位的亲脂性阴离子荧光染料，它本身无荧光，当进人细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光。DiBAC4(3)进入细胞，细胞内荧光强度增加，即膜电位增加表示细胞去极化;反之，细胞内荧光强度降低即膜电位降低表示细胞超极化耐氟康唑念珠菌对棘白菌素敏感性高卡泊芬净对耐氟康唑念珠菌，仍保持杀菌活性与唑类无交叉耐药AntifungalSpeciesSusceptibleS-DDIntermediateResistantCaspofunginC.albicans≤0.25-0.5≥1C.glabrata≤0.12-0.25≥0.5C.krusei≤0.25-0.5≥1C.parapsilosis≤24-≥8C.tropicalis≤0.25-0.5≥1Activitiesofmicafunginagainst315invasiveclinicalisolatesoffluconazole-resistantCandidaspp.JClinMicrobiol.2006Feb;44(2):324-6.

1.ExpertOpin.Pharmacother.FungicidalversusFungistatic:what'sinaword?2008,9(6):927-935.2.EurJClinMicrobiolInfectDis.2004;23:805–812.TheAntifungalEchinocandinCaspofunginAcetateKillsGrowingCellsofAspergillusfumigatusInVitro.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,Sept.2002,p.3001–3012Vol.46,No.9Currentpharmacologicalconceptsforwiseuseofechinocandinsinthetreatmentofcandidainfectionsinsepticcriticallyillpatients.ExpertRev.Antiinfectther.2013,11(3):989-9971.ExpertOpin.Pharmacother.FungicidalversusFungistatic:what'sinaword?2008,9(6):927-935.2.EurJClinMicrobiolInfectDis.2004;23:805–812.棘白菌素类药物治疗重症患者念珠菌感染优势

杀菌剂vs抑菌剂治疗侵袭性念珠菌感染，初始治疗选用杀菌作用的抗真菌药物与氟康唑比较，棘白菌素类药物治疗优势RapidfungicidalactivityAnti-biofilmactivityUnchangedactivityagainstCandidaspp.ShowingdecreasedsusceptibilitytofluconazoleandtootherazolesAnti-cytokineandanti-chemokineactivity2009指南推荐中心静脉导管相关血流感染处理原则对于经验性治疗疑似导管相关念珠菌血症，选用棘白菌素类药物，或者，在部分患者，选用氟康唑(A-II)Forempiricaltreatmentofsuspectedcatheter-relatedcandidemia,useanechinocandinor,inselectedpatients,fluconazole.A-II氟康唑用于近3个月内唑类无药物暴露史，且克柔念珠菌或光滑念珠菌感染风险非常低(A-III)Fluconazolecanbeusedforpatientswithoutazoleexposureintheprevious3monthsandinhealthcaresettingswheretheriskofCandidakruseiorCandidaglabratainfectionisverylow.A-IIIClinicalPracticeGuidelinesfortheDiagnosisandManagementofIntravascularCatheter-RelatedInfection:2009UpdatebytheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica.ClinicalInfectiousDiseases2009;49:1–45AntifungalLockTherapy.AntimicrobAgentsChemother.2013Jan;57(1):1-8.2009IDSA抗念珠菌治疗指南

未提及念珠菌生物被膜危害近期有唑类药物暴露史且伴有严重感染、感染性休克，选择棘白菌素类药物怀疑中心静脉导管导致发热，如果可能，及早拔出静脉导管一旦为念珠菌导管相关感染，立即抗真菌治疗，疗程至临床症状消失和血培养最后一次阳性后两周(D级)44ClinicalPracticeGuidelinesfortheManagementofCandidiasis:2009UpdatebytheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica.ClinicalInfectiousDiseases2009;48:503–35抗念珠菌治疗(2011ATSGuideline)

未提及念珠菌生物被膜危害怀疑中心静脉导管导致发热，应立即拔除导管(A级)治疗持续到末次血培养阳性两周后(D级)若当地非白念珠菌发生率>10%或当地白念珠菌对氟康唑耐药率高，强烈建议采用以两性霉素B或棘白菌素类药物为基础的治疗AnOfficialAmericanThoracicSocietyStatement:TreatmentofFungalInfectionsinAdultPulmonaryandCriticalCarePatients.AmJRespirCritCareMed.2011,183:96–1282012ESCMID非粒缺成人患者

侵袭性念珠菌感染指南血培养酵母菌阳性(AII)或经验治疗(CIIu)开始抗真菌治疗Stronglyrecommended:棘白菌素(A-I)Moderatelyrecommended:L-AMBor伏立康唑(B-I)Marginallyrecommended:氟康唑orABLC(C-I)recommendationagainstuse(D):AMB伊曲康唑泊沙康唑联合治疗ClinMicrobiolInfect2012;18(Suppl.7):1–8ClinMicrobiolInfect2012;18(Suppl.7):9–18ClinMicrobiolInfect2012;18(Suppl.7):19–37u-uncontrolledtrials2009IDSA2012ESCMID氟康唑A-Ilesscriticallyillandwhohavenorecent

azoleexposure

A-IIIC-I棘白菌素类药物A-Imoderatelyseveretosevereillness&recentazoleexposureA-IIIA-I伏立康唑A-I(alternativeagent)B-I两性霉素B脂质体A-I(alternativeagents)B-I两性霉素B传统剂型A-I(alternativeagent)D-I一枝独秀，一