FISH法检测石蜡miRNA总结课件

荧光原位杂交技术（fluorescenceinsituHybridization,FISH）定义：荧光原位杂交技术（fluorescenceinsituHybridization,FISH）是一种非放射性原位杂交方法，用特殊的荧光素标记DNA探针，在染色体、细胞或组织切片标本上进行DNA杂交，以检测细胞内DNA或RNA特定序列存在与否。FISH的基本原理用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而探针可以直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。探针的荧光素标记方法：间接标记法：是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。直接标记法：是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。应用范围：FISH检测对被测样本没有特殊的要求。骨髓的细胞羊水的细胞冰冻切片的样本，石蜡包埋的样本尿液样本（获取的样本细胞也无需经过培养扩增，FISH检测可以显示单个细胞核内）实验步骤试剂准备脱蜡蛋白酶处理变性杂交细胞核染色脱蜡（1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；（2）100％酒精两次，每次2min；（3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。变性（1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；（2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；（3）78℃孵育8min；（4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；（5）空气干燥。杂交杂交后水洗：（5）镊子小心去除盖玻片；（6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；（7）2×SSC（37℃）洗两次，每次10min；（8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。杂交（9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。（10）每张切片使用30~60μl罗丹明抗-地高辛抗体（抗地高辛单克隆抗体）或FITC卵白素，室温下孵育20min；（11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。杂交（12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；（13）每张切片滴30~60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；（14）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；（15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；（16）每张切片滴30~60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；（17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。细胞核染色（1）每张切片加10~20μlDAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2~5min；（2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。荧光显微镜观察FISH结果先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。单一染色多重染色优点：操作简便，一步式反应，能迅速得到结果，一次标记后可使用二年。方法敏感，敏感程度等同甚至超过放射性同位素原位杂交。在同一标本上，可同时应用几种不同探针，标记不同的颜色。可用于分裂细胞和静止期细胞的染色体数量及基因改变的研究。技术延伸：荧光原位杂交技术可以传统技术完美结合：1、FISH和细胞免疫化学技术结合，可以同时用多种不同颜色标记不同的核苷酸链和蛋白质，这样可以在单个细胞内同时找到基因的位点，转录和翻译的产物，有助了解核苷酸结构功能以及与蛋白质表达之间的关系。2、FISH技术和RFLE（RESTRICTFRAGMENTLENTHPOLYMORPHSIM）结合