分子生物学讲座

4、调控基因

调控基因(regulatorygene)是编码能与操纵子序列结合的调控蛋白的基因。调控方式有负调控(negativeregulation)和正调控(positiveregulation)。某些特定的物质能与调控蛋白结合，使调控蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响，这些特定物质中凡能引起诱导发生的分子称为诱导剂(inducer)，能导致阻遏发生的分子称为阻遏剂或辅助阻遏剂(corepressor)。在乳糖操纵元中，调控基因1acI位于P邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R，在环境没有乳糖存在的情况下，R形成分子量为152000的活性四聚体，能特异地与操纵子o紧密结合，从而阻止结构基因的转录；当环境中有足够的乳糖时，乳糖受β-半乳糖苷酶作用转变为别乳糖，别乳糖与R结合，使R的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。在这过程中乳糖(实际起作用的是别乳糖)就是诱导剂。5、终止子

终止子(terminator，T)是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵元中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。

说明：在没有乳糖存在的情况下，乳糖操纵元并非完全停止，还存在着本底组成型合成（backgroundconstitutivesynthesis）。因为阻遏蛋白和操纵子的结合并不是完全牢固的。也就是说，即使没有乳糖存在，也会有少数几个结构基因群得以合成，一旦有乳糖或者类似物存在，马上可以利用。和阻遏蛋白结合的是别乳糖，而不是乳糖。乳糖+H2O别乳糖葡萄糖+半乳糖β-半乳糖苷酶在研究诱导作用时，并不真正用乳糖进行，因为它会被催化降解。实际上用的是一些化学合成的乳糖类似物，例如异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG)。它不受β-半乳糖苷酶的催化分解，不被细胞代谢而十分稳定，但能与R特异性结合，使R构象变化，诱导1ac操纵元的开放。是很强的诱导剂。还有巯甲基半乳糖苷（TMG）。事例X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被β-半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作β-半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal被广泛应用在基因工程的工作中。

这些替代物都不是真正的酶的底物，所以称为安慰性诱导物（gratuitousinducer）。四、真核生物的基因调控1、真核生物基因组的特点真核基因组比原核基因组大得多真核生物主要的遗传物质在核膜内，核外还有遗传成分，增加了调控的层次和复杂性原核基本是单倍体，而真核是二倍体原核编码序列绝大多数是连续的，而真核绝大多数是不连续的原核基因组中重复序列不多，真核中则存在大量重复序列真核基因因表达调调控的环环节更多多真核基因因转录与与染色质质的结构构变化相相关真核基因因表达以以正性调调控为主主2、真核核生物基基因调控控的特点点第五章DNA重重组与基基因工程程前言基因工程程属于生生物技术术范畴，，生物技技术（biotechnology）不是是一个独独立的学学科而是是一套技技术或手手段。广广义的生生物技术术指任何何利用活活的生物物体或其其一部分分生产产产品或改改良生物物品质的的技术；；狭义的的生物技技术是专专指以DNA重重组技术术和单克克隆技术术为标志志发展起起来的新新技术。。一般认为为生物技技术包括括基因工工程、细细胞工程程、酶工工程和发发酵工程程几方面面的内容容。基因因工程是是生物技技术的核核心和关关键，是是主导技技术；细细胞技术术是生物物技术的的基础；；酶工程程是生物物技术的的条件；；发酵工工程是生生物技术术获得最最终产品品的手段段，四个个方面相相互联系系的。生生物技术术是一个个综合技技术体系系，其中中基因工工程和细细胞融合合技术最最为突出出。蛋白质工工程则是是在基因因工程基基础上综综合蛋白白质化学学、蛋白白质晶体体学、计计算机学学辅助设设计等知知识和技技术发展展起来的的研究新新领域，，开创了了按人类类意愿设设计和研研制人类类需要的的蛋白质质的新时时期，被被称为第第二代基基因工程程。一般来说说，基因因工程是是指在体体外将核核酸分子子插入质质粒、病病毒或其其它的载载体当中中，形成成遗传物物质的重重新组合合，使之之进入到到寄主细细胞内，，并且在在寄主细细胞当中中可以持持续稳定定地繁殖殖。基因因工程又又叫做基基因重组组，DNA重组组技术。。第一节工工具酶DNA重重组技术术中对核核酸的““精雕细细刻”主主要用酶酶作为工工具。分分子生物物学研究究过程中中发现的的酶，许许多都用用作工具具。限制制性核酸酸内切酶酶（restrictionendonuclease）在在重组DNA技技术中有有重要地地位，在在此做详详细介绍绍。一、工具具酶种类类1、限制制性内切切酶：分分I、II、III三三种2、连接接酶：DNA连连接酶、、RNA连接接酶3、聚合合酶：DNA聚聚合酶、、RNA聚合酶酶4、激酶酶、磷酸酸酶：碱碱性磷酸酸酶、T4多核核苷酸激激酶5、核酸酸酶：核核酸外切切酶、核核酸内切切酶（S1）、、脱氧核核糖核酸酸酶（DNaseI））、核糖糖核酸酶酶（RNaseA、、RNaseH、RNaseT1））6、其他他常用酶酶：甲基基化酶、、拓扑异异构酶I、SSB二、限制制性核酸酸内切酶酶的概念念很多细菌菌和细胞胞中都能能识别外外来的核核酸并将将其分解解，1962年年发现这这是因为为细菌中中含有特特异的核核酸内切切酶，能能识别特特定的核核酸序列列而将核核酸切断断;同时时又伴随随有特定定的核酸酸修饰酶酶。最常常见的是是甲基化化酶,能能使细胞胞自身核核酸特定定的序列列上碱基基甲基化化,从而而避免受受内切酶酶水解,外来核核酸没有有这种特特异的甲甲基化修修饰,就就会被细细胞的核核酸酶所所水解.这样细细胞就构构成了限限制--修饰体体系。其其功能就就是保护护自身的的DNA,分解解外来的的DNA,以保保护和维维持自身身遗传信信息的稳稳定,这这对细菌菌的生存存和繁衍衍具有重重要意义义。这就就是限制制性核酸酸内切酶酶名称中中“限制制”二字字概念的的由来。。二、限制制性核酸酸内切酶酶的命名名按酶的来来源的属属、种名名而定，，取属名名的第一一个字母母与种名名的头两两个字母母组成的的三个斜斜体字母母作略语语表示；；如有株株名，再再加上一一个字母母，其后后再按发发现的先先后写上上罗马数数字。例例如：从从流感嗜嗜血杆菌菌d株（（Haemophilusinfluenzaed）中先先后分离离到3种种限制酶酶，则分分别命名名为HindⅠⅠ、HindⅡⅡ和HindⅢⅢ。三、限制制性核酸酸内切酶酶的分类类按限制酶酶的组成成、与修修饰酶活活性关系系，切断断核酸的的情况不不同，分分为三类类：Ⅰ类限制制性核酸酸内切酶酶：由3种不同同亚基构构成，具具有修饰饰酶活性性和内切切酶活性性，它能能识别和和结合于于特定位位点，随随机切断断识别位位点以外外的DNA序列列，通常常在识别别位点周周围400-700bp（1000-5000bp）。。这类酶酶的作用用需要Mg2+，S腺腺苷甲硫硫氨酸及及ATP。III类类限制性性核酸内内切酶：：与Ⅰ类类酶相似似，既有有内切酶酶活性，，又有修修饰酶活活性，切切断位点点在识别别序列周周围25-30bp（（24-26bp）范范围内，，酶促反反应除Mg2+外，也也需要ATP供供给能量量。II类限限制性核核酸内切切酶：只只由一条条肽链构构成，仅仅需Mg2+，，切割DNA特特异性最最强，且且就在识识别位点点范围内内切断DNA。。是分子子生物学学中应用用最广的的限制性性内切酶酶。通常常在重组组DNA技术提提到的限限制性核核酸内切切酶主要要指Ⅱ类类酶而言言。四、限制制性核酸酸内切酶酶的作用用1、切割割方式大部分限限制性核核酸内切切酶识别别DNA序列具具有回文文结构特特征，切切断的双双链DNA都产产生5’’磷酸基基和3’’羟基末末端。不不同限制制性核酸酸内切酶酶识别和和切割的的特异性性不同。。HindIII5`…AAGCTT…3`3`…TTCGAA…5`EcoRI5`…GAATTC…3`3`…CTTAAG…5`切割产生生的末端端有三种种情况：：3`粘性性末端，，PstI，，5`-CTGCAG-3`5`粘性性末端，，EcoRI，5`-GAATTC-3`平末端，，SmaI，，5`-CCCGGG-3`2、识别别序列频频率1/4N，其中N=识别序序列的长长度3、同裂裂酶和同同尾酶来源不同同但可以以识别切切割相同同的DNA序列列，产生生相同的的末端，，这样的的酶称为为同裂酶酶。如：：MboI和和Sau3AI（5`-GATC-3`））来源不同同，识别别切割的的序列也也不同，，但产生生相同的的粘性末末端，称称为同尾尾酶。如如SalI（（5`-GTC