分子生物学法-食品伙伴网原食品伴侣网关注食品安全

第五讲分子生物学研究法一、重组DNA技术发展史上的重大事件二、基因操作的主要技术原理三、分子克隆技术四、DNA的Microarray一、重组DNA技术发展史上的重大事件

1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；2.50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；3.50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。1869

FMiescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1944O.T.Avery证实DNA是遗传物质。1952A.D.Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。1957

A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。1958

M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留复制模型。1959-1960S.Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破译了第一相遗传密码；F.Jacob和J.Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。1964

C.Yanofsky和S.Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965

S.W.Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒”DNA所决定。1966

M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973

H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977

F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。1978

首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster获得转基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到转基因果蝇。1982美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。1983

获得第一例转基因植物。1984

斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。1986

GMO首次在环境中释放。1988

J.D.Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小氧--“Oncomouse”。1992

欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)1994第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。基因工程中常见的名词:

遗传工程--geneticengineering，基因操作--gonemanipulation，基因克隆--gonecloning，

重组DNA技术--recombinantDNAtechnology，分子克隆--molecularcloning。基因工程的主要内容或步骤:

1.从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。

2.将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。

3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。

4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。

5.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。二、基因因操作的主主要技术原原理1．核酸的的凝胶电泳泳(Agarose&Polyacrylamide)将某种分子子放到特定定的电场中中，它就会会以一定的的速度向适适当的电极极移动。某某物质在电电场作用下下的迁移速速度叫作电电泳的速率率，它与电电场强度成成正比，与与该分子所所携带的净净电荷数成成正比，而而与分子的的磨擦系数数成反比（（分子大小小、极性、、介质的粘粘度系数等等）。在生理条件件下，核酸酸分子中的的磷酸基团团是离子化化的，所以以，DNA和RNA实际上呈多多聚阴离子子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中中，它就会会由负极→正极移动。。在凝胶电泳泳中，一般般加入溴化化乙锭（EB）--ethidiumbromide染色，此时时，核酸分分子在紫外外光下发出出荧光，肉肉眼能看到到约50ngDNA所形成的条条带。DNA的脉冲电泳泳技术:PFGE-Pulse-fieldgelelectrophoresis2．核酸的的分子杂交交技术在大多数核核酸杂交反反应中，经经过凝胶电电泳分离离的DNA或RNA分子，都是是在杂交之之前，通过过毛细管作作用或电导导作用按其其在凝胶中中的位置原原封不动地地"吸印"转移到滤膜膜上的。常常用的滤膜膜有尼龙滤滤膜、硝酸酸纤维素滤滤膜，叠氮氮苯氧甲基基纤维素滤滤纸（DBM）和二乙氨氨基乙基纤纤维素滤膜膜（DEAE）核酸分子杂杂交实验包包括如下两两个步骤：：将将核酸样样品转移到到固体支持持物滤膜上上，这个过过程特称为为核酸印迹迹(nucleicacidblotting)转移，主要要有电泳凝凝胶核酸印印迹法、斑斑点和狭线线印迹法(dotandslotblotting)、菌落和噬噬菌斑印迹迹法(colonyandplaqueblotting)；将将具有核核酸印迹的的滤膜同带带有放射性性标记或其其它标记的的DNA或RNA探针进行杂杂交。所以以有时也称称这类核酸酸杂交为印印迹杂交。。3．细菌的的转化所谓细菌转转化，是指指一种细菌菌菌株由于于捕获了来来自另一种种细菌菌株株的DNA，而导致性性状特征发发生遗传改改变的生命命过程。这这种提供转转化DNA的菌株叫做做供体菌株株，而接受受转化DNA的寄主菌株株则称做受受体菌株。。大肠杆菌菌是最广泛泛使用的实实验菌株。。在加入转转化DNA之前，必须须预先用CaCl2处理大肠杆杆菌细胞，，使之呈感感受态（CompetentCells）。Mg2+对维持外源源DNA的稳定性起起重要作用用，质粒DNA中的抗生素素是筛选标标记。对对绝大多数数hsdR-，hsdM-突变体菌株株（k12），每ugDNA可得107-108个转化子。。4．DNA序列分析a.Sanger的双脱氧链链终止法Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双双脱氧链终终止法测定定单链DNA的序列，其其基本原理理如下：①DNA聚合酶能够够用单链DNA作为模板，，合成准确确的DNA互补链；②该酶能够用用2'，3'--双脱氧核苷苷三磷酸作作底物并将将其聚合到到新生寡核核苷酸链的的3'-末端，从而而终止其延延伸反应。。在DNA测序反应中中，加入模模板DNA，引物（特特异性引物物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无无5'→3'外切酶活性性。b．Maxam-Gilbert化学修饰法法(哈佛大学)该方法的基基本原理是是用化学试试剂处理具具有末端放放射性标记记的DNA片段，造成成碱基的特特异性切割割并产生一一组具有不不同长度的的DNA链降解产物物，经凝胶胶电泳分离离和放射自自显影之后后，可直接接读出待测测DNA片段的核苷苷酸序列。。该反应的关关键在于使使DNA的4种核苷酸中中，只有1-2种发生特异异性的化学学切割反应应：

碱基基的特异性性修饰；被被修饰的的碱基从核核糖环上转转移；失失去碱基的的糖环部位位发生DNA链断裂。专专门用来来对核苷酸酸作化学修修饰，并打打断磷酸二二酯键的化化学试剂有有硫酸二甲甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。硫酸二甲酯酯是碱性化化学试剂，，能使DNA链中鸟嘌呤呤的N7和腺嘌呤的的N6位发生甲基基化，在中中性PH环境中就能能使糖苷键键发生水解解，并引起起DNA链的断裂。。在碱性条条件下，肼肼能特异性性切割C和T。如果加入入1mol/L的Nacl，那么，只只有C被特异性切切割。c．DNA序列分析自自动化用四甲基若若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂剂标记DNA引物，带有有这种引物物的DNA片段能在激激光诱导下下发出荧光光。按照标标准的双脱脱氧终止法法或化学终终止法进行行测序反应应，跑DNA凝胶后用计计算机检测测。d.DNA杂交测序法法(SBH-Sequencingbyhybridization)如果一段较较短的DNA探针能与较较长的DNA片段杂交，，并形成完完全的双链链结构，我我们就推测测在靶DNA上存在着相相应的互补补序列，这这就是DNA杂交测序法法的基本原原理。如果果将一种12-mer的靶DNA与完全随机机合成的8-mer寡核苷酸控控针混合杂杂交，在总总数为48=65536种8-mer的控针群体体中，仅有有5种探针会与与靶DNA杂交，形成成完全互补补的双链分分子。当靶DNA与标记探针针形成G-T或G-A末端碱基错错配的双链链体时，检检测有一定定难度。寡寡核苷酸探探针越短，，碱基错配配造成的去去稳定效应应越明显，，较易与完完全的双链链体分子相相区分。但但是，探针针短，杂交交产物的总总体稳定性性下降，信信/噪比下降，，影响结果果的可靠性性。所以，，6-mer寡核苷酸矩矩阵芯片只只能用于测测定500bp的靶DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。SBH的应用：①可有效检测测靶DNA中的单碱基基突变；②可用于不同同DNA片段之间的的序列比较较；③可用于检测测不同生长长发育状态态下细胞中中特定基因因的表达状状况；④可用于检验验传统测序序技术的准准确性。5．基因的的定点诱变变（site-directedmutagenesis）使已克隆基基因或DNA片段中的任任何一个特特定碱基发发生取代、、插入或缺缺失变化的的过程叫作作基因的定定点诱变，，是基因工工程和蛋白白质工程的的重要手段段。a.盒式诱变(cassettemutagenesis)，包括盒式式取代诱变变和混合寡寡核苷酸诱诱变两种方方式。b．寡寡核核苷苷酸酸引引物物诱诱变变应用用化化学学合合成成的的含含有有突突变变碱碱基基的的寡寡核核苷苷酸酸短短片片段段做做引引物物，，进进行行DNA复制制，，使使寡寡核核苷苷酸酸引引物物成成为为新新合合成成的的DNA子链链的的一一个个部部分分。。C．PCRG与PCR诱变变6．利用用DNA与蛋蛋白白质质的的相相互互作作用用进进行行核核酸酸研研究究.a.凝胶胶滞滞缓缓实实验验(Gelretardationassay)，又称称DNA迁移移率率变变化化试试验验(DNAmobilityshiftassay--EMSA)。b．DNaseI印迹迹试试验验（（DNaseIfootprinting）主要要步步骤骤：：①用32P标记记DNA双链链末末端端，，并并用用RE切去去一一端端；；②加入入细细胞胞特特定定周周期期蛋蛋白白质质提提取取物物，，温温育育；；③加入入适适量量DNaseI或硫硫酸酸二二甲甲酯酯-六氢氢吡吡啶啶，，使使DNA链发发生生断断裂裂。。这这一一反反应应中中，，DNaseI或硫硫酸酸二二甲甲酯酯的的用用量量非非常常关关键键，，要要保保证证一一条条链链只只发发生生一一次次断断裂裂！！④沉淀淀DNA（包包括括与与DNA相结结合合的的蛋蛋白白质质））；；⑤进行行DNA凝胶胶分分析析。。如果果某某个个蛋蛋白白质质已已经经与与DNA的特特定定区区段段相相结结合合，，那那么么，，它它就就会会保保证证该该区区段段DNA免受受消消化化或或降降解解作作用用。。在在电电泳泳凝凝胶胶的的放放射射自自显显影影图图片片上上，，相相应应于于蛋蛋白白质质结结合合的的部部位位不不产产生生放放射射性性标标记记的的条条带带。。c．甲甲基基化化干干扰扰试试验验(Methylationinterferenceassay)用DMS处理理靶靶DNA，使使平平均均每每条条链链上上只只有有一一个个G被甲甲基基化化。。将将局局部部甲甲基基化化的的DNA与含含DNA结合合蛋蛋白白的的细细胞胞提提取取物物共共温温育育后后进进行行凝凝胶胶滞滞缓缓试试验验。。分分离离各各种种DNA条带带，，并并用用六六氢氢吡吡啶啶切切割割甲甲基基化化的的残残基基。。如如果果因因某某个个G残基基的的甲甲基基化化作作用用而而阻阻止止了了蛋蛋白白质质与与DNA的结结合合，，那那么么，，六六氢氢吡吡啶啶对对这这个个甲甲基基化化G残基基的的切切割割作作用用，，就就只只能能在在没没有有蛋蛋白白质质结结合合的的DNA中观观察察到到。。d．体体内内足足迹迹试试验验用适适量量DMS处理理完完整整的的游游离离细细胞胞，，使使染染色色质质中中的的G残基基甲甲基基化化，，提提取取DNA并加加入入六六氢氢吡吡啶啶切切割割DNA链。。与与对对照照的的裸裸露露DNA经甲甲基基化化处处理理后后形形成成的的梯梯度度相相对对照照，，就就能能发发现现DNA链上上的的蛋蛋白白质质结结合合区区。。三、分子克隆隆技术1、高质量mRNA的制备应用PromegaPolyATtractmRNAIsolationSystem分离Poly(A)RNA。将BiotinylatedOligo(dT)引物与细胞总总RNA共温育，加入入与微磁球相相连的Streptavidin，用磁场吸附附与PMP相连的SA-BiotinylatedOligo(dT)-mRNA。2．反转录成成cDNA可同时在反转转录系统中加加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到到全长cDNA；

应选用活活性较高的反反转录酶（Reversetranscriptase）；

应选用用甲基化dCTP；

应保证所所获得双链cDNA的方向性。SuperScriptChoicecDNA合成系统中所所用的poly（dT）引物因为绝大多数数大肠杆菌细细胞都会切除除带有5‘-methylC的外源DNA，所以，应选用用mcrA-mcrB-菌株。3．分子克隆的的主要方法（1）构建cDNA、核DNA文库，应用现现有核酸探针针分离新的目目的基因；（（2）差式杂交(differentialscreen)和扣除杂交(subtractivehybridization)技术；

（3）DD-RT-PCR法及差别显示示技术；（（4）差别分析法法(RDA法，即Representationaldifferenceanalysis）；

（5）酵母双杂交交体系Two-hybridsystem；

（6）图位克隆法法（map-basedcloning）与染色体步步移（genomicDNAWalking）。习惯上，人们们用克隆表示示由同一物种种具有相同基基因型的两个个或多个个体体组成的群体体。所以，从从同一受精卵卵分裂而来的的单卵双生子子（monozygotictwins）便属于同一一克隆。细胞胞学上，克隆隆是指由同一一个祖细胞（（progenitorcell）分裂而来的的具有同一遗遗传背景的子子细胞群体。。分子生物学学上，把将外外源DNA插入具有自主主复制能力的的载体DNA中，使之得以以自主复制和和永久保存的的过程叫做分分子克隆。文库筛选与基基因丰度有关关。高丰度基基因，如蚕丝丝心蛋白，卵卵清蛋白等在在某些特定组组织中可占细细胞总mRNA量的50-90%，非常容易被被分离。低丰丰度基因，一一般在细胞中中只有10-20个拷贝，哺乳乳动物细胞中中可含10,000到40,000种不同的mRNA，如果要达到到99%的期望值，大大约需要筛选选150,000-170,000个克隆子。一一般情况下，，每微克cDNA可产生10万-60万个克隆子。。A.差式杂交或扣扣除杂交克隆隆技术B.cRNA差式显示法除了极少数特特例(如组蛋白基因因)之外，几乎所所有的真核基基因mRNA分子的3'-末端，都带有有一段多聚的的腺苷酸结构构，即通常所所说的poly(A)尾巴。P.Liang等人设计合成成了全部12种不同的引物物，用以反转转录mRNA，合成第一链链cDNA。这种引物通通常叫作3'-端锚定脱氧核核苷酸引物，，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其其中M为除了T以外的任何一一种核苷酸（（即A、G或C），而N则为任何一种种核苷酸（即即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列列组合方式。。DDRT-PCR的主要步骤：：Ⅰ.从不同发育阶阶段或不同基基因型的细胞胞群体中分离离mRNA，并以3'锚定引物作为为反转录的引引物，合成第第一键cDNA；Ⅱ.用5'随机引物和某某个3'端锚定引物对对扩增第一链链(掺入32p-dNTP)；Ⅲ.用DNA变性测序胶分分离扩增产物物，X光片曝光后检检测差别条带带；Ⅳ.回收特异性差差别条带；Ⅴ.用同一引物对对扩增已回收收的DNA条带；Ⅵ.用Northern，Southern及测序法分析析所得的条带带；Ⅶ.以该DNA片段做探针，，筛选全长cDNA或核基因。C.cDNA差式分析法(Representationalditterenceanalysis)RDA法充分发挥了了PCR以指数形式扩扩增双链DNA模板的特性，，通过降低cDNA群体复杂性和和更换cDNA两端接头等方方法，特异扩扩增了目的基基因片段。因因为试验对象象（Tester）和供试探针针（Driver）在接受差式式分析前均经经一个4碱基切割酶处处理，形成平平均长度256bp的代表群（representation）保证绝大部部分遗传信息息能被扩增。。每次T减D反应后仅设置置72℃复性与延伸，，94℃复性这两个参参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性性和所得探针针的纯度非常常高。D.酵母双杂交体体系Two-hybridsystem也叫interactiontrap（相相互互作作用用陷陷井井）），，是是90年代代初初发发展展起起来来的的分分离离基基因因的的新新方方法法，，可可用用于于分分离离能能与与已已知知靶靶蛋蛋白白质质（（targetprotein）相相互互作作用用的的基基因因。。基本本原原理理：：真真核核生生物物的的转转录录因因子子大大多多是是由由两两个个结结构构上上分分开开、、功功能能上上独独立立的的结结构构域域组组成成的的。。如如GAL4的N端1-147aa是DNA结合合域域（（BD），，其其C端768-881aa是转转录录激激活活域域（（AD）。。一一般般情情况况下下，，AD能与与GAL4效应应基基因因启启动动子子上上游游的的特特定定DNA区段段（（UAS）相相结结合合，，而而此此时时，，AD则推推动动了了转转录录起起始始。。若用用基基因因工工程程的的方方法法，，将将GAL4AD和BD分别别克克隆隆到到不不同同的的载载体体上上，，导导入入同同一一细细胞胞株株中中表表达达，，效效应应基基因因无无法法被被激激活活,但可可把把来来自自不不同同转转录录因因子子的的AD或BD区域域连连成成一一个个功功能能基基主要要实实验验过过程程：：a.选择择缺缺失失GAL4编码码基基因因的的酵酵母母寄寄主主菌菌株株-SFY526或HF7c；b.构建建带带有有GAL1UAS-启动动子子-lacZ（His3）的的转转化化载载体体;c.把已已知知的的靶靶蛋蛋白白质质编编码码基基因因克克隆隆到到pGBT9的多多克克隆隆位位点点上上，，把把所所有有cDNA都克克隆隆到到pGAD424载体体上上，，构构成成cDNA表达达文文库库。。d.从大大肠肠杆杆菌菌中中分分别别提提取取这这两两种种重重组组质质粒粒DNA，共共转转化化感感受受态态酿酿酒酒酵酵母母菌菌株株。。e.将共共转转化化的的酵酵母母菌菌株株涂涂布布于于缺缺少少Leu，Trp和His的培培养养基基上上，，筛筛选选表表达达相相互互作作用用的的杂杂种种蛋蛋白白的的阳阳性性菌菌落落。。