项目一(五)：常用生物化学实验技术及原理课件

生物化学实用技术主讲老师：刘名江生物与生态工程学院（一）生物大分子的制备和保存技术

——蛋白质、核酸的分离和提纯

研究生物大分子，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。基本原理不外乎两方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心、超滤等。（二）色谱分离技术色谱分离技术，又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用混合物中各组分的理化性质（溶解度、吸附力、分子极性、分子形状和大小等）的不同，使各组分以不同程度在两个相中，其中一个相是固定的。不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离色谱分析法的由来1906年，俄国植物学家Tsweet将CaCO3固体粉末装入竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用石油醚连续地冲洗。结果在柱中出现了颜色不同的色带。因此，Tsweet把这种方法称为色谱法。如今，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。所以色谱法已经失去原来的含义。但是，现在仍沿用色谱法这个名称。色谱法具有分离及分析两种功能。它是分析混合物最有力的手段。色谱分离是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域，以解决各种分离分析课题。凝胶色谱分离技术原理3、色谱分类流动相与固定相聚集态（1）按两相所处的物态分类（3）按固定相的外型分类固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。（4）按照展开程序分类

按照展开程序的不同，可将色谱法分为洗脱法、顶替法、和迎头法。洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图AB

这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法。顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图AB

此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后，才能再使用。迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。流出曲线如下图该法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其余均非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分（组分A），而不适用于对混合物进行分离。分类按流动相分气相色谱（GC）液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）按机理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱

液-固色谱1、概念分光光度法（AbsorptionPhotometry）是一种基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法。是利用物质所特有的吸收光谱对物质进行定性或定量分析的一项技术。包括可见吸光光度法、紫外-可见吸光光度法和红外光谱法等。（二）分光光度技术3、光的本质与溶液颜色的关系（1）光的基本性质光是电磁波。通常用波长、频率来描述。（2）物质的颜色与吸收光的关系从光本身来说、有些波长的光线，作用于眼睛引起了颜色的感觉，我们把人眼所能看见有颜色的光叫做可见光，其波长范围大约在400-760nm之间。实验证明：白光(日光、白炽电灯光、日光灯光等)是由各种不同颜色的光按一定的强度比例混合而成的。如果让一束白光通过三棱镜，就分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色的光，这种现象称为光的色散。每种颜色的光具有一定的波长范围。我们把白光叫做复合光；把只具有一种颜色的光，叫做单色光。

实验还证明，不仅七种单色光可以混合成白光，如果把适当颜色的两种单色光按一定的强度比例混合，也可以成为白光。这两种单色光就叫做互补色。如绿光和紫光互补，蓝光和黄光互补，等等。对固体物质来说，当白光照射到物质上时，物质对于不同波长的光线吸收、透过、反射、折射的程度不同而使物质呈现出不同的颜色。如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色；如果完全反射，则呈现白色；如果对各种波长的光吸收程度差不多，则呈现灰色；如果物质选择性地吸收某些波长的光，那么，这种物质的颜色就由它所反射或透过光的颜色来决定。4、光的吸收定律（1）透光率和吸光度当一束单色光透过均匀、无散射的溶液时，一部分被吸收，一部分透过溶液，即I0＝Ia＋It式中：I0为入射光的强度，Ia为溶液吸收光的强度，It为透过光强度。透光率，用符号T表示，即：T＝It/I0×100%透光度率的倒数反映了物质对光的吸收程度，应用时取它的对数做为吸光度，用A表示。即：

A＝lgI0/It＝lg1/T＝－lgT（2）光的吸收定律：朗伯－比尔定律当一束平行的单色光通过均匀、无散射现象的溶液时，在单色光强度、溶液的温度等条件不变的情况下，溶液吸光度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。

A＝KcL朗伯－比尔定律不仅适用于有色溶液，也适用于无色溶液及气体和固体的非散射均匀体系；不仅适用于可见光区的单色光，也适用于紫外和红外光区的单色光。（3）吸光系数摩尔吸光系数指波长一定时，溶液的浓度为1mol/L时，液层厚度为1cm的吸光度，单位为L/(mol·cm)，用ε表示。

ε＝A/cL比吸光系数指波长一定时，溶液浓度为g/L，液层厚度为1cm的吸光度，单位为L/(g·cm)，用表示。α＝A/cL可以通过下式换算：ε＝αM

M为摩尔质量6、定量分析方法

（1）单组分的定量A、标准曲线法测定时，先取与被测物质含有相同组分的标准品，配成一系列浓度不同的标准溶液，置于相同厚度的吸收池中，分别测其吸光度。然后以溶液浓度c为横坐标，以相应的吸光度A为纵坐标，绘制A－c曲线图，如果符合比尔定律，该曲线为通过原点的一条直线-标准曲线，如右图所示。在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上便可查出与此吸光度对应的样品溶液的浓度。标准曲线（A-c曲线）B、对照法对照法又称比较法。在相同条件下在线性范围内配制样品溶液和标准溶液，在选定波长处，分别测量吸光度。根据比尔定律

A样＝K样·c样·L样

A标＝K标·c标·L标因是同种物质，同台仪器，相同厚度吸收池及同一波长测定，故K样＝K标，L样＝L标，所以：c样＝A样/A标·c标为了减少误差，比较法配制的标准溶液浓度常与样品溶液的浓度相接近。当测定不纯样品中某纯品的含量时，可先配制相同浓度的不纯样品溶液（c原样）和标准品溶液，即c原样＝c标，c样为c原样溶液中纯被测物的浓度。在最大吸收峰处分别测定其吸光度A值，便可直接计算出样品的含量。（2）多组分的定量

根据吸光度的加和性，可以在同一试样中不经分离同时测定两个以上的组分上图（a）表明，A、B组分互不干扰，因此可分别在处测定A、B组分的吸光度，从而求出各自的含量。上图（b）则说明溶液中A、B组分彼此相互干扰，这时可在波长处分别测定A、B两组分的总的吸光度A1和A2，然后再根据吸光度的加和性联立方程7、吸光度的测量原理

分光光度计实际上测得的是光电流或电压，通过转换器将测得的电流或电压转换为对应的吸光度A。测定时，只要将待测物质推入光路，即可直接读出吸光度值。测定步骤：（1）调节检测器零点，即仪器的机械零点。（2）应用不含待测组分的参比溶液调节吸光零点。（3）待测组分吸光度的测定。附：吸光光度法的仪器

一般由光源、单色器（分光系统）、吸收池、检测系统和信号显示系统等五部分组成。（1）光源常用的光源为6-12伏低压钨丝灯，电源由温器供给，为了保持光源强度的稳定，以获得准确的测定果，电压必须稳定。（2）单色器（分光系统）

单色器的作用从光源发出的复合光中分出所需要的单色光。单色器通常由由入射狭缝、准直镜、色散元件、聚焦镜和出射缝组成。（3）吸收池（比色皿）比色皿是用透明无色的光学玻璃制作的。大多数比色皿为长方形，也有圆柱形的。一般厚度为0.5、1、2和3厘米。（4）检测系统(又叫光电转化器)

在光度计中，常用的是硒光电池。晒光电池和眼睛相似，对于各种不同波长的光线，灵敏度是不同的。对于波长为500-600nm的光线最灵敏。而对紫外线，红外线则不能应用。光电管和光电倍增管用于较精密的分光光度计中。具有灵敏度高、光敏范围广及不易疲劳等特点。（5）信号显示系统早期使用的是检流计、微安表、电位计、数字电压表、自动记录仪等。现代的分光光度计广泛采用数字电压表、函数记录仪、示波器及数据处理台等。测量光电流的检流计常用悬镜式检流计(也称作直流复射式检流计)，其灵敏度可达10-9安培／格。为了保护检统计，使用中要防止震动或大电流通过。检流计标尺上有两种刻度，等刻度的是表示百分透光率(T％)，对数刻度表示吸光度(A)。根据透光率T，如果把入射光强度IO当作IO光强单位，透过光强度当作100光强单位中的一部分，这一数值为百分透光度，亦称为百分透光率。(四)电泳技术

电泳技术是一种先进的检测手段，与其它先进技术相配合，能创造出惊人的成果，可使人们用较少代价获得最优效益。比如它对解决当前人类所面临的食品、能源、环境和疾病等一系列迫切问题，都有积极作用，显示出强大的生命力。因此电泳技术正越来越多地为人们所重视，广泛应用于各个领域。电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术（electrophoresistechnique）。可以实现电泳分离技术的仪器称之为电泳仪（electrophoresister）。

临床常用的电泳分析方法主要有醋酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和毛细管电泳等。目前，电泳技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、无机离子等成份的分离和鉴定，甚至还用于细胞与病毒的研究。

第一节电泳原理

一、电泳的基本原理物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。

电泳现象和电渗流现象第一节电泳原理

若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为：F引=EQ（16-1）在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻

F阻=6πrηV（16-2）当F引=F阻时EQ=6πrηVV=EQ/6πrη（16-3）由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E)和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒子的半径(r)及溶液的粘度(η)成反比。第一节电泳原理

二、影响电泳的外界因素（一）电场强度（二）溶液的pH值（三）溶液的离子强度（四）电渗作用（五）粒子的迁移率（六）吸附作用V=EQ/6πrη第二节常用电泳方法一、纸电泳指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。

将滤纸条水平地架设在两个装有缓冲溶液的容器之间，样品点于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液润湿后，再盖上绝缘密封罩，即可由电泳电源输入直流电压（100V～1000V）进行电泳。

平卧式电泳槽装置示意图第二节常用电泳方法二、醋酸纤维素薄膜电泳电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、电泳时间短、样品用量少。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。

血清蛋白的电泳图谱第二节常用电泳方法三、凝胶电泳由区带电泳中派生出的一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式。凝胶电泳中的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是普通电泳中应用最多的两种形式。目前，这种办法被广泛用来分析蛋白质和核酸。

凝胶电泳图第二节常用电泳方法四、等电聚焦电泳

1．等电聚焦电泳过程一种利用有pH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。在一个稳定连续的线性pH梯度的溶液（两性载体电解质）中进行分离，每一种被分离的两性物质都移向与它的等电点相一致的pH位置，在那里不再移动（称为聚焦）。

净电荷与PH的关系曲线第二节常用电泳方法2．等电聚焦电泳的特点①使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度；②由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；③电泳速度快;④分辨率高;⑤加入样品的位置可任意选择；⑥可用于测定蛋白质类物质的等电点;⑦适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。第二节常用电泳方法五、等速电泳采用两种不同浓度的电解质，一种为前导电解质，充满整个毛细管柱；另一种为尾随电解质，置于一端的电泳槽中。前导电解质的迁移率高于任何样品组分，尾随电解质则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中移动，实现分离。

等速电泳示意图

第二节常用电泳方法六、双向凝胶电泳（二维电泳）第一向采用等电聚焦根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状。等电聚焦仪

双向凝胶电泳示意图第二节常用电泳方法第一向IEF第二向SDS18cm玻璃板MarkerIPG胶条等电聚焦电泳槽六、双向凝胶电泳（二维电泳）第二节常用电泳方法六、双向凝胶电泳仪器结构制胶板、电泳槽、电源、计算机、扫描仪等第二节常用电泳方法七、免疫电泳免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开；然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。

第三节常用电泳仪的基本结构及技术指标一、常用电泳设备的基本结构（一）电源（二）电泳槽（三）附加装置

垂直电泳仪器装置示意图实验室常用电泳槽和电泳

第三节常用电泳仪的基本结构及技术指标垂直板电泳槽和电源水平电泳槽、电泳仪凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，将凝胶直接浸入缓冲液中。常用于琼脂糖电泳分离核酸。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，在玻璃平板中间制备电泳凝胶。垂直板式电泳常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。

第三节常用电泳仪的基本结构及技术指标二、电泳仪的主要技术指标

1．输出电压6．功率稳定度

2．输出电流7．连续工作时间

3．输出功率8．显示方式

4．电压稳定度9．定时方式

5．电流稳定度

第四节常用电泳仪简介一、稳压稳流电泳仪稳压稳流电泳仪是稳压稳流电泳仪是目前国内中、低压电泳实验中应用最广泛的电泳仪之一。其输出电压的调节范围为0V～600V、输出电流为0mA～100mA。这种电泳仪工作稳定性好、调节范围宽，并设有完善的短路保护电路和过流保护电路。

稳压稳流电泳仪第四节常用电泳仪简介二、全自动醋纤膜电泳仪全自动醋纤膜电泳仪为全自动电泳仪，有可见光单系统，使用醋酸纤维薄膜电泳片，优点为自动化程度高。只需将样品、试剂、电泳片放好，人员可离机完成实验并得到结果。第四节常用电泳仪简介三、全自动荧光/可见光双系统电泳仪全自动荧光/可见光双系统电泳仪只需将样品、试剂和琼脂糖凝胶电泳胶片放好后，其最大优点是荧光系统全自动，只需要20min即可完成电泳分析，速度非常快。操作人员可离机完成实验并得到结果。

第四节常用电泳仪简介四、全自动琼脂糖电泳仪全自动琼脂糖电泳仪，有可见光单系统，使用琼脂糖凝胶电泳胶片。灵敏度高，可适用于低浓度蛋白检验，如尿蛋白、脑脊液蛋白、同工酶的分离。但其自动化程度较差。由于这类电泳仪所能做的项目较多，且灵敏度较高，仍为许多实验室所接受。第四节常用电泳仪简介五、全自动电泳分析系统全自动电泳分析系统，将上述仪器的优点集于一身，仪器自动点样、电泳、呈色（或染色、脱色）、烘干，自动化程度非常高。可用各种电泳片，包括琼脂片、醋酸片、聚丙烯酰胺等，采用可见光及荧光呈色双系统，是一种较理想的电泳仪。

全自动电泳仪第五节毛细管电泳一、毛细管电泳的基本工作原理溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离。

高效毛细管电泳仪第五节毛细管电泳

毛细管电泳仪装置示意图第五节毛细管电泳三、毛细管电泳的特点

1.高灵敏度2.高速度3.高分辨率

4.样品少5.自动化程度高

6.应用范围广

TriSepTM-2010GVpCECSystem第五节毛细管电泳三、毛细管电泳的分离模式（一）毛细管区带电泳它是通过在充满电解质溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分，在电场的作用下，依迁移速度的不同而进行分离。根据组分的迁移时间进行定性，根据电泳峰的峰面积或峰高进行定量分析。

毛细血管区带电泳原理图第五节毛细管电泳（二）毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳(CGE)常用聚丙烯酰胺在毛细管内交联制成凝胶柱，依据分离支撑物的分离作用不同，CGE又分为非变性CGE和变性CGE，前者以分子筛、电荷／质量比的作用进行分离；后者则以质量、分子筛的作用进行分离。适用于分离、测定肽类、蛋白质、DNA类物质的分离。

第五节毛细管电泳（三）毛细管胶束电动色谱(MECC)MECC系统中存在两个相：流动的水相和起到固定相作用的胶束相。在含有胶束的流动相中，溶质在“水相”和“胶束相”(准固定相)之间进行分配，即使是中性溶质，因其本身疏水性不同，在二者之间的分配也会有差异，疏水性强的溶质在“胶束相”中停留时间长，迁移速度就慢。反之，亲水性强的溶质迁移速度就快，最终中性溶质将依其疏水性不同而得以分离。第五节毛细管电泳

毛细管胶束电动色谱原理图第五节毛细管电泳（四）毛细管等电聚焦电泳不同等电点的分子分别聚集在不同的位置上，不作迁移而彼此分离，这就是等电聚焦分离过程。毛细管的等电聚焦是在毛细管内实现的等电聚焦过程，具有极高的分辨率，通常可以分离等电点差异小于0.01pH单位的两种蛋白质，例如肽类、蛋白质的分离。第五节毛细管电泳（五）毛细管等速电泳毛细管内首先导入具有比被分离各组分高电泳淌度的前导电解质，然后进样，随后再导入比各分离组份低电泳淌度的尾随电解质，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中发生分离。

第五节毛细管电泳

（六）毛细管电色谱它包含了电泳和色谱两种机制，是在毛细管中填充或在毛细管壁上键合（或涂壁）固定相，从而构成毛细管色谱柱，依靠电渗流推动流动相，携带样品迁移，根据样品分子的质荷比、分子尺寸及分配系数的差别而分离。

CEC-加压毛细管电色谱仪第五节毛细管电泳（七）毛细管电泳芯片毛细管电泳芯片是在常规毛细管电泳的原理和技术基础上，利用微加工技术在平方厘米级大小的芯片上加工出各种微细结构，如通道和其它功能单元，通过不同的通道、反应器、检测单元等的设计和布局，实现样品的进样、反应、分离和检测，是一种多功能化的快速、高效和低耗的微型实验装置。第五节毛细管电泳四、毛细管电泳仪的基本结构毛细管电泳仪的结构并不复杂，主要有高压毛细管柱、检测器，以及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液槽。（一）毛细管柱（二）检测器（三）毛细管电泳法的进样技术

毛细管电泳仪

第六节电泳仪的维护保养及故障排除

一、电泳仪的维护保养（一）每日维护（二）每周维护（三）每月维护（四）按需进行的维护TriSep毛细管电泳仪

第六节电泳仪的维护保养及故障排除二、电泳仪的故障排除电泳仪是精密仪器，在操作过程中要严格遵守操作规程，但不可避免会出现各种各样的故障，当仪器提示有故障时，应立即处理。

BECKMANCOULTER毛细管电泳仪

第六节电泳仪的维护保养及故障排除故障信息引起故障可能原因解决方法转盘识别错误细微灰尘吸附在灯上仪器关机，用洁净棉签轻轻拭去灯上面的灰尘。仪器开机后再进行测定。

样品识别错误血清分离不好或者有灰尘吸附关机状态，拆开仪器内透明有机玻璃，用无水乙醇擦拭加样针外壁，然后安装好，再用仪器内程序进行加样针清洗，洗完1～2次后，进行加样针加样感应定位。仪器报警出现缺少稀释杯或稀释杯感应错误仪器稀释杯位置错误观察稀释杯位置，如果没有处