逆境胁迫对植物生理生化指标的影响

YUNNANNORMALUNIVERSITY本科学生综合性实验报告学号084120423姓名罗双洪学院生科专业、班级08生技实验课程名称教师及职称开课学期2010至2011学年下学期填报时间2011年6月15日云南师范大学教务处编印

一.实验设计方案实验序号九实验名称逆境胁迫对植物生理生化指标的影响实验时间2011.5实验室4301.实验目的掌握逆境胁迫下一些植物生理指标测定方法；了解脯氨酸(丙二醛、HO)的积累了解逆境胁迫下植物生理生化指标的变化以及逆境伤害和适应的原因。2.实验原理、实验流程或装置示意图1.逆境胁迫与Pro的积累植物在遇到干旱、高温、低温、盐渍等逆境胁迫情况下，植物体内通过①蛋白质的降解、②从头合成和③降低脯氨酸脱氢酶活性等途径合成脯氨酸(Proline,Pro)，从而提高了植物对逆境的抵抗能力。在酸性条件下与茚三酮发生反应生成红色化合物，此化合物在520nm处有最高吸收峰。2.逆境胁迫与丙二醛的积累丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA-TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。3逆境胁迫与HO2的积累植物在遇到干旱、高温、低温、盐渍等逆境胁迫或衰老的情况下，植物体内以HO为代表的活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)大量积累，作为胁迫信号或适应信号启动一系列死亡或适应生理过程。在酸性条件下(pH-1.6)，H2O2将Fe2+氧化为Fe3+，Fe3+进步与二甲酚橙反应形成紫色的复合物Fe3+-XO，此复合物的最大波长为560nm，在一定范围内，其颜色深浅与HO2含量呈线性关系。在此反应中加入山梨醇可提高测定HO2的灵敏度。224实验的一般流程：选取材料一提取目标物质一测定一计算一比较3.实验设备及材料试剂：PBS(提取液)，3%磺基水杨酸(SSA),冰乙酸，茚三酮，0.5%TCA,0.6%TBA,50mMPBS(pH=6.8，内含1mMHA)，5%Ti(SO4)2，20%H2SO4，石英砂等。仪器：研钵，移液枪，分光光度计，离心机等。实验材料：正常条件下的玉米幼苗，干旱条件下的玉米幼苗。实验方法步骤及注意事项试验方法步骤：逆境胁迫与Pro的积累Pro的提取：分别取0.5g实验组和对照组的胚芽鞘…加入3ml3%磺基水杨酸(SSA)和少许石英砂一充分研磨一用2ml3%SSA洗研钵-5000rpm离心10min一上清液定容至5ml。测定：上清液各2ml一分别加入2ml冰乙酸和2ml茚三酮试剂一煮沸15min一冷却后分别测定A520……A,一、计算：Procontent=520xV(mmol.gTFW)sxLxW逆境胁迫与丙二醛(MDA)的积累MDA提取：分别取0.5g实验组和对照组一加入3ml50mMPBS(pH=7.8)或0.5%TCA和少许石英砂一充分研磨一用2mlPBS或0.5%TCA洗研钵一5000rpm离心10min一上清液定容至5ml。测定：分别取上清液各2ml一加入0.6%TBA(用0.6%TCA配制)2ml—煮沸12min一冷却一5000rpm离心10min一分别测定OD和OD③计算：OD450C1X85.4OD532=C1X7.4+155000XC2求解方程得C1/(mmol/L)=11.71OD450C2/(umol/L)=6.45OD532-0.56OD450式中，C1为可溶性糖的浓度；C2为MDA的浓度逆境胁迫与HO的积累HO提取：分别取0.5g实验组和对照组一加入3ml50mMPBS(pH=6.8,内含21n2MHA)和少许石英砂一充分研磨一用2mlPBS洗研钵一5000rpm离心10min一上清液定容至5ml。测定：分别取上清液各2ml—加入2ml5%Ti(SO4)2:用20%(v/v)H2SO4配制，空白调零用20%HSO取代］一反应10min—5000rpm离心10min一测定OD41024计算：HOcontent=A410/e.L.WXVTXV1/V2(mmol.gTFW)试验注意事项：研磨要充分，注意材料不要溅出，用提取液洗研钵时要尽量充分；正确离心并且正确取舍液体或沉淀；HO2的积累测定时，实验组添加的试剂是5%Ti(SO4)2对照组使用的试剂是20%H2SO4取(由于5%Ti(SO4)2是使用H2SO4配制而成的)；实验数据处理方法逆境胁迫与Pro的积累记录Pro的提取及测定过程中的现象：■…，一、分别测定A520计算：Procontent=?2匕xV(mmol.gTFW)逆境胁迫与丙二醛的积累记录MDA提取和测定过程中的现象：分别测定OD450和并OD532计算：OD450C1X85.4OD532=C1X7.4+155000XC2求解方程得C1/(mmol/L)=11.71OD450C2/3mol/L)=6.45OD532-0.56OD450式中，C1为可溶性糖的浓度；C2为MDA的浓度逆境胁迫与HO的积累记录HO提取及测定时的现象测定Od410计算：HO2content=A410/e.L.WXVTXV1/V2(mmol.g-1FW)参考文献【1】李合生主编.《植物生理学学习指导与题解》.武汉：华中科技大学出版社，2003【2】张志良、瞿伟菁.植物生理学实验指导:第3版[M].北京:高等教育出版社,2003.【3】潘瑞炽主编.植物生理学(第五版).北京：高教出版社，2004.【4】潘瑞炽主编.植物生理学(第五版).北京：高教出版社，2004.二.实验报告实验现象及结果结果记录表：条件重量体积OD值现象ProOD520干旱0.5g5ml1.463深红正常0.5g5ml0.278浅红MDAOD450OD532干旱0.5g5ml1.6640.486黄色正常0.5g5ml0.7400.282浅黄H2OOD410干旱0.5g5ml0.735浅红正常0.5g5ml0.024浅红计算过程：逆境胁迫与Pro的积累干旱条件下：Procontent=——金20—xV=————x5=4.5154(mmol.g-1FW)exLxW3.24*1*0.5s正常条件下：Procontent=—A520—xV=——0.278——x5=0.8488(mmolg-1FW)exLxW3.24*1*0.5逆境胁迫与丙二醛的积累干旱条件下：可溶性糖C]/(mmol/L)=11.71OD450=11.71X1.664=19.49(mmol/L)MDAC2/(umol/L)=6.45。站②-0.56OD=6.45X0.486-0.56X1.664二2.20(umol/L)正常条件下：可溶性糖C1/(mmol/L)=11.71OD450=11.71X0.740=8.6654(mmol/L)MDAC2/(Umol/L)=6.45OD532-0.56OD450=6.45X0.282-0.56X0.740=1.40(umol/L)逆境胁迫与HO2的积累干旱条件下：HQcontent=A41".L.WX*XV1/V222=0.735/0.28umol/L.cmX1cmX0.5gX4mlX5ml/2ml=13.125(mmol.g-1FW)正常条件下：HOcontent=A41C/e.L.WXvtXV1/V222=0.024/0.28umol/L.cmX1cmX0.5gX4mlX5ml/2ml=0.426（mmol.g-1FW）对实验现象、实验结果的分析实验植物（玉米）生长特性干旱条件下的玉米植株生长情况为：茎部分呈现暗红色，叶片呈黄绿色，与正常条件下生长的玉米植株对比，其茎生长矮小，叶片基本伸展不开，呈蜷缩状，根系短小粗壮，研磨时干旱条件下的玉米植株比正常条件下的玉米植株难充分研磨，说明整个生长器官的含水量很低。试验现象的分析在试验中不同的物质测定试验中，试验时溶液呈现的颜色不同。因为试验指标不同，试验时采用的材料（玉米）处理条件不同，所以试验结果没有可比性，只能作描述，不能的到一个具体的结论。计算结果分析Pro的积累结论：干旱条件下Pr。的积累较高丙二醛的积累结论：干旱条件下丙二醛（MDA）的积累和可溶性糖的积累较高HO2的积累结论：干旱条件下HO2的积累明显较高植物的旱害及抗旱性2（1）干旱及旱害根据干旱发生的场所和产生的原因，可分为三种：土壤干旱、大气干燥以及生理干旱。土壤干旱是指土壤可利用水缺乏。当土壤干旱时，根系吸水满足不了叶片蒸腾失水的需要，植物发生水分亏缺，不能维持正常的生理活动，而受到伤害。土壤干旱时将引起植物的永久萎蔫。永久萎蔫指由于土壤水分缺乏引起的萎蔫，这种萎蔫，经过夜晚（停止蒸腾）也把不能解除。要解除萎蔫，必须给土壤补充水分。永久萎蔫时的土壤含水量称为永久萎蔫系数，这时的土壤水势约为-1.5MPa。（2）旱害的机理干旱时植物的伤害体现在两个方面：①整体水平：一是抑制生长，降低产量；二是使植物死亡。干旱抑制生长和使植物死亡具有不同的机理；②器官、组织水平：生长受抑，失去正常功能，部分或全部坏死；③细胞水平：代谢失调，膜损伤，失去正常功能，甚至死亡。干旱抑制植物生长的机理：①降低细胞膨压，抑制细胞扩大和分裂，从而抑制植物的伸长生长。②抑制光合作用，降低光合生产力；③呼吸代谢异常；物质代谢紊乱。实验结论从实验数据的计算结果对比能够知道Pro、MDA、HO的积累在干旱条件下均比正常条件下的高，即逆境胁迫对植物影响上述几项生理生化指标的增加。结合旱生植物的抗旱机制，抗旱植物应具有下列特征：发达的根系，可吸收土壤深层的水分，在干旱时保证充足的水分供应；灵敏的气孔调节能力和特殊的气孔结构，如气孔内陷，发达的角质层，减少蒸腾失水；在干旱时，叶片卷曲或脱落，降低蒸腾面积，减少蒸腾损失。叶片脱落对植物度过干旱期有利，但对生物产量和经济产量将会产生不利影响；渗透调节能力强，增大细胞保水或吸水能力；细胞体积小，减轻脱水时的机械损伤；细胞原生质含有较多的保护性物质，如活性氧清除能力强等。提高植物抗旱的途径提高植物抗旱根本途径是进行抗旱育种，培育抗旱品种。提高抗旱性的常用措施有：抗旱锻炼：人为创造不同程度的干旱条件，提高植物对干旱的适应能力。促进根系发育，提高渗透调节能力，积累保护性物质，增强抗脱水能力。合理施肥：多施P、K肥。P素促进蛋白质的合成，增大原生质的水合度，K作为渗透物质和促进碳水化合物运输，降低渗透势。化学调控：施用植物生长调节剂ABA、PP333、S3307、多效唑、黄腐酸等。三.实验总结本次实验成败之处及其原因分析、改进措施:1、成功之处：通过实验了解和掌握了逆境胁迫对植物生理生化指标的影响的测定原理和方法，使学过的理论知识上升到更具体化的层次。实验中涉及到三种生理生化指标（Pro、MDA、HO2）的积累的测定，每种指标都单独设置对照组，分别是玉米干旱和正常情况下生长的对照。本次试验能够使我们更深入的了解逆境胁迫对植物生理生化指标的影响以及更好的防治它带来的危害。我们通过实验真正的学习到了实验所要求的操作技术，接触到的实验操作和分析方法在大脑中形成的印象，能够使我们在自己设计实验的时候多一些选择和思路。可以说基本上是达到实验的目的。2、不足之处：在实验过程中弄清楚了实验的原理和操作，但是由于在Pro测定和MDA测定中，时间比较紧凑，来不及细细回想，因此对部分操作步骤不是很清晰，虽然在理论上弄清楚了实验的操作步骤，但是具体的操作依然存在模糊的地方。在实验中我们消耗