移植配型的分子分型法课件

二、分子生物学分型法

1.RFLP与PCR-RFLP分型法

将目的基因片段PCR扩增后，利用多种限制性内切酶对扩增产物进行酶切，不同的基因序列会产生不同的酶切产物，从而产生不同的电泳图谱。它以简单、敏感、准确，无需同位素等优点成为目前较常用的HLA基因分型技术之一，但是无法分辨杂合子，且只能区分有限的多态性。供者？受者电泳2.PCR-SSP分型法[等位基因特异性PCR]

设计出一整套等位基因组特异性引物（sequencespecificprimer,SSP），借助PCR技术获得HLA型特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HLA型别，从而大大简化了实验步骤。优点是简单易行,分辨率可从低到高,成本低。缺点是不易自动化;不能检测新的等位基因，试剂盒需不断升级。PCR-SSP分型法操作步骤

1．基因DNA提取

2．引物混合物的组成

3．TaqDNA聚合酶

4．扩增条件的选择

5．电泳

6．结果判断1：阴性对照；2：为DR3；3：为DR11；4：为DR4；5:为DR1；6：为DR12；7：为DR15；8：为DR12；9：为Mark。

图：HLA-DR1、DR15阳性的杂合子电泳图谱3．PCR-SSO（PCR序列特异性寡核苷酸探针）技术分型原理是：应用位点或组间特异引物对HLA的多态区域进行PCR扩增，扩增过程中对产物进行放射性同位素或非放射性标记，根据碱基配对原则设计系列寡核苷酸探针并将其固定在膜上，PCR产物与膜上探针进行特异性杂交反应，最后通过放射自显影、显色或化学发光的信号进行结果判断。如果探针与产物DNA结合则结果阳性，反之，探针在洗膜中被洗脱，结果阴性。4.PCR-SSCP

（

PCR单链构象多态性）分型法

如果二个HLA等位基因存在点突变，经PCR扩增后进行聚丙烯酰凝胶电泳，因其序列的差异形成不同的空间构象，则电泳迁移率也不一样，如此可将它们区别开。如果供、受者的SSCP带型完全一致，则说明两者HLA基因相匹配，反之则说明不匹配。

目前PCR-SSOP、PCR-SSP和PCR-SBT方法是被国际组织相容性协作组推荐的HLA分型方法，其中PCR-SBT技术更被誉为HLA分型的金标准，是迄今为止最可靠、最彻底、最准确的HLA分型方法，同时也是发现和鉴定新的HLA等位基因的主要途径，但由于其检测成本昂贵、技术复杂，且需要特定设备及详尽的软件，因而在HLA临床常规分型中较少使用。三、交叉配型将受者和供者淋巴细胞进行混合培养（mixedlymphocyteculture,MLC），由于淋巴细胞表面富有HLA-I和HLA-II分子，若供、受者HLA抗原差异较大，彼此间将产生较大的刺激，淋巴细胞产生较强的增殖反应，细胞增殖反应的水平与供、受者间组织相容性程度呈负相关。混合淋巴细胞培养(体外移植模型)返回章目录HLA氨基酸残基配型标准

鉴于目前器官移植执行的HLA六抗原无错配标准在临床实际应用中受到诸多客观条件的限制，其中最主要的是难以找到与受者HLA匹配的供者。大量临床移植病例的回顾性研究表明：HLA某些抗原对移植效果具有重要影响，而有些抗原的影响则并不重要；同样是供受HLA错配，有些错配对受者存活率影响明显，而有些影响则不明显或没有影响。HLA氨基酸残基配型标准

HLA氨基酸残基配型标准主要依据是:在HLA分子346个氨基酸残基中对移植物排斥与存活率具有重要影响的关键氨基酸残基。当供受者的HLA关键部位氨基酸残基相同时，即使受者接受了存在HLA抗原错配的供体，但产生的移植排斥反应仍然是低反应或无反应，从而使移植物得以长期存活。目前，氨基酸残基配型标准的应用研究主要集中在肾脏移植领域，不但大幅度提高了供受者的相配几率，而且对移植物的存活率也得到显著改善。练习题一、填空题：1.移植配型(又称为HLA配型/组织配型):指在器官移植中检验供受者之间_______是否相配的一系列措施。目前主要检测的是ABO抗原系统和_______系统。4.HLA配型与移植效果最为密切的是_______

，因移植物中存在大量的淋巴免疫细胞可识别宿主抗原，进而攻击宿主靶组织产生_______反应,且不易被免疫抑制剂所控制。5.在肾移植中