慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤

-.z.一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1.随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进展冻存。2.在细胞对数生长期进展冻存，增加细胞复苏成活率。3.倒去细胞上清液，参加D-Hank's液洗去残留的培养基。4.参加0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。5.镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，参加新鲜培养基吹打混匀。6.细胞计数。7.将细胞离心，1000rpm，2min。8.根据计数结果参加细胞冻存液〔70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO〕重悬细胞，密度为3×106个/ml。10.第二天将细胞放入液氮灌，并记录。二、293T细胞的传代1.当细胞生长至集合率到达80~90%需要对细胞进展传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。2.消化细胞，方法同上。3.细胞离心完毕后，参加完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。4.分到10cm培养皿中，10ml/皿。三、293T细胞的复苏1.当细胞传代次数过多〔超过50代〕，细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开场冻存的细胞进展复苏。2.翻开水浴锅，设置温度为40℃。3.查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞〔需戴上棉手套，防止被冻伤〕，迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2min内使细胞溶液完全溶解。4.将1ml细胞溶液参加9ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。5.放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。6.第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，参加10ml新鲜培养基。二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1.所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3'(forwardprimer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3'(reverseprimer)and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3'(probe)2.TaqManUniversalPCRMasterMi*(AppliedBiosystems，cat.no.4304437)3.TaqManDNATemplateReagentKit(AppliedBiosystems，cat.no.401970)4.TaqManRNasePcontrolreagent(AppliedBiosystems，cat.no.4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCCNo.CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞集合率都不准到达100%。慢病毒的包装1.预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM+10%FBS，1%Glutama*，1%青霉素-链霉素。2.将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是8×106个。3.第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为30-40%，分布均匀。4.转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，参加20ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。5.取两支无菌的50ml离心管，其中一支中参加252μgpNL-EGFP/CMV/WPREDU3载体质粒，168μgpCD/NL-BH*DDD包装质粒和84μgpLTR-G质粒，用Opti-MEM培养基补齐到18ml。另一支中参加500μlTrans-EZ溶液和17.5mlOpti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。关键步骤：推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。6.室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。7.取1支5ml的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴参加到细胞培养板中，每板3ml。来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养盘不要超过6盘。8.6小时后，移去细胞上清，更换为17ml的DMEM完全培养基。9.转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是安康的并且密度接近60-80%。如果所转染质粒带有GFP荧光，则这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。10.将细胞送回培养箱继续培养2天〔36-48小时〕。在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。11.收集所有的上清，分装到50ml离心管中。12.4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。13.总的上清约为204ml，用250-ml0.45μmPVDF过滤装置过滤。如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。慢病毒的浓缩与纯化方法一超速离心沉淀法1.取6个Ultra-clearSW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中翻开紫外灯继续消毒30分钟。2.每个Ultra-clearSW28离心管中参加约32ml的预先处理的病毒上清液。3.取一支10ml的移液管，吸取12ml20%的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4ml。同样地，将剩下8ml的蔗糖溶液分别参加到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下3管进展同样处理。4.用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。5.按次序将所有6个离心管放入BeckmanSW28超速离心转头中。7.小心将管子从转头中取出。倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底应当有可见的沉淀。8.每管中参加100ml不含钙和镁的PBS洗下沉淀。9.将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。10.在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。11.4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。12.用200μl移液器轻柔吹打使沉淀重悬。防止产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。13.集中后的病毒悬液分装成50μl每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80℃。方法二PEG-8000浓缩法PEG〔聚乙二醇〕是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离，使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起，病毒的相对浓度提高，到达沉淀浓缩的目的。5*PEG8000+NaCl配制称取NaCl8.766g;PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中；121摄氏度30min湿热灭绝30min；保存在4℃。1.使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；3.每20～30min混合一次，共进展3-5次；4.4度放置过夜；5.4度，4000g，离心20min；6.吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走剩余液体；7.参加适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；8.集中后的病毒悬液分装成50μl每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80℃病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。〞TU〞为〞transducingunits〞的缩写，中文为"转导单位〞，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。第一天细胞准备将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，参加96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备10个孔。放入37℃，5%CO2培养箱中培养。第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5mlEP管，每管参加90μl培养液，往第一个管中参加10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl参加第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度〔10~10-8〕。吸取96孔板中原有的培养基，参加含稀释好的病毒液。并做好标记。第三天追加培养液在每个孔再参加100μl完全培养液，利于细胞的生长。第五天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为*和Y，则滴度〔TU/ml〕=〔*+Y*10〕*1000/2/*孔的病毒液的含量〔μl〕。定量PCR法病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。每孔细胞为5×104个。接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/mlpolybrene的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒参加到199μl的培养基中。在3个培养孔中分别参加0.5μl，5μl和50μl的稀释病毒。感染开场后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI(TakaraMirusBio，终浓度为10U/ml)的新鲜培养基。在37℃消化15分钟，这一步是要除去剩余的质粒DNA。然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。用0.5ml0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。每个样品管中参加200μl洗脱液洗下DNA。用DNA定量试剂盒定量〔Bio-Rad〕。基因组DNA可以稳定保存在-20℃至少2个月。准备PCR所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配总管Ⅰ：2×TaqManMasterMi*25μl×n

Forwardprimer(100pmolml-1)0.1μl×nReverseprimer(100pmolml-1)0.1μl×nProbe(100pmolml-1)0.1μl×n

H2O

19.7μl×n

n=numberofreactions.例如：总反响数为40，将1ml2×TaqManUniversalPCRMasterMi*，4μlforwardprimer，4μlreverseprimer，4μlprobe和788μlH2O混和。震荡后放在冰上。为人基因组序列检测引物配总管Ⅱ：2×TaqManMasterMi*25μl×n

10×RNasePprimer/probemi*2.5μl×n

H2O

17.5μl×n

n=numberofreactions.例如：总反响数为40，将1ml2×TaqManUniversalPCRMasterMi*，100μl10×RNasePprimer/probemi*和700μlH2O混和。震荡后放在冰上。在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。从总管Ⅰ中各取45μl参加到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45μl参加到E-G各行的孔中。分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA参加到A-D行中，每个样品重复1次。另留1个孔参加5μl的水做为无模板对照〔no-templatecontrol〕。分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组DNA参加到E-G行中，每个样品重复1次。另留1个孔参加5μl的水做为无模板对照〔no-templatecontrol〕。所使用定量PCR仪为ABIPRISM7000定量系统。循环条件设定为：50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃15秒，60℃1分钟的40个循环。数据分析：测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。滴度〔integrationunitsperml，IUml-1〕的计算公式如下：IUml-1=(C×N×D×1000)/V其中：

C=平均每基因组整合的病毒拷贝数

N=感染时细胞的数目〔约为1×105〕

D=病毒载体的稀释倍数

V=参加的稀释病毒的体积数慢病毒的储存与稀释慢病毒的储存1.病毒的运输采用干冰保温，收到病毒液后假设几天内用于实验，可于4℃保存〔于一周内用完〕。2.假设病毒量较大，需长期保存。则根据每次实验用量分装后放于-80℃冰箱。一般病毒可以放于-80℃约12个月以上，但假设超过6个月后使用，请重新检测病毒滴度。3.防止反复冻融，否则会降低病毒滴度。每次冻融会降低病毒滴度10%。慢病毒的稀释需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，用细胞培养用D-Hank's、PBS或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于实验〔于一周内用完〕。慢病毒在细胞水平的使用什么是MOI？"MOI〞为〞multiplicityofinfection〞的缩写，中文为"感染复数〞或"复感染指数〞，含义为感染时病毒和细胞数量的比值，即平均每个细胞感染的病毒活性单位数〔TUnumber/cell〕。在实验中将*种细胞感染到达80%时的MOI定义为这种细胞的MOI。MOI与整合事件以及目的基因的表达相关。一定范围内，表达水平和MOI呈正相关。MOI取决于多种因素，如细胞状态，目的基因的大小与性质，细胞的感染效率等。所以，实验前需查阅相关文献，确定慢病毒对目的细胞的亲嗜性、MOI以及在体〔invivo〕注射所需病毒量。假设无文献支持，可以通过预实验得到适宜的MOI。实际上，即使有文献支持，但由于所用细胞代数、细胞状态以及目的基因的差异，实际的MOI和文献报道也会不同，所以要安排预实验以确定所需MOI以及病毒对细胞生长的影响。目的细胞感染预实验及实验体系的放大实验目的：确定细胞感染所需的MOI，以及是否需要添加感染增强剂Polybrene。实验材料：96孔板，1.5mlEP管，长势良好的目的细胞一瓶，滴度的慢病毒溶液，Polybrene〔10mg/ml〕，目的细胞培养基等。第一天：细胞准备将长势良好的目的细胞接种到96板，消化好细胞〔悬浮细胞不需要消化，直接离心收集细胞后加新鲜培养基重悬即可〕后把浓度调为3×104~5×104个/ml，按90μl/孔参加。接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进展病毒感染时细胞集合率介于30~50%之间。第二天：病毒感染感染实验分两组，一组直接添加病毒液，一组同时添加Polybrene。病毒稀释方法同病毒滴度测定时方法，10倍倍比稀释，共三个稀释度，MOI值依次为100，10和1〔细胞经过一天的生长数量约为1×104个/孔，对应的病毒数量为1×106TU、1×105TU和1×104TU〕。每个MOI值加两个孔，取出一组参加感染增强剂，比例为1：2000，终浓度为5μg/ml。第二天：换液感染实验同一天，8-12小时后，弃去上清液，更换为新鲜培养基，100μl/孔。