代谢控制发酵的基本思想2课件

第三章代谢控制发酵的基本思想

第二讲1基本思想：一切断支路代谢二解除菌体自身的反馈调节三去除终产物四增加前体物的合成五特殊调节机制的利用六条件突变株的应用七选育不生成副产物的菌株八选育生产代谢拮抗物质的菌株2四.增加前体物的合成通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株以及克隆某些关键酶的方法，增加目的产物的前体物的合成，有利于目的产物的大量积累。3例1预苯酸苯丙酮酸L-苯丙氨酸前酪氨酸L-酪氨酸预苯酸脱氢酶PD预苯酸脱水酶PTPD缺陷型5例2：在赖氨酸的发酵育种上，对育出的解除了赖氨酸反馈调节的突变株，通过增加丙氨酸营养缺陷等遗传标记，提高产量。6葡萄糖丙酮酸丙氨酸天冬氨酸天冬氨酸半醛苏氨酸二氢吡啶二羧酸赖氨酸亮氨酸协同反馈抑制L-氨基酸α-酮酸AB乳糖发酵短杆菌中赖氨酸,丙氨酸的生物合成途径及其调节A：L-氨基酸丙酮酸转氨酶B：天冬氨酸-β-脱羧酶反馈阻遏反馈抑制抗S-（2-氨乙基）-L-半胱氨酸丙氨酸缺陷型7（2）目的产物的生物合成从别的终产物（氨基酸等）开始时（即别的终产物是目的产物生物合成的前体），除设法解除目的产物自身合成的反馈调节外，也应该设法解除其前体物合成的调节。8葡萄糖天冬氨酸天冬氨酸半醛高丝氨酸苏氨酸α-酮丁酸异亮氨酸赖氨酸蛋氨酸高丝氨酸脱氢酶抗苏氨酸结构类似物2-氨基-3-羟基戊酸（AHVr）突变株

10葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoA乙酸乙酰磷酸柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸草酰乙酸苹果酸反丁烯二酸琥珀酸a-酮戊二酸乙醛酸乙酰CoAL-谷氨酸①②③④⑤⑥⑦⑧黄色短杆菌由葡萄糖和乙酸合成谷氨酸的代谢途径磷酸转乙酰酶②②磷酸转乙酰酶12有报道将具有结构类似物抗性的E.coliK12菌株中Thr操纵子与pBR322质粒相结合，获得重组质粒再转移给适当的受体菌，由于基因扩增，此基因工程菌可产苏氨酸达55g/L，比原株提高3～4倍。14一个细胞在代谢调节中产生阻遏物的量仅满足于和操纵基因结合，如果细胞中含有很多的操纵基因和结构基因，那么一个调节基因所产生的阻遏物就不足以阻遏全部操纵子的活力，因而逃避了调节基因产生的阻遏作用，称为“逃避合成”，这是最直接的提高目的产物产量的方法之一。15例如，β-半乳糖苷酶、青霉素酶、氯霉素转酰酶和天冬氨酸转氨甲酰酶，可借助含有相应结构基因的质粒转移给受体培养物来增加产量；利用含有对苯丙氨酸合成酶编码的结构基因的转导噬菌体可使该酶产量增加15倍。16小结：

增加前体物合成的途径：切断分支代谢途径解除前体物的反馈调节增强分支点代谢流增加关键酶的表达17五、特殊调节机制的利用1.多种产物控制机制的利用2.平衡合成的利用3.代谢互锁的利用4.优先合成的变换18天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰半醛二氢吡啶二羧酸赖氨酸高丝氨酸O-乙酰高丝氨酸蛋氨酸O-磷酸高丝氨酸苏氨酸异亮氨酸天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸激酶黄色短杆菌赖氨酸的合成调节TDHT反馈控制高丝氨酸脱氢酶缺陷高丝氨酸激酶缺陷202.平衡合成的利用ABCDEFGab底物A经分支合成途径生成E和G，由于a酶的活性大于b酶，结果优先合成E。E过量后就抑制a酶，使代谢转向G。G过量后就会拮抗或逆转E的反馈抑制作用，结果使代谢流转向合成E，如此循环不已。21举例：磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoA柠檬酸草酰乙酸天冬氨酸黄色短杆菌中天冬氨酸与乙酰CoA的平衡合成反馈抑制逆转反馈抑制丧失柠檬酸合成酶的突变株23所谓代谢互锁（metabolicinterlock），就是从生物合成途径来看，似乎是受一种完全无关的终产物的控制，它只是在较高浓度下才发生，而且这种抑制（阻遏）作用是部分性的，不完全的。3.代谢互锁的利用24例：黄色短杆菌赖氨酸的合成调节天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰半醛二氢吡啶二羧酸赖氨酸高丝氨酸蛋氨酸苏氨酸异亮氨酸乳糖发酵短杆菌赖氨酸及亮氨酸的生物合成天冬氨酸激酶二氢吡啶二羧酸合成酶亮氨酸反馈抑制反馈阻遏抗AEC+leu-26代谢互锁不仅具有抑制与阻遏作用，还发现具有激活作用。如：枯草芽孢杆菌色氨酸的生物合成途径中，氨茴酸合成酶的活性被组氨酸激活，使用枯草芽孢杆菌的抗5-氟色氨酸突变株生产色氨酸时，通过添加组氨酸使色氨酸产量由2g/L提高到3.4g/L。274.优先合成（preferencesynthesis）的变换底物A经过分支途径生成两种终产物E和G，由于a酶的活性远大于b酶的活性，结果优先合成E；E升高到一定浓度，抑制a酶，使代谢转向合成G，G量增加后抑制c的活性。ABCDEFGabc28天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰半醛二氢吡啶二羧酸赖氨酸高丝氨酸O-乙酰高丝氨酸蛋氨酸O-磷酸高丝氨酸苏氨酸异亮氨酸天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸激酶黄色短杆菌赖氨酸的合成调节TD反馈控制加过量蛋氨酸5g/L突变活性降低1/320g/L30六、条件突变株的应用像温度敏感性突变、链霉素依赖性突变和低温敏感性突变等，因环境条件的不同能显示突变型特性的改变，称为条件致死突变（conditionallethalmutation）。主要是蛋白质的结构基因发生突变。31温度敏感性突变很多微生物可以在20℃-50℃温度范围内生长。通过诱变可以得到在低温下生长，而在高温下却不能生长繁殖的突变株，这样的突变即是温度敏感型突变。32温度敏感型突变的位置常发生在酶的结构基因上，致使一个氨基酸被另一个氨基酸代替。温度敏感突变株高温下酶失活，因而不能生长。改变温度，酶活性在0～100％之间变化，但是难以恢复到100％野生型活性。33如果该酶是蛋白质，维生素或核苷酸生物合成途径上的酶，则该突变株高温下就是一种营养缺陷型。例：如果突变位置发生在为亮氨酸合成酶系编码的基因中，使翻译出来的酶对温度敏感，则高温时就不能合成亮氨酸，即成为亮氨酸缺陷型。34例如：由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌经诱变处理得到温度敏感变异株Ts88，30℃培养时能正常生长，40℃时死亡,但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸(而野生型却受生物素的反馈抑制).

在富含生物素的培养基中进行发酵时:

先在30℃(允许条件)中进行培养以得到大量菌细胞,适