细胞工程笔记

细胞工程笔记第一章绪论工程做代生物技术中的地位生物技术的概念："New"Biotechnology—theuseofcellularandbiomolecularprocessestosolveproblemsormakeusefulproducts.(CB.Feldbaum,2004)现代生物技术的的主要领域发酵工程：利用微生物的特定性状,通过现代工程技术，在生物反应器中生产有用物质的术。如：当前的食品、医用和农用抗生素绝大部分是发酵产品，此外还包括氨基酸、工业用酶，日常生活中的味精、维生素B2等。酶工程：利用酶的催化作用，采用适当的生物反应器工业化的生产人类所需的产品或是达到某一特殊目的的一门生物工程技术。如：a-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶三酶连续作用于淀粉,就可以代替蔗糖生产出高果糖浆；蛋白酶用于皮革脱毛、脱胶和洗涤剂工业等；日常生活中的加酶洗衣粉，嫩肉粉等。基因工程：根据人们的意愿对不同生物的遗传基因进行切割、拼接或重新组合,再转入生物体内产生出人们所期望的产物,或创造出具有新遗传性状的生物类型的一门技术,又称重组DNA技术。如：单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、干扰素、生长因子等药物。蛋白质工程：利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造并分离、纯化蛋白质，从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质的技术。又称"第二代基因工程”。如：提高葡萄糖异构酶热稳定性、速效胰岛素、嵌合抗体、治癌酶的改造等。生物化学工程：应用化学工程的原理和方法,研究解决生物反应过程中的基础理论及工程技术问题。如：新型生物反应器系统及相关培养和放大技术、工艺的研究与开发,新型分离方法和设备的研究开发,描述生物反应过程的数学模型的建立,生产过程在线检测和控制手段的完善等。细胞工程地位:细胞工程是现代生物技术的桥梁和纽带二细bt程学研究范麟1、概念和分类概念:以生物细胞、组织或器官为研究对象,运用生命科学理论，以及工程学原理与技术,有目的的利用和改造生物遗传特性或生物学特性,以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。根据研究对象不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程2、细胞工程学的研究领域原生质体培养(protoplastculture)组织、器官或细胞培养(tissue,organorcellculture)植物胚胎培养(embryoculture)染色体工程(chromosomeengineering)转基因动植物(transgeneticanimalandplant)动物胚胎移植、胚胎培养和试管动物(embryotransfer,embryoculture,tubeanimal)克隆动物(clonedanimal)3、细胞工程学的研究任务细胞、组织或器官的形态发生规律；研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件；细胞融合方法和机理；植物材料的快速大量繁殖方法；种质资源的离体保存机理和方法；动物胚胎移植、胚胎体外生产及动物克隆技术等；再生个体的遗传和变异；改良生物品种，创造新的生物种类，为人类造福。三、细sax程^史-)植物细胞工程发展史19世纪末和20世纪初探索期(1859-1929X成熟期(1930-1959)和迅速发展期(1960年至今)理论基础:生物细胞的全能型(totipotency):个体或组织、器官已经分化的细胞在适宜的培养条件下具有再生成完整个体的遗传潜能。1、探索期1902年GottlichHaberlandt(德.哈泊兰德)根据细胞理论提出植物可以不断分割至单个细胞，在适当的条件下单细胞具有发育成完整植株的能力。celltheoryAlllifeformsaremadefromoneormorecells.Thecellisthesmallestformoflife.Cellsonlyarisefrompre-existingcells."如果具有与有机体内一样的条件时，每个细胞应该可以独立生活和发展”（《细胞学》Schwann,1839——这一论点成为组织培养研究的思想基础。随后,许多科学家从事组织培养研究。1904年，德国植物胚胎学家Hanning（汉宁）用萝卜和辣根的胚进行离体培养,提早长成了小植株。常规：幼胚一（成熟）种子一（发芽）植株组织培养：幼胚一（培养）植株首次获得植物器官（胚）离体培养成功。1922年，Kotte（德，科特）和Robbins（美，罗宾斯）对豌豆、玉米、棉花等的茎尖、根尖进行了离体培养,发现了培养的分生组织能进行有限的生长。首次植物组织培养。1925年，Laibach（德，莱巴赫）进行亚麻种间杂种幼胚培养,成功得到了杂种植物。证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性。2..成熟期White、GautheretsNobecourt等科学家被誉为植物组织培养的奠基人。40年代末开始,从脱分化细胞组织培养进入探讨器官再分化的研究。细胞（组织、器官）-【脱分化】愈伤组织（分生细胞）-【再分化】不定芽、根（双极性胚状体）一植株1957年Skoog（美，史库克）和Miller（米勒）提出了植物激素控制器官形成的概念，首次证实IAA/BA的比例是组织培养中控制根和芽形成的重要条件。1958年Steward（英，斯图尔德）和Reinert（德，雷那特）从胡萝卜根的悬浮细胞中成功从单个细胞诱导出成熟的体细胞胚,首次证实了细胞全能性学说。3、迅速发展期1）原生质体培养和细胞融合1971年,Takebe（日,塔克伯）等从烟草原生质体得到再生植株,首次获得原生质体植株再生成功。1972年，Carlson（美，卡尔森）等通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种植株。1978年，Melchers（梅尔彻斯）进行了马铃薯和番茄的融合实验,获得了第一个属间杂种植株。2）微繁技术1960年，Morel（法，莫里尔）提出了利用茎尖离体快速无性繁殖兰花的方法，在此基础上，国际上建立了兰花工业，取得了巨大的经济效益和社会效益。3）花药培养技术1973年，Nitch采用花药预培养的方法，首次获得了烟草花粉植株。4）次生代谢产物生产1959年，Tulecke和Nickell首先进行了较大规模细胞培养，在一个20L的植物细胞封闭式悬浮培养系统中，成功培养了银杏、冬青等细胞。20世纪80年代植物细胞工程技术开始大规模应用于植物遗传改良和快速繁殖，在人工种子、种质资源的保存和细胞培养次生代谢物质也进行了研究和开发。1985年首批转基因植物（抗虫/抗病毒）开始进行田间试验,1986年美国EPA批准了转基因烟草的释放。1994年美国FDA批准了第一个转基因食品FlavrSavrTM西红柿。二）动物细胞工程发展史1、培养技术1907年，Harrison首先培养了蛙胚神经管细胞，并观察到有新的神经细胞生成。这标志着动物细胞培养的开始。1911年，Carrel发现了鸡胚浸出液对于培养细胞的生长促进作用,并首次把无菌技术引入组织培养技术中。1914年，Thomson建立了器官培养技术。1940年，1951年,Earle和Gey分别建立了C3H小鼠结缔组织细胞系的L系和人体细胞系一人体宫颈癌Hela细胞系。2、细胞融合技术1958年，Okada发现紫外灭活仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。1965年，Harris诱导不同动物体细胞融合获得成功并培养存活。1964年，Lifflefield根据亲本细胞的酶缺陷型，利用HAT选择性培养基使亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞，并能不断增殖，从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。3、多倍体诱导技术1959年，Swarup用低温处理三棘刺鱼获得了三倍体，并饲养至性成熟。现在人工诱导多倍体已成为经济水生动物育种的主要技术。4、克隆技术首例克隆动物成功的报道是在1962年，英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有1%的重组卵发育成为成熟蛙。1997年2月，Wilmut(英)在《Nature》报道了世界第一只克隆羊的诞生。■in第二章细胞2.2细胞岫生长与衰亡■in细胞增殖(cellproliferation):单细胞生物细胞增殖导致生物个体数量的增加。多细胞生物由_个单细胞即受精卵分裂发育而来,细胞增殖是多细胞生物繁殖基础。成体生物仍然需要细胞增殖，主要取代衰老死亡的细胞，维持个体细胞数量的相对平衡和机体的正常功能。机体创伤愈合、组织再生、病理组织修复等，都要依赖细胞增殖。2.2.1细胞周期(cellcycle)细胞周期(cellcycle):连续分裂的细胞从一次细胞分裂结束开始，到下一次细胞分裂结束所经历的过程。DNA合成前期(pre-DNAsynthesis,Gl期)DNA合成期(phaseofDNAsynthesis,S期)DNA合成后期(post-DNAsynthesis,G2期)细胞分裂期(phaseofcelldivision,M期)有丝分裂(mitosis)减数分裂(meiosis)无丝分裂(amitosis)2.2.2细胞分裂细胞分裂(celldivision):是细胞一分为二的增殖过程,从而产生新细胞。无丝分裂特征:分裂速度快，不出现染色体和纺锤体等结构，核膜核仁也不消失。有丝分裂：即体细胞分裂,通过分裂产生同样染色体数目的子细胞，包括核分裂和胞质分裂两个过程。前期(prophase)中期(metaphase)后期(anaphase)末期(telophase)胞质分裂(cytokinesis)开始于细胞分裂后期,在赤道板周围细胞表面下陷，形成环形缢缩,称为分裂沟(furrow)。分裂沟的位置与纺锤体和钙离子浓度的变化有关。胞质分裂开始时，大量肌动蛋白和肌球蛋白在中体处组装成微丝并相互组成微丝束,环绕细胞,称为收缩环(contractilering)0收缩环收缩、收缩环处细胞膜融合并形成两个子细胞。植物细胞胞质分裂：与动物细胞胞质分裂不同的是，植物细胞胞质分裂是因为在细胞内形成新的细胞膜和胞壁而将细胞分开植物细胞胞质分裂有丝分裂的意义有丝分裂的过程是亲代细胞的染色体复制,再平均分配到两个子细胞中,从而保证了亲、子代两代细胞中含有相同数目和形态结构的染色体,在亲子代之间保持遗传性状的稳定性和遗传性。减数分裂(MEIOSIS):是细胞仅进行一次DNA复制,随后进行两次分裂,染色体数目减半的一种特殊的有丝分裂,仅出现在生殖细胞成熟过程中。减数分裂的意义：1、遗传物质只复制一次，细胞连续分裂两次,导致染色体数目减半；2、S期持续时间较长；3、同源染色体在减数分裂期I(MeiosisI)配对联会、基因重组；4、减数分裂同源染色体配对排列在中期板上,第一次分裂时,同源染色体分开。减数分裂的特点:1、遗传物质只复制一次，细胞连续分裂两次,导致染色体数目减半；2、S期持续时间较长；3、同源染色体在减数分裂期I(MeiosisI)配对联会、基因重组；4、减数分裂同源染色体配对排列在中期板上,第一次分裂时,同源染色体分开。2.2.3细胞衰老衰老(senescing,aging)是机体在退化时期生理功能下降和紊乱的综合表现，是不可逆的生命过程。单细胞生物:细胞衰老或死亡就是个体衰老或死亡多细胞生物:细胞衰老不等同于个体衰老细胞衰老机制差错学派代谢废物积累自由基学说线粒体损伤假说体细胞突变与DNA修复遗传学派基因程序理论复制性衰老(端粒假说)长寿基因端粒由端粒DNA和与端粒DNA特异结合的端粒结合蛋白组成的核糖核酸的蛋白质复合物0端粒DNA由非编码的重复序列组成，不同物种的DNA重复序列的重复数不同o不同的真核细胞端粒存在类似的DNA序列与结构,且高度保守。其共同的特征是富含G,而且富含G的链(5'-3‘)比富含C的链(3'-5‘)突出12-16个核苜酸。端粒结合蛋白TBPs:双链TBPs和单链TBPs0端粒酶的实质是一种自身携带模板的反转录酶，由RNA和蛋白质亚基组成，能维持端粒的长度人端粒酶RNA模板区与端粒的3'末端结合后,利用其本身的片段合成端粒DNA,到达模板的5'端后，通过移位，又与新合成的端粒DNA结合，合成新的端粒片段。(引自GriederC,BlackburnE.In:Naturel990:345:458-460.)细胞坏死(necrosis):指细胞遭受到强烈有害损伤条件(物理、化学、生理)刺激时，出现的一种被动的、突发性的、非生理性死亡。表现：膜通透性增加，细胞外形发生不规则变化，内质网扩张，核染色质不规则的位移,线粒体及核肿胀，溶酶体破坏，细胞膜破裂,胞浆外溢等，从而诱发炎症反应。细胞凋亡Apoptosis，又称程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)，指特定的内部或外部因素诱导启动细胞内有基因编码的"死亡程序”，从而导致细胞死亡的过程。这是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程。•Apoptosis的概念源自于希腊语，原意是指树叶或花的自然凋落；•细胞发生程序性死亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，凋亡的细胞散在于正常组织细胞中，无炎症反应，不遗留疤痕。•死亡的细胞碎片很快被巨噬细胞或邻近细胞清除，不影响其他细胞的正常功能。细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀,并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态,沿着核膜分布。细胞质向外出芽，形成膜包围的凋亡小体凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化典型的apoptosis症状:圆形细胞没有微绒毛，互相分离，染色质凝缩成新月状，与核膜相连。线粒体结构保存完整多核糖体仍然可见，有自动吞噬泡细胞坏死与细胞凋亡2.3配子发生与皿发育生物生殖方式：无性生殖(asexualreproduction)有性生殖(sexualreproduction)无融合生殖(apomixis)有性生殖：通过性细胞的产生、融合并进一步发育成新个体的生殖方式。2.3.2受精受精(fertilization):指雌配子(femalegamete)和雄配子(malegamete)融合为合子(zygote)或受精卵(oosperm\2.3.3胚胎发育受精卵通过细胞生长、分裂和分化形成各种形态和功能不同的细胞，发育成动植物有机体的过程。胚盘上、下方出现腔:羊膜腔amnioticcavity:上胚层靠滋养层侧。卵黄囊yolksac:下胚层靠胚泡腔侧。原肠作用形成三胚层：夕卜胚层、中胚层、内胚层决定2.4细胞分决定2.4.1细胞分化细胞分化：在个体发育中，细胞的后代在化学组成、形态结构和功能上产生差异的过程称为细胞分化(differentiation)。其本质是基因选择性表达的结果，即基因表达调控的结果。细胞分化的基本特征：细胞形态和功能间出现稳定差异细胞生理状态发生改变细胞分化潜能逐渐变窄细胞核分化潜能保持完整单细胞有机体的细胞分化与多细胞有机体的细胞分化不同之处：前者多为适应不同的生活环境，而后者则通过细胞分化构建执行不同功能的组织与器官。多细胞有机体在其分化程序与调节机制方面显得更为复杂。分化细胞的基本特征：个体中所有不同种类的细胞的遗传背景完全一样。分化细胞彼此之间在形态、结构、功能方面的不同是由于其拥有不同的蛋白质所致。细胞分化中最显著的特点是分化状态的稳定性。虽然细胞分化是一种相对稳定和持久的过程，但是在一定的条件下，细胞分化又是可逆的。根据细胞的特化程度和分裂能力不同分类分化程度进行有丝分裂举例能力无能表皮基细胞，精原细胞、植物生长点细胞花粉母细胞和花粉之间的一系列细胞、动物精原有一定程度能细胞和精子之间的一系列细胞等。

无(动物分可逆、根、茎、叶等组织或器官中的细胞，高度分化不可逆细胞)骨骼纤维细胞、心肌细胞细胞全能性：植物细胞各种高度分化的细胞和组织都具有细胞全能性。细胞核全能性：动物细胞随分化程度的提高分化潜能逐渐变窄，但对于细胞核而言，高度分化的细胞保留着物种的全套基因，仍具有发育全能性。干细胞：具有无限的或可被延长的自我更新和分化成不同组织细胞类型的能力的细胞。按来源分：胚胎干细胞和成体干细胞(造血干细胞、间充质干细胞、表皮干细胞、神经干细胞)按功能分：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞造血干细胞多能定向干细胞单能定向干细胞成熟子代细胞髓系干细胞红系干细胞粒、单核系干细胞巨核干细胞红细胞粒细胞/单核细胞血小板淋巴系干细胞前驱B细胞前驱T细胞B细胞T细胞干细胞具有以下几个特点：干细胞本身不是终末分化细胞；干细胞能无限的分裂；干细胞分裂产生的子细胞只能在两种途径中选择其一：或保持亲代特征，仍作为干细胞；或不可逆地向终末分化。2.4.2细胞决定(celldetermination)概念：细胞在发生可识别的形态和功能变化之前，就已受到约束而向着特定方向分化，这种细胞的发育命运被稳定地确定的过程称为细胞决定。胚胎细胞分化的潜能与决定的关系：细胞决定可看作发育潜能逐渐限制的过程，决定先于分化。植物细胞：第一次细胞分裂（极性）哺乳类动物胚胎细胞：16细胞期两栖类胚胎细胞：三胚层形成（细胞空间关系的改变和微环境的差异）卵细胞质在早期胚胎细胞决定中的作用:从受精卵第一次卵裂开始，细胞核就受到内环境（即不同的卵细胞质）的影响。细胞质中决定细胞命运的特殊信号物质称为细胞质决定子（cytoplasmicdeterminants）。决定子支配着细胞分化的途径。受精卵在数次卵裂中，决定子一次次地被重新改组、分配。卵裂后，决定子的位置固定下来，并分配到不同的细胞中，子细胞便产生差别。卵细胞质的母体效应（maternal-effect）:卵母细胞中贮存的mRNA和蛋白质的分布是不均匀的，各种mRNA在细胞中都有定位分布，并随卵裂进入不同的子细胞中。细胞决定的稳定性和遗传性:细胞决定_旦发生,就沿着决定方向分化成特定细胞类型，这种分化具有稳定性和遗传性。2.4.3细胞分化中的核质关系细胞质对细胞核的作用:影响细胞核基因的表达。当鸡的红细胞与培养的人Hela细胞（去分化的癌细胞）融合后，核的体积增大20倍,染色质松散,出现RNA和DNA合成，鸡红细胞核的重新激活是由于Hela细胞的细胞质调节的结果；将培养的爪蟾肾细胞核注入蛛螺的卵母细胞内，分析蛋白质合成情况发现，原来在肾细胞中表达的基因，这时不表达，而原来不表达的基因，这时却被激活。细胞核对细胞质的作用：个体的发育受细胞核的控制。部分基因被激活,导致特异蛋白的合成,执行不同功能，引起细胞分化。生物基因组中基因分类:1.持家基因：维持细胞生存所必须的基因。2.组织专一性基因（奢侈基因）:在各种组织细胞中专一性选择表达的基因。细胞质与细胞核在细胞分化过程中具有非常密切的协调关系，未分化或已分化的核与细胞质协调而发生正常的分化,发育成正常的胚。第三章细胞工程mSMXM作外植体:离体条件下生物有机体的各部分组织、器官或细胞，统称为外植体。第一节实验室及仪黯蚯—、实验室准备室:洗涤、培养基的配置和消毒无菌操作室:超净工作台和附属设备培养室:光源、培养架、温度和湿度等控制设备鉴定实验室:显微镜、离心机、电泳仪、紫外分光光度计等细胞学和生理生化设备移栽驯化基地:温室、移栽基质、环境控制设备等准备室（洗涤区、灭菌区、储藏区、配置区）明元、通风无菌操作室（缓冲准备区、接种区）一一封闭性好，干燥清洁，保持无菌培养室——控制光照和温度，保持干燥和清洁鉴定实验室一一清洁、明亮、干燥二、仪器设备基本设备灭菌设备无菌操作设备细胞培养设备观察分析仪器设备三、培养器皿及实验用具玻璃器皿新型材料器皿金属材质用具第二节作清洗消毒灭菌无菌操作接种技术_洗涤玻璃器皿新器皿上附有游离的碱性物质。洗涤剂-清水-1%的HCI溶液-清水-蒸偕水-干燥除去残渣-洗涤剂-清水-蒸偕水-干燥洗净的玻璃器皿不应在器壁上带有水珠，否则冲洗，如果仍挂有水珠，则需要洗涤液浸泡数小时（或用去污粉擦洗）,重新清洗。塑料器皿质地软,附着力强。购买无毒并已经消毒灭菌密封包装的一次性商品，直接使用。用后立即浸入水中-2%NaOH-清水-5%盐酸-清水-蒸偕水-干燥金属器械不宜用各种洗涤液，一般用酒精擦洗,并保持干燥。不锈钢制品也可用洗涤剂洗刷，用清水冲洗干净，蒸储水冲洗1~2次，晾干（或烘干'其他用途的玻璃制品吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品：需先放入铭酸洗涤液中浸泡两小时以上，取出后经流水冲洗半小时左右，再用蒸偕水冲洗1〜2次，然后烘干或晾干。载玻片和盖玻片：洗涤时不宜用力擦洗,其洗涤方法是先用清水冲洗,然后放入铭酸洗涤液中浸泡几小时或用稀铭酸洗涤液煮沸半小时，取出后用清水冲洗干净，将其储藏在95%的酒精中。二、消毒灭菌消毒：指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法。灭菌:指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物，使之呈无菌状态。分类：物理方法：物理灭菌干热、湿热、射线处理；物理除菌过滤、离心沉淀等化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌1、干热灭菌灼烧灭菌法:利用火焰直接把微生物烧死。【适用范围】接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体等的灭菌，此法彻底可靠,灭菌迅速,【缺点】易焚毁物品，所以使用范围有限。干热空气灭菌法：利用烘箱进行烘烤灭菌的方法。【要求】即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，150°C/40min或120°C/2h,有的（芽胞杆菌）甚至160°C/90~120mino【适用范围】玻璃皿、金属用具等的灭菌。2、湿热灭菌a.巴氏消毒法：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62°C,30分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创,故名为巴氏消毒法。煮沸消毒法：直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15分钟,即可杀死细菌的全部营养和部分芽孑包。若在清水中加入1%碳酸钠或2%的石碳酸，则效果更好。此法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。间歇灭菌法:上述两种方法在常压下,只能起到消毒作用,而很难做到完全无菌。若采用间歇灭菌的方法，就能杀灭物品中所有的微生物。具体做法是:将待灭菌的物品加热至100°C,15-30分钟,杀死其中的营养体。然后冷却，放入37。。恒温箱中过夜，让残留的芽孑包萌发成营养体。第2天再重复上述步骤，三次左右,就可达到灭菌的目的。此法不需加压灭菌锅,适于推广，但操作麻烦，所需时间长。加压蒸汽灭菌法:加压蒸汽灭菌是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高由于蒸汽压的上升,水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到两个大气压时,加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到12KC。微生物（包括芽孑包）在15-20分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。高压蒸汽灭菌,是最有效的一种方法。［适用范围］布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿及某些培养用液等耐高温材料。［要求］常采用1千克/厘米2（15磅/英寸2）的蒸汽压,121°C温度下15-30分钟3、紫外线消毒紫外线作用于细胞DNA，使DNA链上相邻的唯嚏碱形成唯嚏二聚体（如胸腺唯嚏二聚体），抑制了DNA复制。另外,空气在紫外线照射下可以产生臭氧,臭氧也有—定的杀菌作用。【适用范围】紫外线透过物质的能力很差,适用于空气及物体表面的灭菌。【要求】（1）照射时间以视紫外线灯管的功率大小、被照空间及面积大小，根据灭菌效果测定结果而定；（2）各种细菌照射时间和剂量也不同。【缺点】（1）产生臭氧,污染空气,对身体有害；（2）射线照射不到的部位起不到消毒作用，故消毒时，物品不宜相互遮挡。［注意］不要在紫外线灯照射下进行4、滤过消毒一些化学成分在高温高压下会发生降解而失去或降低效能。当溶液通过滤膜后,细菌的细胞和真菌的孑包子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时,常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器或离心等方法。【适用范围】大多数培养用液，如人工合成培养液、血清、酶溶液、DNA溶液等【常用滤器】Zeiss滤器、微孔滤膜滤器及各种不同规格的一次性滤器。常用孔径0.22~0.45um滤膜过滤一般用液即可。［注意］滤器和滤膜事先经高压蒸汽灭菌。三、无菌操作培养材料的灭菌处理器具的灭菌处理超净超作台的灭菌处理无菌操作接种技术3、器具的灭菌干热灭菌:160170°C/I~2h;湿热灭菌：118kPa/20~30min;酒精灭菌：70%~75%；烧灼灭菌：4、超净操作台的消毒灭菌开关控制装置通风过滤装置照明装置紫外灭菌装置其他装置无菌操作室的灭菌：紫外灯20~30min,70%~75%酒精喷雾；超净操作台的消毒：紫外灯20~30min,70%~75%的酒精擦拭台面和器具,正常通风lOmin以上第三节培械的配■1愈伤组织缺无机营养表现症状：N——某些组织（如五叶地锦）表现花色素昔颜色；不能形成导管N、P和K——细胞过度生长，形成层组织减退S——愈伤组织非常明显褪绿Fe——细胞分裂停止B——细胞分裂停滞，细胞伸长Mg和Mn——影响细胞伸长2营养物质有机化合物氨基酸类：为组织培养提供有机氮源和一些活性成分。如：甘氨酸、水解酪蛋白、水解乳蛋白。维生素：与植物体内的各种酶的作用有关，在植物组织培养中常用B族维生素。糖类:碳源可以提供合成新化合物所需的碳骨架,为呼吸作用提供底物与能源和渗透调节作用。VB］（硫胺素）VB］在体内经硫胺素激酶催化,可与ATP作用转变成焦磷酸硫胺素（TPP）TPP是短化辅酶，催化丙酮酸或a-酮戊二酸氧化脱酸。丙酮酸经脱猿、脱氢生成乙酰辅酶A进入三短酸循环。因此VB】与糖代谢密切相关。最常用的碳源是蔗糖（分解产生葡萄糖和果糖）:为细胞提供合成新化合物的碳骨架为细胞呼吸代谢提供底物,并产生能量保持培养基的渗透压，使植物的细胞能正常吸收和代谢通过对20多种糖作为碳源对不同植物的愈伤组织形成和生长的研究表明，对多数植物组织来说蔗糖和葡萄糖是良好的碳源（吕芝香，198U一般情况下,低浓度（1.5-2.5%）的糖有利于木质部的生长；高浓度（3-4%）的糖则促进韧皮部的生长。若糖浓度居于两者之间（2.5-3.5%）,则同时对韧皮部和木质部生长都有利。肌醇（环己六醇）与糖类物质相互转化；形成植酸钙镁；形成磷脂，参与细胞膜的合成；形成果胶物质，参与细胞壁构建；促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。激素生长素类：促进细胞伸长生长和分裂、诱导愈伤组织形成、促进生根,与一定量的细胞分裂素配合可诱导不定芽的发生。细胞分裂素类:促进细胞分裂、诱导愈伤组织或器官分化不定芽、解除顶端优势而促进侧芽增殖、抑制离体组织或器官衰老等。其它生长调节剂:ABA（抑制胚胎的过早萌发,促进胚胎的成熟）；GA（打破芽的休眠）;PP333（提高成苗的质量）；油菜素内脂（促进生长,提高抗病性）；乙烯（促进细胞扩大、果实成熟和器官脱落）等细胞分裂素的生理作用促进细胞分裂和扩大胞质分裂细胞扩大诱导芽的分化生长素/细胞分裂素延缓叶片的衰老抑制核酸酶和蛋白酶的活性促进营养物质运输琼脂是一种从海藻中提取的高分子碳水化合物。在培养基中起凝固剂的作用，一般浓度为0.6%」.0%,其凝固的性能与产品质量、pH值有关。加热时间过长和温度过高均可能降低能够性能。其它活性碳（ActivatedCarbon,AC）:吸附作用,防止酚类导致的组织褐化；对一些植物的生根和形态发生和器官形成有促进作用；使用浓度为0.02%~1.0%,常用浓度为0.1%~0.5%;多胺类物质（polyamines）:促进生长和分化AgNO3：抑制乙烯的产生，一般浓度5」5mg.L-iAgNO3抗菌素：杀菌作用培养基分类根据无机盐的浓度：高无机盐含量培养基、中等无机盐含量培养基、低无机盐含量培养基和高硝态氮培养基根据培养物的培养过程:初代培养基和继代培养基根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基和生根培养基根据营养水平不同：基本培养基和完全培养基3、培养基配制为了实验的方便（不用每次都单独称量）和准确（有些成分量太小），首先把各种营养元素配成母液:大量元素（合并配制）；微量元素（合并配制）；钙盐（氯化钙）；铁盐（螯合铁）；有机成分（分别配制）；生长调节剂（分别配制\（2）微量元素母液的配制MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe）组成，微量元素用量较少，特别是CuSO4-5H2O.CoCI2-6H2O,因此在配制中分微量I、微量II配制。按照表2,表3配方，用感应量为0.0001g的分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制1L培养基,取微量I（?）ml,微量II（?）ml。（3）铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物,必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸偕水加热搅拌溶解。配制培养基时，配制1L取此液(?)ml。(4)有机母液的配制培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸偕水溶解，注意称量时用电子分析天平，并储存在棕色无菌瓶中。配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然后定容。⑸植物生长调节剂母液配制一般植物生长调节剂母液的配制的终浓度为0.2-1.0mg/ml,需要注意的是：配制生长素类，例如IAA、NAA、2,4-D、IBA,应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用lmol/L的NaOH溶解，然后用蒸储水定容到一定的浓度。以后者效果好。细胞分裂素，如KT,应先用少量95%乙醇或无水乙醇加3-4滴lmol/L的盐酸溶解，或直接用lmol/L的盐酸溶解,再用蒸偕水定容。GA3以95%酒精溶解(不耐高温，过滤灭菌)，保存在棕色试剂瓶中。注意:一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+和S042-,Ca2+、Mg24nPO4s-一起混合后，会产生沉淀，一定要充分溶解再按一定顺序放入母液中。用蒸偕水或重蒸储水配制；药品应选取等级较高的化学纯或分析纯；药品的称量及定容都要准确；先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。母液配好后贴上标签,注明名称、配制倍数、日期，放入冰箱内低温保存(4。。)，用时再按比例稀释。贮备液使用前摇动瓶子,如有沉淀、絮状物、微生物污染应停止使用。4、培养条件的选择光照的影响光周期：黑暗与光照交替的时间光量:光照强度光质：光的波长温度:一般采用25±2°C湿度:培养容器内的湿度条件；环境的湿度条件pH值：一般培养基要求5.8渗透压:调节糖浓度气体影响：固体培养和液体培养第四章粗物组织和或培养-植物,陷全能性的晚高等植物的器官和组织可以不断分割至单个细胞。个体或组织、器官已经分化的细胞在适宜的培养条件下具有再生成完整个体的遗传潜能，称为植物细胞全能性(Totipotency)。植物体细胞和生殖细胞均具有全能性实现植物细胞的全能性需要一定的条件需要保持植物细胞结构和遗传信息的完整性高度退化的细胞不具有细胞全能性二植物细胞分化所谓细胞分化(differentiation):在个体发育中，细胞的后代在开，态、结构和功能上发生差异的过程。植物细胞分化的现象:藻类单细胞植物体无分化单细胞生物时间上的分化多细胞生物的分化细胞分化的本质从分化的遗传控制角度讲，细胞分化是各个处于不同时空条件下的细胞，基因表达与修饰差异的反应,所以，分化也可以说是相同基因型的细胞由于基因选择性表达所反应的不同表现型。三、离体条件下植物细陷的硼脱分化(Dedifferentiation):已分化的细胞失去其分化特征,回复到分生组织状态或胚性细胞状态的过程，称为脱分化。再分化(Redifferentiation):已脱分化后的组织或细胞在一定的条件下，重新恢复细胞分化能力，经过器官发生途径或体细胞胚发生途径，进一步发育成完整植株的过程,称为细胞的再分化。细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现(一)细胞脱分化离体条件下,脱分化过程发生在第一次有丝分裂之前（对单细胞来说\静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。1、细胞脱分化的三个阶段启动阶段:表现为细胞质增生,并开始向细胞中央伸出细胞质丝,液泡蛋白体出现;演变阶段：细胞核开始向中央移动,质体演变成原质体；终结阶段，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。2、影响细胞脱分化的因素a、生理或机械隔离损伤刺激损伤导致外植体产生生化反应,如气体交换律变化,呼吸活性的变化、酶活性的增加等。马铃薯、胡萝卜和菊苣等储藏组织受伤后在20〜24h可达到最大的呼吸速度,故有人将其称为"损伤呼吸”。b、培养细胞的异质性脱分化的实质是使G0期细胞回复到分裂周期的过程。根据细胞类型不同从强到弱：营养生长中心＞形成层＞薄壁组织＞厚壁组织＞特化细胞根据细胞所处的组织不同从强到弱：顶端分生组织＞居间分生组织＞侧生分生组织＞薄壁组织＞厚角组织＞输导组织＞厚壁组织c、生长调节剂的影响生长素诱导表达相关蛋白，通过信号转导诱导其它蛋白的活性。如：2,4-D诱导表达的基因par在细胞从G0期转入S期的早期启动中具有功能性作用;NAA诱导PSK基因表达，PSK河能介导了与生长素和细胞分裂素密切相关的信号转导途径O激素对细胞脱分化的调控涉及到复杂的信号转导。激素在植物生长发育中具有重要的调控作用,也是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素，其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。此外,在有些试验中也显示，GA3、ABA、乙烯等也在细胞分化中起到一定的调节作用。d、光线的影响弱光下切取外植体，进行暗培养,有利于细胞脱分化。外植体在DNA复制开始后,对光线表现则不敏感；在后续的培养期间，光线对生长也很少有刺激作用。3、细胞分裂与愈伤组织形成细胞脱分化是细胞状态的改变,成功的脱分化必然导致细胞分裂。愈伤组织：植物细胞经过脱分化和细胞增殖形成的无特定结构和功能、无明显极性、无次生细胞壁和胞间连丝的多细胞团，称为愈伤组织(caHus/Calli)。愈伤组织培养过程：诱导期：细胞分裂的准备期；分裂期：开始分裂并不断增生子细胞；分化期：愈伤组织形成到器官发生时期。外植体由原来的静止状态经过诱导期的分裂准备之后进入分裂高峰,回复为分生状态,这个过程即为脱分化。愈伤组织的形成是脱分化的细胞重新进入活跃分裂的结果,但不是脱分化过程。对于单个细胞而言，分化细胞启动分裂发生在细胞完全脱分化之后。特点:色泽鲜亮，结构致密，表面有突起根据愈伤组织的形态特征,可以调整激素的配方:鲜嫩、致密和分生能力强的愈伤组织,说明激素培养条件合适；如果生长过于旺盛,质地松软,色泽亮丽，则可以降低生长素的水平；如果生长缓慢,结构过密或过于松散,颜色暗淡/变黄，则可以考虑增加生长素的浓度。愈伤组织类型I型：结构紧密、坚硬,不易分开,表面有条状突起；II型：介于I型和in型之间，结构松散、易碎，有明显的颗粒状，白色或淡黄色；in型：结构松软,水渍状,白色透明或半透明。长期培养物形态发生潜力丧失的原因解释这种现象有三种假说:遗传说：在培养细胞中的核的特性发生了改变，即细胞核内的遗传物质在培养继代过程中由于变异等原因而发生了改变或是突变,导致形态不能发生。生理说：随着培养继代的反复进行,被培养的组织或细胞中的内源激素平衡关系可能会发生改变,从而导致形态不能发生。竞争说:在复杂的多细胞外植体中,只有少数细胞能够产生胚性细胞团,其余细胞都无法表达其全能性,如果非胚性的细胞类型在培养基中具有生长上的选择优势,在反复的继代培养中，非胚性细胞的群体将会逐步增大，而胚性细胞则逐渐减少，到了_定时期之后，在培养物中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢复它们的胚胎发生能力就不可能了。注意:1、对愈伤组织形成过程的时期的划分并不是绝对的，实际上分裂期和形成期往往可以出现在同_块组织上;2、并不是所有的外植体细胞脱分化后都必然形成愈伤组织，一些外植体的细胞脱分化后可直接形成胚性细胞进而形成体细胞胚03、理论上愈伤组织是可以无限制继代的，但随着继代次数的增加，形态发生的能力将逐渐丧失。离体培养条件下没有经过受精作用，但经历了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（经历球形胚、心形胚、鱼雷形胚和具子叶的胚轴阶段），统称为体细胞胚或胚状体。（二）培养细胞的再分化脱分化后的分生细胞在特定条件（离体培养）下，重新恢复细胞分化的能力（形成愈伤组织或体细胞胚），并（愈伤组织）经历器官发生形成单极性的芽或根,或经历胚胎发生形成双极性的胚状体（体细胞胚直接发育成新的植物个体），进一步发育成完整生物体，这一个过程称为细胞再分化。（书P61图4-5）1、再分化过程愈伤组织再分化过程包括细胞分化、组织分化和器官分化递进进行，最后再生成完整植株。细胞分化：细胞壁变厚、酶水平的变化、细胞机能分化等；组织分化：常见的是微管组织的分化；器官分化：又称器官发生,分化的器官中最主要的是茎和根；植株再生：体细胞胚胎发生和器官发生2、细胞分化与极性的建立在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性（指植物的器官组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异）建立的标志。极性建立后，生长素按极性方向流动,导致维管成分的产生。3、影响细胞再分化的因素（1）激素在细胞分化中的调控作用:大量的实验结果表明：大多数植物组织或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理论。即：生长素与细胞分裂素的比例小时则产生苗，比例大时则生根,而两种激素的比例适中时，则产生无结构的愈伤组织。TE细胞分化:作为维管系统的主要成分,管状分子(trachearyelements,TEs)在维管系统的形成中具有中心作用。在植物系统发育条件下,TEs由根和芽的原形成层或次生形成层细胞分化形成。在离体培养条件下，TEs则由愈伤组织薄壁细胞分化