噬菌体污染防治课件

TheGangesinVaranasiTheTajMahalinAgraseenfromthebanksofriverYamuna恒河亚穆纳河1FrederickWilliamTwort(1877-1950)Félixd'Herelle（1873-1949）2λphage-Lysogen

T2phageT4phage(169to170kbp,200nmlong)T7phageT12phageR17phageM13phageMS2phage(23-25nminsize)G4phageP1phageP2phageP4phagePhiX174phageN4phageΦ6phageΦ29phage186phageBacteriophagesthatareextensivelystudied：分裂细菌细胞改造做基因工程载体;噬菌体表面展示技术噬菌体双报告基因的插入……噬菌体的应用But…3病毒(Virus)病毒：病毒是一类超显微非细胞生物，每一种病毒只含一种核酸，它们只能在活细胞内营专性寄生。靠其宿主代谢补充，协助来复制核酸合成蛋白质等组分，然后再进行装配增殖，在离体条件下，能以无生命的化学大分子状态长期存在并保持其侵染活性。5WhybeginningwithVirus?植物病毒真菌病毒噬菌体动物病毒病毒昆虫病毒6噬菌体档案7噬菌体（Bacteriophage）噬菌体：是一类侵害细菌的病毒，又称细菌病毒(bacterialvirus)。英文名称为bacteriophage，简称phage，来源于希腊文"phagos"，是“吞噬”的意思。T系噬菌体：七种烈性的大肠杆菌噬菌体T1－T7。8噬菌体个体小，可通过除菌滤器A、大肠杆菌噬菌体(65×95nm)B、腺病毒(70nm)D、乙脑病毒(40nm)E、蛋白分子(10nm

)F、流感病毒(100nm)G、烟草花叶病毒C、脊髓灰质炎病毒(30nm)葡萄球菌(1000nm）牛痘病毒300×250nmABCDEFG立克次体450nm衣原体390nm10烈性噬菌体的繁殖12噬菌体的危害14噬菌体的危害利用细菌或放线菌进行的发酵容易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，且较难防治，对发酵生产有很大的威胁。一旦发生噬菌体污染，会导致发酵异常、倒罐,使工业生产遭到严重损失。15T1-Phage污染对公司生产的影响对有可能被污染的5000个以上的制品及受托相关产品进行了T1噬菌体的PCR检测。对于T1噬菌体PCR检测结果为高危险水平的在库品及出荷品进行再制造和替换，并对相关制品和菌体进行销毁。基质DNA以大肠杆菌为原料的产品酶制品感受态细胞受托及其他～650种～50种（相关Kit数百种）～30种此次污染事件应对：16本社およびClontechに謝罪状17噬菌体防治18噬菌斑阴性样品阳性样品20T4噬菌体感染大肠杆菌的电镜照片噬菌体污染或溶源菌裂解的鉴定方法（1）在光学显微镜下可见：细胞团、脂肪滴、线状的脏物、非棒状细胞。（2）噬菌斑检测。（3）PCR扩增。21B103C-P2大肠杆菌操作及灭废菌专门房间房间号操作内容使用部门转化集菌菌体破碎质粒提取菌液培养灭废菌A209●●●●●开发受托一部二部B103●●●●●开发受托二部四部五部B115F●开发受托二部四部五部C栋P2●●●●●●一部二部B115FA20923使用抗噬菌体的菌株菌株名称菌株来源已更换该菌株的重组体EPI300T1REPICENTRE4Mach1Invitrogen0NovaBlueT1RNovagen0JM109T1RTBD构建3HST08T1RTBD构建0目前共有48个重组体酶需要进行更换宿主的研讨；其中7种更换完毕已能稳定生产。公司的日常转化已全部使用JM109T1R和HST08T1R进行。24消除潜在的污染隐患-1涉及菌体相关的操作要尽可能在生物安全柜中进行；在菌体培养过程中，尽量不要打开瓶口。如果实在需要打开瓶口的话，必需在无菌的环境下操作。生物安全柜和超净台应注意清洁和消毒；每年更换HEPA过滤膜。26使用胶头、移液器、电动移液器吸取溶液后，不能水平放置，以防液体进入。一旦液体进入要及时更换滤膜，并做好消毒措施。消除潜在的污染隐患-227消除潜在的污染隐患-3普通大肠杆菌的转化及划线后平板建议用石蜡膜完全密封后培养和放置。

28消除潜在的污染隐患-5菌体相关垃圾处理：生物安全柜或处理菌体的超净台应配备密封垃圾桶，以防止污染源外泄；带有菌体的垃圾要做到当日灭菌；如果当日不能灭菌，应使用垃圾袋密封后放置。30消除潜在的污染隐患-6分光光度计周围：菌体相关的废液建议收集到专门密闭容器，每日灭菌；盛放过菌液的比色皿应注意清洗，清洗液同上处理。31消除潜在的污染隐患-7高压灭菌后的枪头，务必烘干使用32消除潜在的污染隐患-8玻璃器皿特别是菌体培养用器具使用前用铝箔包裹后，在180℃干热灭菌。33消除潜在的污染隐患-9培养装置应经常清洗消毒；水浴摇床中的水要经常更换，长时间不用要将水排空，擦拭干净放置。34消除潜在的污染隐患-10在培养时最好使用无菌的棉塞（不要使用铝箔覆盖培养瓶）；不要使用潮湿或脏的瓶塞。灭菌时培养时35消除潜在的污染隐患-11接触菌体频率高，空隙多容易隐匿菌体的器具要经常清洗消毒。StandsCentrifuge&it’srotor36消除潜在的污染隐患-12脏的移液器反复使用的电击槽与噬菌体污染的培养液接触过的电极或buffer37噬菌体相关消毒及灭菌方法38物理因素对病毒的影响温度:大多数病毒耐冷不耐热。反复冻融可致许多病毒灭活，不同病毒对热的耐受性有很大不同，一般包膜病毒比无包膜病毒更不耐热，包膜病毒56degrees可迅速灭活。pH:多数病毒在pH6~9范围内比较稳定，在pH5.0以下或PH9.0以上迅速灭活。射线:γ射线、x射线及紫外线都能灭活病毒。高压蒸汽灭菌干热灭菌灼烧碱性pH溶液处理UV照射灭菌噬菌体污染的消除办法39化学因素对病毒的影响脂溶剂：对包膜病毒有作用酚类及醛类酚及其衍生物：为蛋白质变性剂，能破坏病毒衣壳蛋白，故可作为病毒消毒剂。氧化剂、卤素及其化合物：70％的甲醇及乙醇均可使多数病毒灭活。过氧乙酸可使乙肝病毒灭活。噬菌体污染的消除办法甲醛溶液处理甲醛蒸汽熏蒸O3熏蒸二氧化氯熏蒸二氧化氯溶液处理40普通30W直管型紫外线灯，辐射强度(垂直1m处)应≥70μW/cm2。

一般而言，即使是最顽强的细菌与病毒，在30,000μW.sec/cm2的照射剂量内都会无所遁形。

紫外线照射灭菌紫外线杀菌就是通过紫外线的照射，破坏及改变微生物的DNA结构，使微生物当即死亡或不能繁殖后代，达到杀菌的目的。真正具有杀菌作用的是UVC紫外线（254nm）

紫外线灯应该照射多长时间？剂量(μW·s/cm2)＝强度(μW/cm2)×时间(s)

每一种微生物都有其特定紫外线杀灭剂量标准。正常情况下，生物安全柜每次使用完，打开紫外灯，保持风机继续工作30min；如果发生了噬菌体污染，可用紫外灯过夜杀菌。41穿透力强伤害小穿透力弱伤害大可以穿透大部分透明的玻璃以及塑料超过98%能穿透臭氧层和云层到达地球表面波长较短的部分会被透明玻璃吸收大部分被臭氧层吸收，不足2%能到达地球表面无法穿透大部分的透明玻璃及塑料

几乎被臭氧层

完全吸收紫外线杀菌安全吗？42选购紫外线灯管时注意：选择石英管，发光谱线254nm的。石英灯管使用一段时间后会逐渐老化，紫外线照射强度会发生衰退，为达到彻底消毒的效果，应定期检查更换石英灯。紫外线只能沿直线传播，穿透能力弱，消毒时尽量应使消毒部位充分暴露于紫外线下，定期擦拭灯管，以免影响紫外线穿透率及照射强度。4.紫外消毒后的微生物易发生光复活，在适宜的环境下增殖。因此应与化学消毒剂（氯、过氧乙酸、臭氧等）配合使用联合消毒。

紫外线杀菌的注意事项43臭氧杀菌臭氧作为一种绿色消毒剂，对大肠杆菌、乙肝病毒、感冒病毒、腐菌、霉菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等具有极强的灭活效果，其灭菌速度是紫外线的3000倍。

臭氧（O3）>次氯酸（HCLO）>二氧化氯（CLO2）>银离子（Ag+）>次氯酸根（CLO）>高铁酸盐（Fe3+）>氯胺（NHCl3）。臭氧安全吗？臭氧的杀灭效果？活人体在1hr下就陷入生命危险状态50ppm引起强烈咳嗽，允许接触时间为20分钟。

4-10ppm

引起人员咳嗽，允许接触时间为1小时。1-4ppm允许接触的时间是1.5小时，时间长了会感到口干等不适

0.5-1ppm

影响及反应臭氧浓度臭氧的暴露对人体安全的影响国际上臭氧容许浓度的基准限制值0.15ppm/NA0.1ppm/NA0.1ppm/8hr0.1ppm/10hr容许浓度/接触时间中国日本美国国际臭氧协会

一般森林地区臭氧浓度即可达到0.1ppm

臭氧的半衰期为20-50分钟，且最终的分解物为氧气，所以对人员及物品不会有残留污染。

44公司目前主要消毒房间一览表房间号房间用途消毒方法备注紫外线臭氧二氧化氯A122病毒相关实验，细胞培养

●

●保存有细胞株

A209菌液培养，超声破碎，离心，接种，转化

●有生物安全柜、纯水装置B103菌液培养，涂板，检菌，集菌，提质粒，转化

●●有生物安全柜、培养箱

C102主培养室

●●●C103种培养室

●●●有生物安全柜、培养箱