纯化策略纯化前需考虑因素

纯化策介纯化前需考虑的因纯化策纯化实如何取得预期的结果总介纯化前需考虑的因纯化策纯化实如何取得预期的结果总

Gelfiltration Gel 子

Ion离子交O

亲 如何运用各种层析来实现成功的分离纯介纯化前需考虑的因纯化策纯化实如何取得预期的结果总Maintainedbiologicalactivity活Sufficientpurity ty纯度&规Goodeconomy经济质功质功能研免疫抗结构研治疗用蛋g一般原Extremelyhigh极 High invivostudiesPK/PD动物实验x-raystudiesN-terminalsequencingofanunknownproteinN端methodsantigenformonoclonalantibodyproduction

样品来or核or外胞破碎性目标蛋白的性等电分子稳定pH/salt,

胞胞~10000细胞间~1000胞~2000 Outermembrane InnerDeterminationofasuitableammoniumsulfateconcentrationandpHscreeningrangeforHICpH对的稳定盐（离子强度添加剂、pHActivityAssayspecificArapidandreliableassayforthePuritydeterminatione.g.SDS电泳HPLCe.g.colorimetricmethod主要杂质的性质及检测方中其中其他蛋

用IgSelect分析人中IgG的含量，能结合有人IgG的亚介纯化前需考虑的因纯化策纯化实如何取得预期的结果总achievefinalpurity,removetraceimpurities,structuralvariants,aggregatesetc.removeisolateproduct,策略1：纯化三步曲粗 精Capture浓缩，稳定蛋 速 载Polishing分辨 速 载Threephasestrategy离交疏亲分子反

粗 中度纯 精301510SOURCE™15SOURCE30Sepharose™301510SOURCE™15SOURCE30Sepharose™34Superdex34Sepharose90909090Minimizelossofmaterialineach Reducenumberof%%process 纯化步

95%yield/step90%yield/step85%yield/step70%yield/将分离机理互补的技术进行组合交替运用不同的层析方(e.g.IEX,HICandSEC)减少不同层析技术间的样品处(e.g浓缩置尽量简(NH4(NH4CombineCombinetechniques使用不同层析技minimizedsamplehandling尽量避免样品处理步

线性流速:cm/h停留时间:

ml/minxcmcmxScale-up:从到工业生产规ÄKTA™ 9.4-litre

280

23.6-ml

A280400-倍400-倍放0 (column

(column10mm10mmFineLINE同一ÄKTA平台上的直接线性放介纯化前需考虑的因纯化策纯化实如何取得预期的结果总 蛋Native天然和重

Non-tagged 蛋

Multi-Step表达的蛋 SimpleAffinity+GelHigh去乙酰氧化头孢菌素C合成

快速探索填料快速探索梯度

快速探索填料快速探索梯度

5-10mgDAOCS，纯度足够进行在粗纯时使用中性pH34用Superdex75prepgrade术进行精细纯化(3->2在缓冲液中加工艺设计重点在所有缓冲液中DTT使所有半胱氨酸残基保持还原状态,防止氧化加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白酶用SDS检查每一个组份中终产品通过酶活测定来确认生物活沉淀DNA来源:从S.Clavuligerus克隆得到的DAOCS和在大肠杆菌的胞浆中扩pI4.8阴离子交换考虑到DACOS蛋白的酸性pIpH的选择(关键参数粗纯—在ÄKTA阴离子交换层析柱HiPrep16/10Q线性梯 阶段梯 优化梯

00 200

200

20

20可以跟IEX蛋白质疏水性质很难:筛选适合填 RESOURCE 异丙 醚RESOURCE 苯Samplevol:10 2Mammonium1mM1mMDTT, bufferAammoniumFlow 3 分离机理最适合分离二聚体

粗

0

HiLoad™16/60Superdex™75prep

SOURCE15ISO16mm,500 HiPrep™16/10Q

ml工粗粗中度中度纯精精细纯

优化好的纯化流样品预处HiPrep™16/10QSOURCE™浓HiLoad™16/60Superdex™75prepgrade

时60分30分40分120分80分(NH4MostMost通用的工艺路线 纯化倍 QQFastPhenylSepharoseHighprepgrade

Capturewithstepgradient;730mgoftotalproteinapplied83mghomogenousproteinJ.Biol.Chem.271,28348-(NH(NH4Hydrophobic&Hydrophobic&membrane溶溶(6M稀释复E.coliE.coliInclusionbodies包含WashedpelletRenaturedrhGM-CSF复PhenylSepharose™6FastFlow(highQSepharoseFastSuperdex™75prep举例rhGM-CSF的纯

Step1.PhenylSepharose™(highStep1.PhenylSepharose™(high

vol

Endotoxin

DNA

Specificactivityoffinalproduct:ca.3.3x10e7Native

Non-tagged 蛋

Multi-StepSimpleAffinity+GelHigh带的融合表达的重组蛋

+++Cleavageoftennot+Many+-Inclusion-Non-specific+Increasessolubility&+Specific--Cleavageoften-Binding++Increasessolubility&+Specific--CleavageoftenStreptag++Cleavageoftennot+Veryspecific--NotmanyreferencesAffinity+gel快速去除体和置换缓冲Affinity+Affinity+affinity+gel运用两种功能，同时具备可溶性和经济StreptagStreptagForFortwoACstepsincheckcompatibilityofstartande.g.,StreptagIItaggedproteininpresenceofimidazole

E2 Rn E2 E2 Rn Protein:StreptagII-ProteinX-(His)6Mr≈15Sample:15mlE.coliSystem:Stockholm,MBPTrap™HPHiLoad™16/60Superdex™200pg介纯化前需考虑的因纯化策纯化实如何取得预期的结果总高选高选择低选择峰分离的量高选择性可以达到基线分高选择性可以弥补低的柱高柱高柱低柱峰宽的量柱效越越高柱效需要良好的柱填装技高柱效有时可弥补选择性不选择性和柱效，哪个还可以改!SeparationtechnologiesChromatographymediascreenSeparationconditionsscreenhighlower

O 712 36100,0001,000,000SuperdexSephacryl™S-100SephacrylS-200SephacrylS-300SephacrylS-400Superdex75分离范围3,000~70,000Superdex200分离范围10,000~600,000pHanionpHchargeonpHchargeoncationcationpHv.slowefficiencyRs

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