论文答辩模板胰腺炎中细胞凋亡的调控课件

汇报者：组员：在蛙皮素诱导大鼠的急性胰腺炎中GRP78和XIAP与细胞凋亡的关系汇报者：在蛙皮素诱导大鼠的急性胰腺炎中GRP78和XI文献来源(SourcesofLiterature)文献来源(SourcesofLiterature)内容目录(TableofContents)

1背景(Introduction)

2

研究目的(AimofResearch)

3材料和方法(Materialsandmethods)

4结果(Results)

5讨论(Discussion)内容目录(TableofContents)1背景(Introduction)急性胰腺炎(AP)是胰腺的一种炎症性疾病，其发病率和死亡率相当高，但是至今对其的发病机制仍未完全清楚。近年来一些研究表明胰腺腺泡细胞的死亡包括坏死和凋亡两种，而且其严重程度与细胞坏死的程度直接相关，与细胞凋亡的程度呈负相关。细胞凋亡的主要途径中通过激活凋亡蛋白酶(caspases)，其特异水解一套蛋白底物,从而导致细胞凋亡。细胞内caspases与其抑制剂总是共存的，以免Caspases酶原被意外激活，对正常细胞造成损伤。XIAP和GRP78就是例子。背景(Introduction)急性胰腺炎(AP)是胰腺的一背景(Introduction)X连锁凋亡抑制蛋白(X-linkedinhibitorofapoptosisprotein，XIAP)是新发现的一个IAP家族中的主要成员，是IAP家族中最强的凋亡抑制因子，它可直接抑制caspases并可多途径调节细胞凋亡。葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulatedprotein78，GRP78)，又名免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)或人70kDa热休克蛋白5(HSPA5)，不仅是主要的分子伴侣，也具有抗凋亡的作用。背景(Introduction)X连锁凋亡抑制蛋白(X-li研究目的(AimofResearch)本实验主要研究GRP78和XIAP在蛙皮素诱导的急性胰腺炎中参与细胞凋亡调控的可能作用。研究目的(AimofResearch)本实验主要研究GR材料和方法(Materialsandmethods)雄性Wistar大鼠36只，体重在200-220g蛙皮素诱导胰腺炎组盐水对照组6只按取样时间随机24h6只6h6只12h6只3h6只1h6只胰腺组织水肿的评估血清淀粉酶和脂肪酶的测定胰腺组织学检查凋亡指数的测定GRP78、XIAP、caspase-3、

caspase-7、caspase-9的表达测定蛙皮素，50μg/kg，腹腔注射，共4次，每次间隔1h盐水，同理最后一次注射后，按取样时间处死大鼠，取出新鲜胰腺、抽取下腔静脉血材料和方法(Materialsandmethods)雄性

材料和方法(Materialsandmethods)

材料和方法(Materialsandmethods)材料和方法(Materialsandmethods)

材料和方法(Materialsandmethods)

材料和方法(Materialsandmethods)胰腺的组织学检查方法：按常规组织学检查，10%福尔马林固定，石蜡包埋后做成4μm的切片，然后进行HE染色。凋亡指数的测定方法：使用原位细胞死亡检测试剂盒进行检测细胞凋亡。将之前准备好的组织学切片放在37℃的TUNEL反应混合物中孵育1小时。最后，通过荧光显微镜（波长为450-500nm）进行分析，使用图像采集系统获取图像。TUNEL阳性细胞显示明亮的绿色荧光。凋亡指数(AI)：对每张片随机选取10个高倍镜视野，并计算每个视野的TUNEL阳性细胞的百分比，求10次的平均值所得。材料和方法(Materialsandmethods)胰腺实时定量逆转录-聚合酶链反应方法：取每只大鼠的新鲜胰腺组织50-80mg，用TRIzol分离出总的RNA。取总的RNA5μg进行反转录，反转录后的产物取1μg在引物的作用下进行PCR。引物序列如下：GRP78:5'-GAAACTGCCGAGGCGTAT-3'/5'-ATGTTCTTCTCTCCCTCTCTCTTA-3';Caspase-3:5'-CGGACCTGTGGACCTGAAA-3'/5'-GGGTGCGGTAGAGTAAGC-3';Caspase-7:5'-TCTATGTGCCCCGTCAGTA-3'/5'-ACATCCATACCTGTCGCTTT-3';Caspase-9:5'-ACGACCTGACTGCTAAGAAA-3'/5'-AGCCATGAGAGAGGATGAC-3';XIAP:5'-TGTGAGTGCTCAGAAAGATAAT-3'/5'-TGCTTCTGCACACTGTTTACA-3';β-actin:5'-CGTGAAAAGATGACCCAGAT-3'/5'-ACCCTCATAGATGGGCACA-3'材料和方法(Materialsandmethods)实时定量逆转录-聚合酶链反应材料和方法(MaterialsWesternblot检测提取总蛋白：用二辛可宁酸性蛋白检测试剂盒测定其浓度。电泳：将其分成每20μg一份，经过12%的钠十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳。转膜：转移到聚偏氟乙烯二氟化膜上。

封闭：5%的乳粉溶液将膜封闭2h。

一抗孵育：实验组加入多克隆GRP78和单克隆XIAP（1:1000的稀释液），对照组加入单克隆兔抗大鼠β-actin抗体（1:1000的稀释液）孵育过夜。二抗孵育：洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（1:5000的稀释液）在室温孵育2h。蛋白质检测：通过仪器检测生成可视图像。材料和方法(Materialsandmethods)Westernblot检测材料和方法(Materials1、蛙皮素诱导胰腺炎的情况结果显示：与对照组相比，实验组在3h时血清淀粉酶及脂肪酶均有明显的升高，并分别在6h和12h达到高峰，24h时趋于正常。(P<0.05)结果(Results)血清淀粉酶血清脂肪酶1、蛙皮素诱导胰腺炎的情况结果(Results)血清淀粉酶血2、胰腺水肿的评估结果显示：与对照组相比，实验组在1h时的组织含水量有明显的升高，在6h时达到高峰，此后逐渐下降，24h时趋于正常。(P<0.05)结果(Results)2、胰腺水肿的评估结果(Results)3、胰腺组织学检查结果(Results)结果显示：与对照组相比，胰腺炎的胰腺组织表现的是间质水肿、空泡细胞以及炎症细胞的渗透。6h时间质水肿和空泡细胞最明显；12h时间质中炎性渗出最明显。3、胰腺组织学检查结果(Results)结果显示：与对照组相结果(Results)TUNEL染色结果(Results)TUNEL染色4、凋亡指数(AI)的测定结果显示：与对照组相比，实验组AI在3h时有显著的升高，在6h时达高峰，之后逐渐下降，但24h时仍有显著升高。(P<0.05)结果(Results)4、凋亡指数(AI)的测定结果(Results)5、急性胰腺炎时caspases的基因表达结果显示：与对照组相比，实验组中caspase-3，-7，-9的mRNA水平在1h时均有显著升高，在6h时达到高峰，之后逐渐下降，24h时趋于正常。(P<0.05)结果(Results)5、急性胰腺炎时caspases的基因表达结果(Result6、急性胰腺炎时GRP78的表达结果显示：与对照组相比，实验组中GRP78mRNA的水平在1h时急剧降低，在3h时达到最低，之后逐渐升高，24h趋于正常水平。(P<0.05)结果(Results)6、急性胰腺炎时GRP78的表达结果(Results)7、急性胰腺炎时XIAP的表达结果显示：与对照组相比，实验组中XIAPmRNA的水平在3h时明显降低，之后一直到24h均处于低水平。(P<0.05)结果(Results)7、急性胰腺炎时XIAP的表达结果(Results)GRP78与凋亡指数及caspase-3，-7，-9呈负相关。

(Pearson相关系数分别为-0.757，-0.669，-0.871，-0.704，

P<0.05)XIAP与凋亡指数及caspase-3，-7，-9也呈负相关。(Pearson相关系数分别为-0.911，-0.950，-0.827，-0.855，P<0.05)结果(Results)GRP78与凋亡指数及caspase-3，-7，-9呈负相关1、在蛙皮素诱导大鼠的急性胰腺炎中，GRP78和XIAP均降低，且与凋亡指数呈负相关，说明GRP78和XIAP与胰腺腺泡细胞的凋亡有关，而且起着抗凋亡的作用。2、GRP78和XIAP的表达与caspase基因的表达和凋亡指数(AI)均呈负相关，说明GRP78和XIAP在蛙皮素诱导大鼠的急性胰腺炎中负性调控caspase的激活，从而促进细胞凋亡。3、

从结果看在蛙皮素诱导大鼠的急性胰腺炎中GRP78和XIAP抗凋亡的作用很明显，但这两者之间是否存在着相互作用关系，需要进一步研究证实。讨论(Discussion)1、在蛙皮素诱导大鼠的急性胰腺炎中，GRP78和XIAP均降大鼠胰腺组织水肿的评估与其他检测是怎么分配的？问题(Questions)大鼠胰腺组织水肿的评估与其他检测是怎么分配的？问题(Ques论文答辩模板胰腺炎中细胞凋亡的调控课件汇报者：组员：在蛙皮素诱导大鼠的急性胰腺炎中GRP78和XIAP与细胞凋亡的关系汇报者：在蛙皮素诱导大鼠的急性胰腺炎中GRP78和XI文献来源(SourcesofLiterature)文献来源(SourcesofLiterature)内容目录(TableofContents)

1背景(Introduction)

2

研究目的(AimofResearch)

3材料和方法(Materialsandmethods)

4结果(Results)

5讨论(Discussion)内容目录(TableofContents)1背景(Introduction)急性胰腺炎(AP)是胰腺的一种炎症性疾病，其发病率和死亡率相当高，但是至今对其的发病机制仍未完全清楚。近年来一些研究表明胰腺腺泡细胞的死亡包括坏死和凋亡两种，而且其严重程度与细胞坏死的程度直接相关，与细胞凋亡的程度呈负相关。细胞凋亡的主要途径中通过激活凋亡蛋白酶(caspases)，其特异水解一套蛋白底物,从而导致细胞凋亡。细胞内caspases与其抑制剂总是共存的，以免Caspases酶原被意外激活，对正常细胞造成损伤。XIAP和GRP78就是例子。背景(Introduction)急性胰腺炎(AP)是胰腺的一背景(Introduction)X连锁凋亡抑制蛋白(X-linkedinhibitorofapoptosisprotein，XIAP)是新发现的一个IAP家族中的主要成员，是IAP家族中最强的凋亡抑制因子，它可直接抑制caspases并可多途径调节细胞凋亡。葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulatedprotein78，GRP78)，又名免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)或人70kDa热休克蛋白5(HSPA5)，不仅是主要的分子伴侣，也具有抗凋亡的作用。背景(Introduction)X连锁凋亡抑制蛋白(X-li研究目的(AimofResearch)本实验主要研究GRP78和XIAP在蛙皮素诱导的急性胰腺炎中参与细胞凋亡调控的可能作用。研究目的(AimofResearch)本实验主要研究GR材料和方法(Materialsandmethods)雄性Wistar大鼠36只，体重在200-220g蛙皮素诱导胰腺炎组盐水对照组6只按取样时间随机24h6只6h6只12h6只3h6只1h6只胰腺组织水肿的评估血清淀粉酶和脂肪酶的测定胰腺组织学检查凋亡指数的测定GRP78、XIAP、caspase-3、

caspase-7、caspase-9的表达测定蛙皮素，50μg/kg，腹腔注射，共4次，每次间隔1h盐水，同理最后一次注射后，按取样时间处死大鼠，取出新鲜胰腺、抽取下腔静脉血材料和方法(Materialsandmethods)雄性

材料和方法(Materialsandmethods)

材料和方法(Materialsandmethods)材料和方法(Materialsandmethods)

材料和方法(Materialsandmethods)

材料和方法(Materialsandmethods)胰腺的组织学检查方法：按常规组织学检查，10%福尔马林固定，石蜡包埋后做成4μm的切片，然后进行HE染色。凋亡指数的测定方法：使用原位细胞死亡检测试剂盒进行检测细胞凋亡。将之前准备好的组织学切片放在37℃的TUNEL反应混合物中孵育1小时。最后，通过荧光显微镜（波长为450-500nm）进行分析，使用图像采集系统获取图像。TUNEL阳性细胞显示明亮的绿色荧光。凋亡指数(AI)：对每张片随机选取10个高倍镜视野，并计算每个视野的TUNEL阳性细胞的百分比，求10次的平均值所得。材料和方法(Materialsandmethods)胰腺实时定量逆转录-聚合酶链反应方法：取每只大鼠的新鲜胰腺组织50-80mg，用TRIzol分离出总的RNA。取总的RNA5μg进行反转录，反转录后的产物取1μg在引物的作用下进行PCR。引物序列如下：GRP78:5'-GAAACTGCCGAGGCGTAT-3'/5'-ATGTTCTTCTCTCCCTCTCTCTTA-3';Caspase-3:5'-CGGACCTGTGGACCTGAAA-3'/5'-GGGTGCGGTAGAGTAAGC-3';Caspase-7:5'-TCTATGTGCCCCGTCAGTA-3'/5'-ACATCCATACCTGTCGCTTT-3';Caspase-9:5'-ACGACCTGACTGCTAAGAAA-3'/5'-AGCCATGAGAGAGGATGAC-3';XIAP:5'-TGTGAGTGCTCAGAAAGATAAT-3'/5'-TGCTTCTGCACACTGTTTACA-3';β-actin:5'-CGTGAAAAGATGACCCAGAT-3'/5'-ACCCTCATAGATGGGCACA-3'材料和方法(Materialsandmethods)实时定量逆转录-聚合酶链反应材料和方法(MaterialsWesternblot检测提取总蛋白：用二辛可宁酸性蛋白检测试剂盒测定其浓度。电泳：将其分成每20μg一份，经过12%的钠十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳。转膜：转移到聚偏氟乙烯二氟化膜上。

封闭：5%的乳粉溶液将膜封闭2h。

一抗孵育：实验组加入多克隆GRP78和单克隆XIAP（1:1000的稀释液），对照组加入单克隆兔抗大鼠β-actin抗体（1:1000的稀释液）孵育过夜。二抗孵育：洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（1:5000的稀释液）在室温孵育2h。蛋白质检测：通过仪器检测生成可视图像。材料和方法(Materialsandmethods)Westernblot检测材料和方法(Materials1、蛙皮素诱导胰腺炎的情况结果显示：与对照组相比，实验组在3h时血清淀粉酶及脂肪酶均有明显的升高，并分别在6h和12h达到高峰，24h时趋于正常。(P<0.05)结果(Results)血清淀粉酶血清脂肪酶1、蛙皮素诱导胰腺炎的情况结果(Results)血清淀粉酶血2、胰腺水肿的评估结果显示：与对照组相比，实验组在1h时的组织含水量有明显的升高，在6h时达到高峰，此后逐渐下降，24h时趋于正常。(P<0.05)结果(Results)2、胰腺水肿的评估结果(Results)3、胰腺组织学检查结果(Results)结果显示：与对照组相比，胰腺炎的胰腺组织表现的是间质水肿、空泡细胞以及炎症细胞的渗透。6h时间质水肿和空泡细胞最明显；12h时间质中炎性渗出最明显。3、胰腺组织学检查结果(Results)结果显示：与对照组相结果(Results)TUNEL染色结果(Results)TUNEL染色4、凋亡指数(AI)的测定结果显示：与对照组相比，实验组AI在3h时有显著的升高，在6h时达高峰，之后逐渐下降，但24h时仍有显著升高。(P<0.05)结果(Results)4、凋亡指数(AI)的测定结果(Results)5、急性胰腺炎时caspases的基因表达结果显示：与对照组相比，实验组中caspase-3，-7，-9的mRNA水平在1h时均有显著升高，在6h时达到高峰，之后逐渐下降，24h时趋于正常。(P<0.05)结果(Results)5、急性胰腺炎时caspases的基因表达结果(Result6、急性胰腺炎时GRP78的表达结果显示：与对照组相比，实验组中GRP78mRNA