枯草杆菌摇瓶发酵生产α

枯草杆菌摇瓶发酵生产a-淀粉酶实验方

案枯草芽孢杆菌产a-淀粉酶发酵试验一、 实验原理以枯草芽抱杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括a-淀粉酶、—淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽抱杆菌主要用来产生a-淀粉酶和异淀粉酶，其中a-淀粉酶又称淀粉1,4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的a-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉a-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的a -6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。二、 实验材料（一） 实验菌株：以枯草芽抱杆菌（二） 培养基：1、种子培养液：葡萄糖1%、胰蛋白胨：1%,、酵母提取物：0.5%、NaCI（氯化钠）：1%调pH7.2，若配置固体培养基，则再加入1.5%琼脂。2、 产淀粉酶发酵培养液：玉米粉2.0% 、蛋白胨1.5% 、CaCb0.02%、MgSQO.02%、NaCI0.25% 、K2HPO0.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%、NqHPO0.2%调节pH值7.0（三） 0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）（四） 实验仪器离心机、水浴锅、250m「角瓶、试管三、实验过程1、 分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。2、 种子斜面及种子液准备挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基， 37C,24h作菌种（3支/组）。将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（100KPa20min）。在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培养液中（每支斜面接两瓶），37r120r/min振荡培养16h作种子液。 （6瓶/组）3、 发酵培养A、 按15-20%的接种量接种于装有50mL已灭菌菌发酵培养基的250ml三角瓶中。37E培养48h。B、在无菌操作条件下，每4h取样2mL测定酶活。40-48h酶活降低后结束实验。4、 发酵结束后，用显微镜检查是否染菌。5、 待测酶液的制备：称取1g~2g酶粉（精确至0.0001g）或准确吸取酶液1.00mL,用少量磷酸缓冲液充分溶解，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液待用。注:待测中温a-淀粉酶酶液酶活力控制酶浓度在3.4u/mL~4.5u/mL范围内，待测耐高温淀粉酶活力控制酶浓度在60u/mL~65u/mL范围内。&酶活力的测定吸取10.0mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液2.5mL,摇匀后，置于60C±0.2C（耐高温a-淀粉酶制剂置于70C±0.2C）恒温水浴中预热8min;加入0.5mL稀释好的待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应5min；立即用移液管吸取1.0mL反应液，加到预先盛有0.5mL盐酸溶液和5.00mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5mL盐酸溶液和5.00mL稀碘液为空白，于660nm波长下，用10mnit色皿迅速测定其吸光度（A）。根据吸光度查表A.1，求得测试酶液的浓度。7、酶活力计算（1）中温a-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算：X1=cXn式中：%—样品的酶活力，u/mL或u/gc—测试酶样浓度，u/mL或u/gn—样品的稀释倍数（可通过反应时间和加入固定化酶的量来控制）。注：所得结果表示至整数。允许差：平行试验相对误差不得超过5%(2)耐高温a-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算：茨=cXnX16.67式中：人一样品的酶活