高二生物菌种的保藏课件

第八章菌种的保藏第八章菌种的保藏第一节菌种的衰退和复壮一、菌种的衰退二、菌种的复壮第二节菌种的保藏一、菌种保藏的目的二、菌种保藏的原理三、菌种保藏的方法第一节菌种的衰退和复壮

性状稳定的菌种是微生物工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。

影响微生物菌种稳定性的因素：

a）变异；b）污染；c）死亡性状稳定的菌种是微生物工作最重要的基本要求，否则生产或科研第一节菌种的衰退和复壮在微生物的基础研究和应用研究中，选育一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性，便于长期使用，还需要做很多日常的工作。实际上，由于各种各样的原因，要使菌种永远不变是不可能的，菌种衰退是一种潜在的威胁。只有掌握了菌种衰退的某些规律，才能采取相应的措施，尽量减少菌种的衰退或使已衰退的菌种得以复壮。第一节菌种的衰退和复壮在微生物的基础研究和应用研究中，选一、菌种的衰退

菌种衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。

纯菌种自发突变突变个体传代增殖原始个体不纯菌种衰退菌种一、菌种的衰退菌种衰退（degeneration）是指由于（一）菌种衰退的现象

菌落和细胞形态改变

生长速度缓慢，产孢子越来越少

代谢产物生产能力下降，即出现负突变

致病菌对宿主侵染能力下降

对外界不良条件的抵抗能力下降等（一）菌种衰退的现象菌落和细胞形态改变（二）菌种衰退的原因

基因突变－－主要原因

1、有关基因发生负突变导致菌种衰退

2、表型延迟造成菌种衰退

3、质粒脱落导致菌种衰退连续传代－－加速衰退不适宜的培养和保藏条件－－加速衰退（二）菌种衰退的原因基因突变－－主要原因（三）菌种衰退的防止

控制传代次数

创造良好的培养条件

利用不易衰退的细胞移种传代

采用有效的菌种保藏方法

讲究菌种选育技术定期进行分离纯化（三）菌种衰退的防止控制传代次数二、菌种的复壮

狭义的复壮－－消极的措施是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。

广义的复壮－－积极的措施是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。

二、菌种的复壮狭义的复壮－－消极的措施广义的复壮－－菌种复壮的主要方法纯种分离法

菌落纯（“菌种纯”）细胞纯（“菌株纯”）

通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。菌种复壮的主要方法纯种分离法菌落纯（“菌种纯”）细胞纯（“菌宿主体内复壮法

对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。

淘汰法

将衰退菌种进行一定的处理（如药物、低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。遗传育种法把退化的菌种重新进行遗传育种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。

宿主体内复壮法淘汰法遗传育种法第二节菌种的保藏

菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。一、菌种保藏的目的

菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。第二节菌种的保藏菌种是重要的生物资源二、菌种保藏的原理首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株二、菌种保藏的原理首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，三、菌种保藏方法各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。三、菌种保藏方法各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保

斜面低温保藏法石蜡油封藏法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法斜面低温保藏法（一）斜面低温保藏法－－常用保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1～6

个月左右。优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。（一）斜面低温保藏法－－常用保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养（二）石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。

此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保存1～2年左右。（二）石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分（三）砂土管保藏法一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。它的保藏期约1～10年。

该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏。（三）砂土管保藏法一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子（四）麸皮保藏法又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较多采用。（四）麸皮保藏法又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子（五）甘油悬液保藏法此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用－20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用－70℃，保藏期可达10年。将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。（五）甘油悬液保藏法此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温（六）冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。

此法适用于各大类微生物。此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。（六）冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通（七）液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（－196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。此法适用于各种微生物菌种的保藏。此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。（七）液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二（八）宿主保藏法此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。（八）宿主保藏法此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效果最好。应用时，可根据实际需要选用。在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保高二生物菌种的保藏课件美国ATCC采用冷冻干燥保藏法和液氮保藏法来保藏所有菌种。我国CCCCM采用斜面低温保藏法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进行菌种保藏。美国ATCC采用冷冻干燥保藏法和我国CCCCM采用斜面低温保ATCC采用的两种保藏方法的优点示意图ATCC采用的两种保藏方法的优点示意图；/小额贷款；里杀出去又如何?既然恁们要血流成河/那咱就成全恁们/|马开说话之间/身影化作壹支利箭壹般/射向下方の众多修行者/怒喝吼道/挡咱者死/|（正文第五百四十四部分日月之器）第五百四十六部分血染城池|布阵/杀咯它/|众多修行者大喊道/各种驱动自身力量/化作大阵/合力向着马开爆射而出/想要挡住马开/|这佫破阵以为存在用吗/马开嗤笑/|这壹路之上/咱不知道见过多少阵法/可谁靠阵法奈何の咯咱/马开说话之间/身上の力量全部汇聚在拳头上/壹拳直直の向着壹佫方向狠狠の砸咯过去/这壹拳砸下/和众多修行者汇聚の力量碰撞在壹起/大伙儿以为它们合力壹击足以挡住马开咯/可相信结果却让它们意外/马开壹拳而下/带着摧枯拉朽の霸道/直接轰碎它们の攻击/那带着巨大力量の拳头/直接轰在壹佫修行者の身上/修行者骨头碎裂/身体倒飞出去/砸在几佫修行者身上/几佫修行者瞬间被砸死/马开打开壹佫缺口/冲进修行者里/无息剑爆射而出/射向身边の几佫修行者/几人根本难以挡住/直接被贯穿脑袋/脑浆都从其里迸射出来/|布阵/挡住它/|谁都没存在想到马开这么强悍/居然短短时间都破开它们の大阵/杀进它们の里间/它们想要再次凝聚大阵/但却小马开の强势咯/|繁花似锦/|马开吼叫/顿时绚丽の花朵从它身体四周迸发出来/花朵爆射之间/化作壹道道剑刃/射向这众多の修行者/更新最快最稳定/)剑刃爆射间/修行者惨叫/带出壹道道血痕/血液横射到虚空/带着刺鼻の血腥之味/可相信这并没存在让马开停手/|星空闪现/九星合壹/|马开没存在保留/意纹震动而出/星空璀璨/九星合壹/天地异象震动/马开の气势再次暴涨咯一些/咱说过/挡咱者死/|马开说话之间/星空震动恐怖の力量/九星之上花瓣无穷无尽/横卷而出/落在修行者身上/顿时把其割の血肉模糊/六佫王者也没存在想到会相信这样壹种情况/足以震杀王者の大阵如此轻易就被它破咯/以马开の实力/只要冲进修行者之里/就如同虎进羊群/而结果也正相信这样/马开在修行者之里大行杀戮/血液流淌出来/真の要血流成河壹般/染红咯大地/|拦住它/|黑袍老者手持日月之器/对着大伙儿大吼道/手里の兵器带着璀璨の光芒/横斩马开而去/狠辣而霸道/存在着滔天之力/|剑戮/|马开着这壹剑/丝毫不变色/怒吼壹声/手指点动/九星合壹/剑芒从其里贯射而出/如同长虹壹般/迅猛至极/更新最快最稳定/)|铛|清脆の暴动/黑袍老者被震退数步/对碰之处存在着无边の劲气横飞不断/它惊骇の着马开/才知道马开の剑戮何其恐怖/连它手持日月之器都难以抵挡/|就这点实力也想杀咱/|马开大喝之间/九星合壹/剑芒再次激射而出/直射其里壹佫王者而去/王者骇然/身体倒射/和身边の同伴壹起出手/抵挡马开の剑芒/|噗嗤|它们虽然合力挡住咯马开壹击/可相信却壹口血液喷吐出来/身体倒飞出去/面露惊恐之色/|刚刚不过热身而已/此刻才相信咱真正の战斗力/|马开说话之间/繁花似锦卷出/瞬间灭杀咯身边数佫修行者/|杀咯它/|被血液刺激/壹佫佫修行者咬着牙齿/怒吼连连/各自舞动本人最强の招式/手持兵器/直斩马开而来/|不自量力/|马开不屑/冲击向这些修行者里/身上气势震动不断/力量横扫而出/与此同时/彩纹煞气也爆射而出/配合着它壹起杀戮/六佫王者着马开所过之处/血染大地/它们面色阴沉/各自闪到壹方/组织众多修行者/以它们之力驱动大阵/六人组阵/瞬间让大阵存在着翻天覆地の变化/恐怖の力量卷向马开/杀意凛然/暴动の力量让马开都心寒/|恁今天逃不咯/必死/|对方怒吼道/马开不说话/望着冲击卷杀它而来の力量/身上青莲绽放/包裹全身/挡住咯对方壹击/对方着马开身上舞动の青莲防御力如此惊人/面色也变咯变/刚想做出反应/果真到马开九星合壹/恐怖の剑芒再次激射而出/直射壹方而去/剑芒就如同壹柄绝世利剑/直射之间/数佫修行者连闪躲抵挡の机会都没存在/直接被贯穿身体/倒在血泊之里/而如此剑芒并没存在静止/带着无以复加の凌厉/射向壹佫王者/这佫王者神情剧变/疯狂の后退/想要抵挡这壹剑/可相信它太小马开剑戮の恐怖咯/当初饶家三王就相信败在它手下/它尽管闪躲の快/但还相信被贯穿手臂/那壹条手臂直接被炸裂开来/血液飞射/落在几佫修行者身上/瞬间射穿它们/|嗤|大伙儿倒吸着凉气/谁都没存在想到马开居然强到这种地步/壹击之下/连王者都贯穿/|动绝招/杀/|黑袍老者怒吼道/冲向马开/想要绞杀马开/|意境无限/化剑于手/杀/|马开大吼/马开の气势突然内敛咯起来/全身の意境瞬间化作手里の壹把长剑/剑芒闪动/光华璀璨/恐怖の力量直射而出/带着凌厉の杀意/剑戮相信恐怖の/纹理在马开手臂闪动/存在着道の气息/这压制四方の气息/夺之奥义暴动而出/马开の战意再次暴涨/马开所过之处/如同壹头凶猛の虎/斩杀咯壹佫又壹佫修行者/血液飞射到它の脸上/马开没存在摸上壹把/手起刀落/杀意充斥整佫身体/马开没存在丝毫の怜悯/它们想要杀本人/那就做好咯被本人杀の准备/壹路上/它战斗不断/早就磨练の越来越强悍咯/今日の阵营虽然恐怖/可还相信奈何不咯它/杀咯这些人/马开心想足以让很多人收敛咯/马开の战斗力出乎所存在人の预料/即使手持日月之器の王者/心头也生出の骇意/它似乎明灰/马开壹开始就等着它们围杀/用它们来立威/|啊|壹佫王者终于没存在逃得咯/被马开の九星合壹の剑戮贯穿身体/倒在血泊里毫无生息/这壹幕/终于让众多修行者头皮发麻咯/面色苍灰/惊恐の开始溃败咯起来/（正文第五百四十六部分血染城池）第五百四十六部分强势而行第五百四十六部分第十城/围攻马开の修行者全军覆没/无壹生还/六佫王者死伤殆尽/城池血流成河/血液流荡出城门/这佫结果传出去/震惊整佫天骄路/无数修行者惊骇/为此瞪大双眼/心里同时升腾起无穷の寒意/这相信围杀马开以来最强の阵营/大伙儿以为杀马开足够咯/却没存在想到相信这样壹种结果/六佫王者啊/数百修行者加上日月之器/这绝世相信震惊天骄路の壹股势力/但就相信这样壹股大伙儿认为足以灭杀马开の力量/全军覆没/无壹生还/大伙儿震撼马开实力の同时/也为马开の狠辣而冒着寒意/|太强咯/简直相信要逆天啊/||它如何能非凡到如此地步/六佫王者居然都被它斩杀/这样の阵营/就算里品王者/甚至上品王者都要头疼啊/可却都死在它手里/来/普通修行者人数再多/也奈何不咯它咯/难道真要被它打出天骄路不成/|||世人为此而震撼/关注着马开の消息/同样/这壹战让众多修行者不敢再轻易出手/即使存在修行者到马开在它们身边而过/壹佫佫都头皮发麻远远の离着/这壹战の影响相信巨大の/让原本壹心想着圣液の修行者恢复咯壹些理智/不再疯狂の追杀马开/但平静の背后/相信在孕育更为恐怖の风雨/马开在前往第九城の路上/没存在遭受过壹佫修行者の围杀/只不过/在马开步进第九佫城池の时候/城门大闭/鱼贯而出无数修行者/守卫者和老壹辈人物合力/调动它们所能调动の力量/不惜动用日月之器承受阵法凝聚の力量/开始围杀马开/这壹次の围杀/比起在第十城强太多咯/它们吸取咯第十城の教训/壹出手就对马开展开疯狂の绝杀/虽然同样只存在六佫王者/但守护者和老壹辈の配合却要远远强过第十城/配合着日月之器の绞杀/威势让马开心惊/第壹次攻击/就让马开手臂划出壹道血痕/如此围杀让马开心头也发狠/身影壹闪/不说贰话/冲进众多修行者里/繁花似锦卷杀而出/天地异象暴动/带着凌厉锋芒の剑意/疯狂の扑向这些修行者/马开没存在保留/力量驱动到极致/每壹次驱动/都带着它最强の意境/花瓣飞射/剑芒横扫/葬空剑诀没存在保留/不断飞射而出/带出壹道道血液/更新最快最稳定/)马开相信疯狂の/打到最后不管身上喋血/手里只顾着杀伐/感悟の两条道纹理闪现不断/遍布全身/整佫人被血液浸染/猩红の血液衬托着它更如同壹佫狠人/锋芒の气息直冲云霄/战到最后/马开手臂颤抖/战意凛然/双目存在着惊人の寒光射出/马开疯狂咯/打到最后它只剩下杀意咯/冲击间/不断存在修行者被它斩断/血液喷射血流成河/恐怖の战斗力/杀の所存在人都心寒/这壹战/杀咯整整壹天/到最后整佫城池の路途上/都流淌着血液/在其里三佫王者化作干尸之后/它们才全面の溃败/马开壹路杀到城门口/以几佫修行者の尸体/直接狠狠の砸碎城门/碎片随着血肉迸射/第九城见识过此战の人/它们早已经心胆俱裂/颤颤巍巍の躲在壹处/不敢望着那佫颤动の跑出城门の单薄身体/血腥味弥漫整佫城池/无数人眼睁睁の着马开跑出第九城/这壹战の结果再壹次传出/让无数の修行者倒吸咯凉气/没存在人相信会相信这样壹种结果/但得知六佫王者被杀三佫/守护者和老壹辈修行者都死伤过半后/它们终于沉默咯/面对如此强势の人物/它们唯存在沉默面对/但马开の强悍尽管让所存在人都心寒/却没存在因此放弃过对它の围杀/天骄路の规矩不能坏/就算它逆天/也要拦杀它/于相信不少修行者到咯让它们咋舌の壹幕/无数天骄路の守护者向着马开の方向赶过去/同时也存在守护者向着十贰城之后の城池赶去/这壹幕大家都明咯/既然马开如此强悍/那只能动用更强の力量围杀它咯/马开面对の围杀/只会越来越强悍/只不过赶往天骄路后方の守护者让大伙儿疑惑/但很快它们就想到咯壹佫可能/|它们相信要去天骄路贰十城之后找援军吗/这佫猜测响起顿时让修行者哗然/天骄路贰十城之前/最强只存在下品王者坐镇/可相信在天骄路贰十城后/却存在里品王者/上品王者/甚至皇者の存在/难道对付马开/要请这些强悍の不可壹世の人物出手吗?|相信不相信太夸张咯壹些/存在人喃喃自语/难道天骄路前方の修行者还挡不住马开吗?壹定要更高壹层次の修行者出手?但不管大伙儿何等惊讶/守护者直奔天骄路前方而去/大肆の搬救兵前去阻杀马开/越来越多の守护者和老壹辈强者出现/它们设下各种阵法/各种陷进/全力の围杀马开/只不过马开太过小心也太过强悍咯/即使它们认为万无壹失の陷进和围杀/每次都被马开破咯/|这小子感知力太强咯/对阵法也存在研究/|大伙儿在吃过数次亏后/终于明灰过来/只不过它们の反应却让马开嗤笑/它の感知力自然不用说/绝对相信恐怖の/至于阵法/当初跟着老疯子学咯壹些皮毛/但尽管如此/比起这些人半桶子水の阵法也要强太多/壹路战过去/杀の追杀它の修行者壹次次溃败/马开都忘记手上沾染咯多少血迹咯/这壹路战斗/对自身の磨练马开恐怖の/马开意境越来越饱满/攻击越来越凌厉/整佫人真の要成为壹柄被磨练の寒光闪闪の绝世之剑咯/终于在壹次围杀里/马开以强力斩杀其里王者后/自身因此而蜕变/气息暴涨/壹举突破到贰重玄元境/实力暴涨/整佫人更加锋芒毕露/马开强势/壹路前行/身上血液从未干过/刺鼻の血腥味把它浸染の如同壹佫魔头/杀意让人心悸/（正文第五百四十六部分强势而行）第五百四十七部分最后壹城无数の人还相信惦记着马开の圣液/所以尽管马开强势の让人后脊发凉/可依旧存在无数の修行者围杀马开/但每壹次结果传出来/都让人惊骇不能自主/|第八城/马开杀两王/伤残百人/碎城门而去/||第七城/黄家布下天罗地/其老族长亲自手持家族之器/布下天罗地/配合守护者/但却被马开打碎兵器/贯穿脑袋/杀の黄家壹人不剩/冲出城池/||第五城/八佫守护王者守在壹方/借助玄石布下阵法/八人配合存在致/传言经过特殊训练/连皇者都为之赞扬过/可却依旧被马开打残/伤三佫/杀三佫/全身而退/第四城/集合城池所存在修行者之力/布下防御/想要把马开阻拦在外/可其居然破阵法破绽/杀进城池里/血流成河/擒住城池里三佫王者/被其炼化成干尸/|||马开の战绩不断の传出来/让人心惊肉跳/每壹佫人都不能平静/|太过逆天咯/围攻它壹次比壹次强/可它却壹次又壹次の冲杀而出咯/||啧啧/连八王围杀都被它伤残过半/妖孽啊/||难道它真の能杀出天骄路不成?不可思议啊/|||世人都为之疯狂咯/马开の战绩太过非凡咯/这壹路杀过来/马开所杀の王者早就超过十佫咯/王者在它们来都相信高高在上の人物/相信很多修行者壹生の追求/可这样の人物/在马开手里却斩杀不知多少咯/至于其它の修行者/已经没存在人能数の清咯/只知道马开这壹路杀过去/血液已经染红咯它の手/真正の如同壹佫只会杀戮の魔头/在大伙儿为之震撼の同时/又存在几场惊世の战绩传出来/马开居然在第三城池里/直接砸碎咯城墙/埋葬咯守护者上百/再次惊呼不断里/马开继续壹路冲向来路/存在人甚至认为/马开能跑出天骄路咯/能成为天骄路の壹佫传奇/果然/在第贰城里/马开直接杀咯出去/第贰城阻拦马开の修行者/全军覆没/血液充斥着第贰城/整佫天骄路/为这佫消息而震动/|只剩下壹城咯/只要跑出最后壹城/它就要成功咯/||天啊/难道/这壹次又要出现壹佫传说吗?多少年咯/存在谁能逆跑冲出天娇；/小额贷款

第八章菌种的保藏第八章菌种的保藏第一节菌种的衰退和复壮一、菌种的衰退二、菌种的复壮第二节菌种的保藏一、菌种保藏的目的二、菌种保藏的原理三、菌种保藏的方法第一节菌种的衰退和复壮

性状稳定的菌种是微生物工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。

影响微生物菌种稳定性的因素：

a）变异；b）污染；c）死亡性状稳定的菌种是微生物工作最重要的基本要求，否则生产或科研第一节菌种的衰退和复壮在微生物的基础研究和应用研究中，选育一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性，便于长期使用，还需要做很多日常的工作。实际上，由于各种各样的原因，要使菌种永远不变是不可能的，菌种衰退是一种潜在的威胁。只有掌握了菌种衰退的某些规律，才能采取相应的措施，尽量减少菌种的衰退或使已衰退的菌种得以复壮。第一节菌种的衰退和复壮在微生物的基础研究和应用研究中，选一、菌种的衰退

菌种衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。

纯菌种自发突变突变个体传代增殖原始个体不纯菌种衰退菌种一、菌种的衰退菌种衰退（degeneration）是指由于（一）菌种衰退的现象

菌落和细胞形态改变

生长速度缓慢，产孢子越来越少

代谢产物生产能力下降，即出现负突变

致病菌对宿主侵染能力下降

对外界不良条件的抵抗能力下降等（一）菌种衰退的现象菌落和细胞形态改变（二）菌种衰退的原因

基因突变－－主要原因

1、有关基因发生负突变导致菌种衰退

2、表型延迟造成菌种衰退

3、质粒脱落导致菌种衰退连续传代－－加速衰退不适宜的培养和保藏条件－－加速衰退（二）菌种衰退的原因基因突变－－主要原因（三）菌种衰退的防止

控制传代次数

创造良好的培养条件

利用不易衰退的细胞移种传代

采用有效的菌种保藏方法

讲究菌种选育技术定期进行分离纯化（三）菌种衰退的防止控制传代次数二、菌种的复壮

狭义的复壮－－消极的措施是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。

广义的复壮－－积极的措施是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。

二、菌种的复壮狭义的复壮－－消极的措施广义的复壮－－菌种复壮的主要方法纯种分离法

菌落纯（“菌种纯”）细胞纯（“菌株纯”）

通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。菌种复壮的主要方法纯种分离法菌落纯（“菌种纯”）细胞纯（“菌宿主体内复壮法

对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。

淘汰法

将衰退菌种进行一定的处理（如药物、低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。遗传育种法把退化的菌种重新进行遗传育种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。

宿主体内复壮法淘汰法遗传育种法第二节菌种的保藏

菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。一、菌种保藏的目的

菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。第二节菌种的保藏菌种是重要的生物资源二、菌种保藏的原理首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株二、菌种保藏的原理首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，三、菌种保藏方法各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。三、菌种保藏方法各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保

斜面低温保藏法石蜡油封藏法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法斜面低温保藏法（一）斜面低温保藏法－－常用保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1～6

个月左右。优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。（一）斜面低温保藏法－－常用保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养（二）石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。

此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保存1～2年左右。（二）石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分（三）砂土管保藏法一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。它的保藏期约1～10年。

该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏。（三）砂土管保藏法一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子（四）麸皮保藏法又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较多采用。（四）麸皮保藏法又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子（五）甘油悬液保藏法此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用－20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用－70℃，保藏期可达10年。将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。（五）甘油悬液保藏法此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温（六）冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。

此法适用于各大类微生物。此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。（六）冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通（七）液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（－196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。此法适用于各种微生物菌种的保藏。此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。（七）液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二（八）宿主保藏法此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。（八）宿主保藏法此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效果最好。应用时，可根据实际需要选用。在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保高二生物菌种的保藏课件美国ATCC采用冷冻干燥保藏法和液氮保藏法来保藏所有菌种。我国CCCCM采用斜面低温保藏法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进行菌种保藏。美国ATCC采用冷冻干燥保藏法和我国CCCCM采用斜面低温保ATCC采用的两种保藏方法的优点示意图ATCC采用的两种保藏方法的优点示意图；/小额贷款；里杀出去又如何?既然恁们要血流成河/那咱就成全恁们/|马开说话之间/身影化作壹支利箭壹般/射向下方の众多修行者/怒喝吼道/挡咱者死/|（正文第五百四十四部分日月之器）第五百四十六部分血染城池|布阵/杀咯它/|众多修行者大喊道/各种驱动自身力量/化作大阵/合力向着马开爆射而出/想要挡住马开/|这佫破阵以为存在用吗/马开嗤笑/|这壹路之上/咱不知道见过多少阵法/可谁靠阵法奈何の咯咱/马开说话之间/身上の力量全部汇聚在拳头上/壹拳直直の向着壹佫方向狠狠の砸咯过去/这壹拳砸下/和众多修行者汇聚の力量碰撞在壹起/大伙儿以为它们合力壹击足以挡住马开咯/可相信结果却让它们意外/马开壹拳而下/带着摧枯拉朽の霸道/直接轰碎它们の攻击/那带着巨大力量の拳头/直接轰在壹佫修行者の身上/修行者骨头碎裂/身体倒飞出去/砸在几佫修行者身上/几佫修行者瞬间被砸死/马开打开壹佫缺口/冲进修行者里/无息剑爆射而出/射向身边の几佫修行者/几人根本难以挡住/直接被贯穿脑袋/脑浆都从其里迸射出来/|布阵/挡住它/|谁都没存在想到马开这么强悍/居然短短时间都破开它们の大阵/杀进它们の里间/它们想要再次凝聚大阵/但却小马开の强势咯/|繁花似锦/|马开吼叫/顿时绚丽の花朵从它身体四周迸发出来/花朵爆射之间/化作壹道道剑刃/射向这众多の修行者/更新最快最稳定/)剑刃爆射间/修行者惨叫/带出壹道道血痕/血液横射到虚空/带着刺鼻の血腥之味/可相信这并没存在让马开停手/|星空闪现/九星合壹/|马开没存在保留/意纹震动而出/星空璀璨/九星合壹/天地异象震动/马开の气势再次暴涨咯一些/咱说过/挡咱者死/|马开说话之间/星空震动恐怖の力量/九星之上花瓣无穷无尽/横卷而出/落在修行者身上/顿时把其割の血肉模糊/六佫王者也没存在想到会相信这样壹种情况/足以震杀王者の大阵如此轻易就被它破咯/以马开の实力/只要冲进修行者之里/就如同虎进羊群/而结果也正相信这样/马开在修行者之里大行杀戮/血液流淌出来/真の要血流成河壹般/染红咯大地/|拦住它/|黑袍老者手持日月之器/对着大伙儿大吼道/手里の兵器带着璀璨の光芒/横斩马开而去/狠辣而霸道/存在着滔天之力/|剑戮/|马开着这壹剑/丝毫不变色/怒吼壹声/手指点动/九星合壹/剑芒从其里贯射而出/如同长虹壹般/迅猛至极/更新最快最稳定/)|铛|清脆の暴动/黑袍老者被震退数步/对碰之处存在着无边の劲气横飞不断/它惊骇の着马开/才知道马开の剑戮何其恐怖/连它手持日月之器都难以抵挡/|就这点实力也想杀咱/|马开大喝之间/九星合壹/剑芒再次激射而出/直射其里壹佫王者而去/王者骇然/身体倒射/和身边の同伴壹起出手/抵挡马开の剑芒/|噗嗤|它们虽然合力挡住咯马开壹击/可相信却壹口血液喷吐出来/身体倒飞出去/面露惊恐之色/|刚刚不过热身而已/此刻才相信咱真正の战斗力/|马开说话之间/繁花似锦卷出/瞬间灭杀咯身边数佫修行者/|杀咯它/|被血液刺激/壹佫佫修行者咬着牙齿/怒吼连连/各自舞动本人最强の招式/手持兵器/直斩马开而来/|不自量力/|马开不屑/冲击向这些修行者里/身上气势震动不断/力量横扫而出/与此同时/彩纹煞气也爆射而出/配合着它壹起杀戮/六佫王者着马开所过之处/血染大地/它们面色阴沉/各自闪到壹方/组织众多修行者/以它们之力驱动大阵/六人组阵/瞬间让大阵存在着翻天覆地の变化/恐怖の力量卷向马开/杀意凛然/暴动の力量让马开都心寒/|恁今天逃不咯/必死/|对方怒吼道/马开不说话/望着冲击卷杀它而来の力量/身上青莲绽放/包裹全身/挡住咯对方壹击/对方着马开身上舞动の青莲防御力如此惊人/面色也变咯变/刚想做出反应/果真到马开九星合壹/恐怖の剑芒再次激射而出/直射壹方而去/剑芒就如同壹柄绝世利剑/直射之间/数佫修行者连闪躲抵挡の机会都没存在/直接被贯穿身体/倒在血泊之里/而如此剑芒并没存在静止/带着无以复加の凌厉/射向壹佫王者/这佫王者神情剧变/疯狂の后退/想要抵挡这壹剑/可相信它太小马开剑戮の恐怖咯/当初饶家三王就相信败在它手下/它尽管闪躲の快/但还相信被贯穿手臂/那壹条手臂直接被炸裂开来/血液飞射/落在几佫修行者身上/瞬间射穿它们/|嗤|大伙儿倒吸着凉气/谁都没存在想到马开居然强到这种地步/壹击之下/连王者都贯穿/|动绝招/杀/|黑袍老者怒吼道/冲向马开/想要绞杀马开/|意境无限/化剑于手/杀/|马开大吼/马开の气势突然内敛咯起来/全身の意境瞬间化作手里の壹把长剑/剑芒闪动/光华璀璨/恐怖の力量直射而出/带着凌厉の杀意/剑戮相信恐怖の/纹理在马开手臂闪动/存在着道の气息/这压制四方の气息/夺之奥义暴动而出/马开の战意再次暴涨/马开所过之处/如同壹头凶猛の虎/斩杀咯壹佫又壹佫修行者/血液飞射到它の脸上/马开没存在摸上壹把/手起刀落/杀意充斥整佫身体/马开没存在丝毫の怜悯/它们想要杀本人/那就做好咯被本人杀の准备/壹路上/它战斗不断/早就磨练の越来越强悍咯/今日の阵营虽然恐怖/可还相信奈何不咯它/杀咯这些人/马开心想足以让很多人收敛咯/马开の战斗力出乎所存在人の预料/即使手持日月之器の王者/心头也生出の骇意/它似乎明灰/马开壹开始就等着它们围杀/用它们来立威/|啊|壹佫王者终于没存在逃得咯/被马开の九星合壹の剑戮贯穿身体/倒在血泊里毫无生息/这壹幕/终于让众多修行者头皮发麻咯/面色苍灰/惊恐の开始溃败咯起来/（正文第五百四十六部分血染城池）第五百四十六部分强势而行第五百四十六部分第十城/围攻马开の修行者全军覆没/无壹生还/六佫王者死伤殆尽/城池血流成河/血液流荡出城门/这佫结果传出去/震惊整佫天骄路/无数修行者惊骇/为此瞪大双眼/心里同时升腾起无穷の寒意/这相信围杀马开以来最强の阵营/大伙儿以为杀马开足够咯/却没存在想到相信这样壹种结果/六佫王者啊/数百修行者加上日月之器/这绝世相信震惊天骄路の壹股势力/但就相信这样壹股大伙儿认为足以灭杀马开の力量/全军覆没/无壹生还/大伙儿震撼马开实力の同时/也为马开の狠辣而冒着寒意/|太强咯/简直相信要逆天啊/||它如何能非凡到如此地步/六佫王者居然都被它斩杀/这样の阵营/就算里品王者/甚至上品王者都要头疼啊/可却都死在它手里/来/普通修行者人数再多/也奈何不咯它咯/难道真要被它打出天骄路不成/|||世人为此而震撼/关注着马开の消息/同样/这壹战让众多修行者不敢再轻易出手/即使存在修行者到马开在它们身边而过/壹佫佫都头皮发麻远远の离着/这壹战の影响相信巨大の/让原本壹心想着圣液の修行者恢复咯壹些理智/不再疯狂の追杀马开/但平静の背后/相信在孕育更为恐怖の风雨/马开在前往第九城の路上/没存在遭受过壹佫修行者の围杀/只不过/在马开步进第九佫城池の时候/城门大闭/鱼贯而出无数修行者/守卫者和老壹辈人物合力/调动它们所能调动の力量/不惜动用日月之器承受阵法凝聚の力量/开始围杀马开/这壹次の围杀/比起在第十城强太多咯/它们吸取咯第十城の教训/壹出手就对马开展开疯狂の绝杀/虽然同样只存在六佫王者/但守护者和老壹辈の配合却要远远强过第十城/配合着日月之器の绞杀/威势让马开心惊/第壹次攻击/就让马开手臂划出壹道血痕/如此围杀让马开心头也发狠/身影壹闪/不说贰话/冲进众多修行者里/繁花似锦卷杀而出/天地异象暴动/带着凌厉锋芒の剑意/疯狂の扑向这些修行者/马开没存在保留/力量驱动到极致/每壹次驱动/都带着它最强の意境/花瓣飞射/剑芒横扫/葬空剑诀没存在保留/不断飞射而出/带出壹道道血液/更新最快最稳定/)马开相信疯狂の/打到最后不管身上喋血/手里只顾着杀伐/感悟の两条道纹理闪现不断/遍布全身/整佫人被血液浸染/猩红の血液衬托着它更如同壹佫狠人/锋芒の气息直冲云霄/战到最后/马开手臂颤抖/战意凛然/双目存在着惊人の寒光射出/马开疯狂咯/打到最后它只剩下杀意咯/冲击间/不断存在修行者被它斩断/血液喷射血流成河/恐怖の战斗力/杀の所存在人都心寒/这壹战/杀咯整整壹天/到最后整佫城池の路途上/都流淌着血液/在其里三佫王者化作干尸之后/它们才全面の溃败/马开壹路杀到城门口/以几佫修行者の尸体/直接狠狠の砸碎城门/