蛋白质定向进化技术

关于蛋白质定向进化技术第1页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术

DE（directedevolutionofprotein）始于上世纪70年代，最早的一个例子是进化一个来源于大肠杆菌的EbgA蛋白，这个酶几乎不具备β-半乳糖苷酶的活性。通过以乳糖为单一碳源的平板上筛选Lac-缺失的大肠菌株，野生型的EbgA就进化成为了具有β-半乳糖苷酶活性的酶。第2页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术★定义（definition）★原理（theory）★随机突变的策略（markedfeatures）★定向进化的选择的策略（methods）★应用及展望（applicationandprospects）

第3页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术定义定向进化技术是一种在生物体体外(试管中)模拟达尔文进化，利用自然选择的动力进化出在自然界并不存在的或是具有更优性质的蛋白。第4页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术

生物在漫长的时间里经过自发突变（突变与重组），通过自然选择，逐渐形成了多样性的生物。自然选择自发、不定向、自然选择、慢分子定向进化

基因在短时间内通过人为引发突变，经过人工筛选，形成满足人们需要的新功能或者优良性能生物物质（酶蛋白）人为、定向、人工选择、快第5页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术原理

DE的原理是对目的基因进行突变、重组、表达和筛选,在试管内模拟蛋白质的自然进化过程,获取人们需要的、具有特定性质和功能的蛋白质。定向进化=随机突变+选择第6页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六

随机突变的策略■易错PCR■

DNA改组和外显子改组■杂合蛋白质■体外随机引发重组■交错延伸第7页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术●易错PCR

易错PCR是指通过改变PCR的反应条件，如：调整反应体系中4种dNTP的浓度、增加Mg2+

的浓度等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，构建突变库，刷出所需的突变体。易错PCR的关键是控制DNA的突变频率。第8页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术●DNA改组

DNA改组又称有性PCR，目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获得最佳突变组合的蛋白质。第9页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术●杂合蛋白质

把不同蛋白质分子的结构单元或整个蛋白质分子进行组合或交换，以产生具有所需性质的优化蛋白质杂合体。第10页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术●体外随机引发重组

以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。第11页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术●交错延伸

一种简化的DNA重组方法，它不是由短片段组装全长基因，而是在PCR反应中，将含不同点突变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂复性及延伸反应，在每一轮中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，如此重复直至获得全长基因片段。第12页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六定向进化的选择策略Venekei等人报道了有效快速筛选蛋白水解酶突变体的方法和筛选条件，主要是利用蛋白酶选择平板初选，再配合活性染色和X-光片消灭分析加以验证，并检测其活力快速筛选了44000个突变株。Roberts等人用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性酯酶结合力更强的抑制剂。从含有4900个突变体的基因库中，获得与该酶的结合能力高于野生蛋白质3600000倍的突变体，比已报道的任何一个相应的抑制剂高50倍。第13页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六定向进化的展望不仅能使蛋白质进化出非天然特性，还能定向进化某一代谢途径；不仅能进化出具有单一优良特性的蛋白质，还可能是已分别优化的蛋白质的两个或多个特性叠加，产生具有多项优化功能的蛋白质，进而发展和丰富蛋白质资源；完全在试管中进行的蛋白质的体外定向进化使在自然界需要几百万年的进化过程缩短至几年。第14页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化的应用及展望●提高酶的催化活性●提高酶的稳定性●改变酶的底物特异性●改变对映异构体特异性第15页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术◆提高酶的催化活性

Shim等采用定点突变技术构建的突变体，改变了位于酶活性中心“蛋白-s-结合”口袋中Met-317，并突变为Ala，从而有利于底物范围的扩大；

Potocki—Veronese等利用易错PCR和DNA重组技术对其进行突变，得到催化蔗糖活性提高60％的突变体Asn387Asp，从而扩大其应用范围，在实际生产中具有重要意义。第16页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术第17页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术◆提高酶的稳定性

Xiao等运用序列比对的结果为指导，进行定点突变，得到突变体的Tm值提高了6℃，同时在不影响原有催化活性的基础上，在45℃时的半衰期比原酶提高了23倍之多。

Miyazaki等为了适应生产化需要，综合了随机突变、定点饱和突变和DNA重组的方法，将11家族木聚糖酶进行改造以提高其热稳定性。最终得到的突变体的半热变性温度从58℃提高到68℃，最适温度也从55℃升到了65℃，同时在60℃的热稳定性也明显增强。第18页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术◆改变酶的底物特异性

Manu等通过对纤维二糖磷酸化酶(CP)进行易错PCR筛选，得到的突变株作用底物从传统的纤维二糖转变成了乳糖，随即提高了乳糖磷酸化酶的活性。最终得到的突变体菌株的乳糖磷酸化酶的活性比原酶高出了10倍。

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◆改变对映异构体特异性

（1）Schmidt等选用易错PCR技术将来源于Pseudomonasfluoresce~酯酶的对应选择性野生型的E值从63提高至96，同时活性也相应的增加了，能够达到2min转化50％的底物，相当于1．25U／mg的蛋白量。第20页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术（2）1998年，Arnold等运用易错PCR和饱和诱变的方法，成功地使一株倾向于D-型底物的乙内酰脲酶发生转变，使之变为倾向于L-型底物，经过分析这种转变只生发了一个氨基酸的替换。与野生型的催化蛋白相比，增加了L-甲硫氨酸的产量，降低了不必要的产物积累。第21页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六实际用途在新药和疫苗开发中的应用在改进单链抗体亲和力方面的应用在酶制剂改造中的应用构建大型文库和获取分子的有力工具在化学品生物转化中的应用第22页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术第23页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术

Luginbuhl等用易错PCR和DNA改组的方法,进行了几个回合的DE和用核糖体展示抗体库技术进行筛选后发现,得到的抗体与朊病毒肽链非结构化区域的亲和力增加.第24页，共26页，2022年，5月20日，4点43分，星期六蛋白质定向进化技术

Kikuchi等借助DNA改组方法提高了根癌农杆菌N-氮基甲酰．D-氨基酸酰胺水解酶的氧稳定性和热稳定性，使N-氨基甲酰-D-氨基酸酰胺水解这一生物转化过程更易应用于