血小板抗原及其抗体检测ygc课件

血小板抗原及其抗体检测

尹国才珠海保亚美投资有限公司技术部TE84605763Gene-ProbeGTIDiagnostics内容一、珠海保亚美投资有限公司业务简介二、血小板抗原三、血小板抗原抗体分析四、GTI血小板检测产品的用途一、珠海保亚美投资有限公司简介主要专业产品血液中心、输血科、血库及检验科等输血实验室设备与试剂。中国总代理

GTIDiagnostics：Gene-ProbeGTIDiaMed（达亚美）：Bio-Rad（伯乐）GTIProductsBloodBankProducts:

Mace1Mace2PakPlusPakAutoPak12Pak12GPak2LEPak1GranTypeThromboType

CoagulationProducts:PF4EnhancedFVIIIAntibodyScreen

TransplantationProducts:QuikScreenB-ScreenQuik-IDClassIQuik-IDClassIIMicroAMS(供者HLA与受者血清相配)HLAEZTypeHLATypingTraysComplementTitrationTraysHLAControlSeraEmptyTypingTrays

Equipment/Software:EZTypeSystemWinQIDLotFilesWholeBloodRedBloodCellswhiteBloodCellsPlatelet-RichPlasma血液制品PlateletsFreshFrozenPlasma血小板？血液中由巨核细胞产生的小细胞碎片。大小1～5um不等,

100~300x109/L。正常人每日消耗数百万Plt。参与血栓、血块形成。二、血小板抗原血小板相关抗原:与其他细胞表面或组织共有的抗原

.-白细胞抗原（HLA系统,HLA-I）.-红细胞抗原（血型系统,ABH、Lewis、I及P）.血小板特异性抗原(HPA):血小板特有的抗原决定簇,在血小板和巨核细胞上表达,属于双等位共显性遗传,表现血小板独特的遗传多态性,HPA多态性分布存在种族差异。-血小板表面膜糖蛋白Glycoprotein(GP).-共鉴定出24个抗原，23个已被正式命名.主要HPA的载体蛋白与功能GPIIb/IIIa：是纤维蛋白原、纤维连接蛋白、玻连蛋白(vitronectin)，vonWillebrandfactor（假性血管性血友病因子,vWF）等分子的受体。GPIb/IX：是vWF受体,参与粘附受损内皮细胞。GPIa/IIa：参与粘附胶原蛋白。GPIV（CD36

）：是I&IV型胶原、氧化型LDL、长链脂肪酸、疟原虫感染RBC的受体。表达于单核细胞,毛细血管内皮细胞,红细胞母细胞,脂肪细胞和血小板,IsoantigenNaka–1989。结合ECM，参与血小板粘附。HPA15(CD109):中国人多态性明显。表达于内皮细胞,激活的T细胞和血小板。参与细胞活化、增殖和信号传递。主要的多态性靶HPA：7个系统，HPA-1~6,15HPA4HPA5HPA1HPA2HPA3中国人HPA等位基因频率PrimožRožman,TransplantImmunologyVolume10;2002,Pages165-181EuropeanBioinformaticsInstituteDatabaseCD36(GPIV)抗原Platelets:亚洲人:3-11%北美:2.5%非洲:7.8%高加索人:0.06%I型:AbsentfromPlateletsandMonocytes

–输血或怀孕存在免疫应答风险II型:AbsentfromPlateletsonlyHPA与相关疾病HPA蛋白多肽表达缺陷致病：—Glanzman’sThrombocytopenia（血小板无力症）：1918年由Glanzmann报道，故本病又称“Glanzmann病”(GT)，是一种遗传性出血病，为PlateletGPIIb/IIIa和纤维蛋白原受体缺乏。—BernardSouliersyndrome（伯-苏综合征，巨血小板综合征）：血小板GPIb/IX/V缺乏。HPA抗体致病：免疫损伤Plt。－新生儿同种异体免疫性血小板减少症（NeonatalAlloimmuneThrombocytopenia，NAITP）

－血小板输注无效（PlateletTransfusionRefractoriness，RTP）－输血后紫癜（Post-TransfusionPurpura，PTP）－自身免疫性血小板减少症（AutoimmuneThrombocytopenia，AITP）

－肝素或药物诱导的血小板减少症（Heparinor

Drug-InducedThrombocytopenia

HITP或DITP)

－移植排斥●●●●●●血小板抗原同种免疫的反应机制

血小板糖蛋白被自身或同种异基因效应T细胞和B细胞所识别，产生相应的抗体，结合到相应的血小板抗原上。巨噬细胞表面的Fc受体与抗体分子的Fc片段结合后，在脾脏内血小板被巨噬细胞吞噬，引起血小板减少症。自身免疫的作用靶通常是非多态性的血小板GP和磷脂。同种免疫反应通常是由GPⅡb/Ⅲa，GPⅠb/Ⅸ，GPⅠa-Ⅱa，GPⅣ和HLA-I类分子上的同种异体特异性抗原引起的，在临床上引发NAITP，PTP，PTR。NAITPEthiologyplateletplateletplatelet血小板输注无效（PTR）血小板输注无效是由于患者反复输注血小板而产生了血小板同种抗体，导致再次输入血小板时，发生免疫反应。主要是由未除尽白细胞和血小板HLA抗原以及少数HPA抗原引起的免疫应答反应，产生相应的抗体。产生免疫性抗体的病人中,50%-80%为HLA抗体，同时，也有17%-25%的HPA抗体出现，其临床效应为缩短输注血小板的寿命。在日本人中HPA-2b是引起血小板输注无效的主要原因之一。

PTR以预防为主:输注HPA同型Plt可预防产生HPA抗体；输注去白Plt可有效预防HLA抗体的产生，杜绝大部分的PTR；对已经发生PTR的患者，可输注“配合”的浓缩血小板，临床疗效理想。ModelofPathogenesisinHITPVisentinetal,inHeparin-InducedThrombocytopenia;4thed.NewYork:InformaHealthcare,20076b移植排斥在骨髓移植及器官移植中，HPA抗原是引起相关排斥反应的原因之一。尽管供者与病人的HLA完全相配，仍有近25%的骨髓移植会发生移植物与宿主之间的排斥反应。这些现象是由次要组织相容性抗原（mHA）不合引起的。HPA分布可能比预想的要广泛，故推测，在移植中，HPA抗原起次要组织相容性抗原的作用。Balduini等在70例临床HLA相配儿童的骨髓移植中，研究了HPA-1，-2，-3和-5的相容性。结果提示：当受者接受HLA相配的供者骨髓时，HPA-3可作为mHA起作用。Kekomaki等对比研究了166对肾脏移植-受体的HPA-1，-2，-3，-5的相容性，结果表明：当HPA-5a/5a病人接受HPA-5b阳性供者的肾时，HPA-5b作为mHA在急性血管排斥反应中起作用。1、HPA和HLA抗原基因分型技术限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）序列特异性寡核苷酸探针技术（SequenceSpecificOligonucleotide,SSO）序列特异引物PCR技术（PCRSequenceSpecificPrimer,PCR-SSP）GTI基因分型试剂盒THROMBOTYPE®aprimersNegativeControlMasterMix(1+tubes)1a2a3a4a6a15a5aempty1a2a3a4a6a15a5aemptybprimersMasterMix(for14+PCRs)

2XPCRReagentTaqpolymeraseSampleDNAWater(tovolume)1b2b3b4b5b6b15bemptyDistributetoPrimer-loadedPCRTubes1b2b3b4b5bPlateletAntigenGenotyping:PCR-SSPHPA-5b/b(Bra/a)HPA-5a/b(Bra/b)HPA-5a/a(Brb/b)产品检测项目（每盒检测标本数）THROMBOTYPE血小板7种等位基因型检测(8)MACE®1HLA-I和GPIIb/IIIa交叉配型(45)MACE®2GPIa/IIa,Ib/IX,IV交叉配型(30)PAK®12PAK®12G检测GPIIb/IIIa,Ia/IIa，Ib/IX和HLA-I的抗体(IgG,IgA,IgM)或单独IgG型抗体(5)

PAK®2-LEGPIIb/IIIa,Ia/IIa，Ib/IX和HLA-I的IgG型抗体(8)PAK®1检测GPIIb/IIIa上的特异表位抗体(8)PAKPLUS®鉴定GPIIb/IIIa,Ia/IIa的特异表位抗体，筛选血小板Ib/IX,IV,HLA-I抗体(8)PF4Enhanced®检测PF4/肝素复合物的抗体(8)GTIDiagnosticsPLT检测试剂盒PLT抗体检测试剂盒MACEI&MACEII：－交叉配型－规格：MACE®1：45个测试/盒；MACE®2：30个测试/盒。

－ELISA方法检测IgG抗体:MACE®1:GPIIb/IIIaandHLA-I。MACE®2:GPIa/IIa、Ib/IX、IV。MACE®实验操作与原理1

洗涤PLT,制备50%PLT悬液.2PLT与患者血清或血浆在管内发生反应,若有相应抗体,则结合到PLT上形成复合分子.3

洗涤去掉其中未结合的Ig.4

裂解PLT,游离出抗原-抗体复合分子.5

加裂解液到相应的微孔内,孔壁上包被的抗体可结合(抓获)其中的抗原或抗原-抗体复合分子.6

洗涤,去掉未结合的Ig.7

加酶标二抗(anti-Ig),结合到抗原-抗体复合分子上,形成一条反应链;病人血液中无相应的抗体,则反应链不成立.8

洗涤去掉未结合的二抗.9

加底物显色.10

终止反应,测OD值,判断结果.ELISAforPlateletAntibodyDetectionPAK®PLUS－鉴定针对特异表位的抗体：5份样品/盒。

－ELISA方法检测针对特异表位的抗体(IgG,A,M):PAK®2-LE

－筛查针对常见HPA抗原蛋白的抗体：11份样品/盒。

－ELISA方法检测针对特异表位的IgG抗体:GPIIb/IIIaGPIa/IIaGPIb/IXHLA-I固相红细胞粘附实验（SPRCA）AHG致敏红细胞作为指示细胞CommercialAssay(CaptureP);Rapidtest。敏感性和特异性低。使用完整血小板作为抗原，不能分辨抗体类别主观性比较强，通过红细胞的凝集作为判断标准。试剂有效期短。Capture-P®YYYYYYYYYYYYCapture-P®Aspecificplateletbindingagentiscovalentlyboundto

thewellsbythemanufacturer.孔内包被有血小板特异性结合试剂YYYYYYYYYYYYCapture-P®Paternalplatelets,

donorplatelets,orthe

patient'splateletsare

addedtothewells.孔内加入父母、供者或病人的PLTYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYCapture-P®Thepatient'sserumorantibodyofknownspecificityisaddedto

thewells.孔内加入病人血清或已知的特异性抗体YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYCapture-P®YYYYIndicatorcellsconsistingofredcellswithattachedrabbitanti-humanare

added.添加结合有兔抗人IgG的指示RBCYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYCapture-P®

Inthepresenceof

anti-plateletantibodies,theredcellscoatthewellandahazypatternisseen.阳性反应结果YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYCapture-P®Intheabsenceof

anti-platelet

antibodies,thered

cellsformabuttononthebottomofthewell.阴性反应结果FCA、LuminexandIFA包被珠或Plt与血清孵育洗涤标记抗体与致敏珠子或Plt孵育洗涤荧光镜检或流式检测收集数据Luminex100分析数据靶抗原包被珠或血小板HumanAntibodyFromSeraAnti-HumanIgGConjugate(PE)多态性血小板靶抗原藕联珠Luminex100/200法IaIIaConjugatedBeadsHPA5a(Brb)HPA5b(Bra)IIbIIIaConjugatedBeadsHPA1a(PlA1)/3a(Baka)HPA1b(PlA2)/3a(Baka)HPA1a(PlA1)/3b(Bakb)IbIXConjugatedBeadsHPA2a(Kob)HPA2b(Koa)OtherConjugatedBeadControlBeadsNegative(Albumin)Positive(IgG)ClassIGPIVCD109检测Plt抗体的上市品种GTI:•PAK-PlusTM,PAK-AutoTM,PAK-LX,MACE-1TM,MACE-2TM,

PF4-Enhanced®IMMUCOR:•Capture-PTM,Capture-PReadyScreenTMSTAGO:•HITTMDiaMed:•ID-HAT•HPA-1aTypingBiotest:•Thrombomatch•HPA-1aTyping3、

HLA同种异体抗体不同HLA分子诱导抗体反应的能力不同同种异体免疫的发生和持续不可预测单一HLA分子诱导的抗体能与多种HLA反应(CREGs)有输血史、做过移植和怀过孕的人群，抗HLA-I的阳性率超过1/3.HLA抗体检测与鉴定方法补体依赖直接CDCAHG放大的CDC敏感性不理想仅能检测补体结合抗体固相ELISA（GTI）FlowPRAandspecificitybeadsLuminexliquidarrays敏感能检测补体结合和非结合抗体HLA抗筛方法SensitivityThroughputAutomation