分子生物技术问答题-农大期末考试复习题

分子生物技术问答题-农大期末考试复习题分子生物技术问答题-农大期末考试复习题分子生物技术问答题-农大期末考试复习题xxx公司分子生物技术问答题-农大期末考试复习题文件编号：文件日期：修订次数：第1.0次更改批准审核制定方案设计，管理制度试比较DNA复制与转录的异同点。相同点：都以DNA链作为模板，合成的方向均为5’→3’，聚合反应均遵从碱基配对原则，核苷酸之间形成磷酸二酯键使核苷酸链延伸。不同点：复制转录模板两股链均复制，全部信息模板链，部分信息原料dNTPNTP酶DNA聚合酶RNA聚合酶产物子代双链DNA（半保留复制）mRNA，tRNA，rRNA引物RNA引物无配对G-C;T-AA-U;T-A;C-G简述真核与原核基因转录方面存在的差异。原核生物真核生物RNA聚合酶只有1种。3种，分别转录不同的RNAmRNA结构通常5‘帽子和3’尾巴顺反子功能相近的基因通常形成一个操纵子，由共同的调控区进行转录调控。转录起始不同的聚合酶有不同的启动子调控转录终止在RNA水平发生作用：不依赖ρ因子的终止子在柄部富含GC碱基对，而且连接一串富含U的茎环结构；依赖于ρ因子的终止子通过ρ因子与β亚基的作用促使转录终止。3类RNA聚合酶的转录因子都需要富含AT的序列。简述RNA的种类及其生物学作用。比较真核生物和原核生物mRNA的异同。原核生物和真核生物mRNA的差别在于可翻译顺反子的数目，真核生物的mRNA是单顺反子。而且真核生物的mRNA在其3’末端有多聚腺苷酸尾巴（polyA），而5’末端有7－甲基鸟嘌呤帽子。真核生物的mRNA尾部区域有时会携带特定的去稳定因子。简述真核生物mRNA基因的转录过程。1) 模板识别：RNA聚合酶与双链DNA的启动子开始结合；DNA双链被分开；形成转录泡。2) 转录的起始：RNA中第一个核苷酸键合成；合成前9个核苷酸键时，酶仍旧位于启动子上；聚合酶成功地完成了RNA链的延伸并离开启动子。3) 延伸阶段：延伸阶段包括DNA结构的改变带来的转录泡前移。在转录泡中，模板链的瞬间解旋区与新生的RNA链在延伸点发生配对。RNA聚合酶沿DNA移动，RNA链逐渐延长，酶一边移动一边将DNA解螺旋，使一段新的模板以单链形式暴露出来。核苷酸以共价键形式被添加到RNA链的3’末端，在解旋区形成一个RNA-DNA杂交链。解旋区之后的DNA模板链又与另一条单链DNA配对并形成双螺旋。RNA形成游离的单链。4) 转录的终止：包括对那些不再被加到RNA上的碱基位点进行识别。磷酸二酯键停止形成，转录复合体分离，转录终止。当最后一个碱基加入到RNA链上，转录泡崩解，RNA-DNA杂交被破坏，DNA重新形成双螺旋，聚合酶和RNA都释放下来。简要说明真核生物mRNA的结构特点。真核生物转录的前体RNA如何加工为成熟的mRNA1)5’端加帽子。5’加帽是一个多步加工过程，第一步是鸟苷转移酶将一个鸟苷酸加在5’RNA的前端，产生5’-5’对接的磷酸二酯键。第二步由鸟嘌呤甲基转移酶将一个甲基基团加到嘌呤环的7位氮原子使5’帽子鸟嘌呤转变为7-甲基鸟嘌呤。2)3’端加poly(A)尾巴。在切除前体mRNA3'末端的一段序列后，在poly(A)多聚酶作用下，合成再加上多聚腺苷酸，约250个腺嘌呤核苷酸尾巴。3)内含子的剪接。核mRNA前体含有边界顺序、分枝点序列及其内含子5’端保守序列，本身不能形成二级结构，必需依赖于snRNP(U1,U2,U4,U5和U6)的帮助才能形成剪接体，进行自我剪接，将内含子（intron）去除，而把外显子（exon）连接起来。4)化学修饰。某些碱基进行甲基化等修饰真核生物细胞的RNA内含子剪接的主要方式。简述转录因子的结构特点及其作用。转录因子也称转录激活因子，它们可对转录起始复合物的组装及转录速率施加影响，决定某一基因是否表达，通常有一个标准结构，存在DNA结合域和转录激活结构域。DNA识别或结合域能和特定的基因的启动子区结合，但不能激活基因的转录；转录激活结构域可以在适当的空间激活转录。概括典型原核生物启动子的结构和功能。启动子是与RNA聚合酶结合和转录起始的特殊序列。典型的原核生物启动子大约40个核甘酸并有2个重要的序列。－35区：位于复制起始位点上游35个核甘酸的6个核甘酸序列，能被RNA聚合酶全酶识别并结合。其中，亚基在识别中起重要作用。因为没有亚基的核心酶只能随机地结合在DNA上。－10区：位于－10处的6核甘酸序列。RNA聚合酶松散结合到－35区后，沿着DNA移动到－10区并解链，形成紧密结合的复合体，确保转录方向。保守序列TATAAT。蛋白质合成简述真核与原核核糖体的主要区别是什么？

真核细胞80S核糖体中核糖体蛋白和rRNA数量和体积均比原核细胞70S核糖体的大，其体积约为原核的2倍。真核细胞的大小亚基（即40S与60S）均比原核细胞的的（原核为30S和50S）。在两种细胞的核糖体中，rRNA占绝大部分体积，原核细胞的RNA含量则比真核高。简述真核与原核细胞中翻译起始的主要区别是什么？

原核生物与真核生物翻译起始的主要区别是来自mRNA的本质差异以及小亚基与mRNA起始密码子上游区结合的能力。原核生物mRNA较不稳定，而且是多顺反子，在IF-3介导下，通过16SrRNA的3’末端在核糖体结合位点与小亚基直接结合后，原核细胞翻译起始复合物就装配起来。在真核生物细胞中，需要几种起始因子（eIF44A4B）帮助mRNA的启动，起始复合物才能结合到mRNA帽子上。一旦结合，起始复合物开始向下游区搜索，直至找到第一个AUG密码子。简述蛋白质翻译的基本过程。

(1)氨基酸的活化。氨基酸必须在氨酰-tRNA合成酶的作用下，生成活化氨基酸——AA-tRNA。tRNA与相应氨基酸的结合是蛋白质合成中的关键步骤。（2）翻译的起始。翻译起始需要游离的核糖体亚基。细菌翻译起始分成3步：30S小亚基首先与翻译起始因子IF-1，IF-3结合，通过SD序列与mRNA模板相结合；在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基内的P位，tRNAfMet上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。带有tRNA、mRNA、3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子（或在真核生物中，小亚基首先识别mRNA的5′端，再移动到起始位点，并在这里同大亚基结合。真核生物和原核生物中的翻译起始几乎都是用AUG。起始tRNA是一种不同的类型，但其所带的甲硫氨酸没有被甲酰化，称为tRNAiMet）。(3)翻译的延伸。生成起始复合物、第一个AA与核糖体结合以后，肽链开始伸长。按照mRNA模板密码子的排列，AA通过新生肽键的方式被有序地结合上去。肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括AA-tRNA与核糖体的结合、肽键的生成和移位。(4)肽链的终止。终止密码子不能被tRNA识别。从最后一个tRNA上释放完整的多肽链，将tRNA从核糖体上逐除出，核糖体与mRNA解离，核糖体解体。简述蛋白质跨膜运输的机制。蛋白质的合成靠什么维持其合成的忠实性？

密码子的兼并性和专一性；密码子与反密码子正确配对；氨酰-tRNA的高度特异性；校正作用。概括典型原核生物启动子的结构和功能。

启动子是与RNA聚合酶结合和转录起始的特殊序列。典型的原核生物启动子大约40个核甘酸并有2个重要的序列。－35区位于复制起始位点上游35个核甘酸的6个核甘酸序列，能被RNA聚合酶全酶识别并结合。其中，亚基在识别中起重要作用。因为没有亚基的核心酶只能随机地结合在DNA上。－10区位于－10处的6核甘酸序列。RNA聚合酶松散结合到－35区后，沿着DNA移动到－10区并解链，形成紧密结合的复合体，确保转录方向。保守序列TATAAT。简述乳糖操纵子的负调控模式。

乳糖操纵子中结构基因包括LacZ、LacY、LacA，结构基因前启动子P与操作子O相邻。无诱导物时阻遏蛋白与O结合后阻止RNA聚合酶与P的结合，从而抑制结构基因的转录；当有诱导物时，诱导物与阻遏蛋白结合，改变阻遏蛋白的构型使阻遏蛋白从O上解离，进而使RNA聚合酶结合P，结构基因转录。弱化作用如何调控中色氨酸操纵子的表达。

弱化作用是根据tRNATrp的数量去调节Trp操纵子的表达，而tRNATrp的数量又取决于细胞中Trp的水平。Trp操纵子mRNA前导序列很长，包括了编码一个长14个氨基酸多肽所需的全部信息。这个多肽简述乳糖操纵子的结构和调控过程。

三个乳糖的结构基因，其中lacZ编码β-半乳糖苷酶，能催化β-半乳糖苷水解；lacY编码β-半乳糖苷透性酶，将β-半乳糖苷转入细胞；LacA编码β-半乳糖苷转乙酰基酶。调控基因LacI基因表达产物称为阻遏蛋白(Repressor)，它的功能是阻止结构基因的表达。操纵基因（o）位于启动子(p)和结构基因(lacZYA)之间。阻遏蛋白和操纵基因结合时，能阻止RNA聚合酶在启动子(p)上的转录。1）无诱导物（如乳糖）时，使乳糖操纵子处于失活状态；2）加入诱导物（如乳糖）后，它与阻遏蛋白结合，起始转录乳糖代谢的3个结构基因lacZYA。简述转录因子的结构特点及其作用。

转录因子也称转录激活因子，它们可对转录起始复合物的组装及转录速率施加影响，决定某一基因是否表达，通常有一个标准结构，存在DNA结合域和转录激活结构域。DNA识别或结合域能和特定的基因的启动子区结合，但不能激活基因的转录；转录激活结构域可以在适当的空间激活转录。当培养基中同时存在葡萄糖和半乳糖时，请说明大肠杆菌乳糖操纵子的基因表达情况。

三个乳糖的结构基因，其中lacZ编码β-半乳糖苷酶，能催化β-半乳糖苷水解；lacY编码β-半乳糖苷透性酶，将β-半乳糖苷转入细胞；LacA编码β-半乳糖苷转乙酰基酶。调控基因LacI基因表达产物称为阻遏蛋白(Repressor)，它的功能是阻止结构基因的表达。操纵基因（o）位于启动子(p)和结构基因(lacZYA)之间。阻遏蛋白和操纵基因结合时，能阻止RNA聚合酶在启动子(p)上的转录。1）当大肠杆菌培养基同时存在葡萄糖和半乳糖时，大肠杆菌优先利用葡萄糖，乳糖操纵子处于关闭状态。直至培养基中的葡萄糖用完，乳糖操纵子的基因才开始转录表达，利用乳糖。2）培养基中的葡萄糖用完后，半乳糖与阻遏蛋白结合，起始转录乳糖代谢的3个结构基因lacZYA。反式作用因子有几大类每一类的特征是什么作为基因表达的重要调节原件，增强在通常具有什么特征在分离DNA过程中，为什么苯酚和氯仿联合使用即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次？

提示：原因是酚和水有一定程度的互溶，所以单独使用酚抽提DNA，最终不能除去酚，残留的酚会使限制性核酸内切酶、Taq酶和连接酶变性，影响后续试验。氯仿也是蛋白质变性剂，它不与水互溶，但它与苯酚互溶。这样，两者联合使用，可让DNA溶液中没有残留酚。比较说明SDS（SDS-聚丙烯胺凝胶电泳）与琼脂糖凝胶电泳的分离原理和特点。

提示：SDS：1）SDS作用；2）分子筛；3）主要用于蛋白质的定性分析、分离。琼脂糖凝胶电泳：1）凝胶的孔径；2）用于蛋白质和核酸电泳，双链DNA的电泳迁移率主要与其分子大小有关。简述PCR扩增的原理及过程。

提示：PCR技术的基本原理：在模板、引物、4种dNTP和赖耐热DNA聚合酶存在的条件下，按照碱基互补配对的原则，特异扩增DNA区段。PCR的过程：变性--退火--延伸，三个基本步骤循环。什么是蓝白斑筛选为什么蓝白斑筛选法也会有假阳性？

提示：该法是利用组织化学的方法，通过插入失活来筛选重组体。原因是：β-半乳糖苷酶的N端不是必须的，对其修饰不会影响酶的活性或α肽的互补性。如果插入的外源片断引起α肽ORF的移码，或外源片断含有终止密码使得α肽不表达，就会形成白色斑。如果插入的片断不含终止密码、是3的倍数，仍然会形成蓝色斑。酵母单杂交的原理。

很多真核转录调控因子有两个相互独立的结构域组成：DNA结合域（DNAbindingdomain,BD）和转录激活域(activationdomain,AD)。BD能和特定的基因的启动子区结合，但不能接获基因的转录。

酵母单杂交是一种研究DNA和蛋白质互相作用的系统，运用基因重组技术将特定顺式作用元件构建到基本启动子上游，把报告基因连接到基本启动子下游。

将待测转录因子cDNA与已知酵母激活域（AD）融合表达载体转入酵母，如果待测转录因子能和顺式作用元件结合，就能激活基本启动子，从而激活报告基因的表达。现已知一种蛋白因子可以与DNA上的一段100bp的专一序列结合，请设计出克隆这种蛋白因子的cDNA的基本技术路线。

提示：酵母单杂方法。从GenBank中查到某一基因的cDNA序列，如何得到该基因的内含子序列？

提示：根据cDNA序列设计引物，以基因组DNA为模板PCR，产物测序后，序列比对。从GenBank中查到某一基因的完整ORF序列，如何得知其mRNA的加帽和加尾信息

提示：5’-RACE和3’-RACE。转录因子一般具有转录激活域和DNA结合域，简述它们的作用。

DNA识别或结合域能和特定的基因的启动子区结合，但不能接获基因的转录。对各种转录因子的序列进行比较，可发现其基序(motif)的共同点是都与DNA结合。基序通常很短，仅为蛋白质结构中的一小部分。在蛋白质与转录装置相互作用中，负责激活转录的基序可以被鉴定出来。

转录激活结构域可以在适当的空间激活转录。简述凝胶阻滞试验（EMSA）的原理。

EMSA是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术，用放射性同位素标记待测DNA片段，然后与提取物温育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否结合。基本原理：

蛋白质与DNA结合后，将大大增加DNA分子量，在凝胶电泳中，DNA朝正电极移动的距离与其相对分子量成正比。没有结合蛋白质的DNA移动较快，结合了蛋白质的DNA由于受到阻滞移动较慢。现在已知一个基因的启动子序列（包括其顺式作用元件和基本启动子），如何找到调控该基因表达的反式作用因子？

提示：有多种方案。EMSA是其一。简述sangerDNA测序法的原理和基本过程。

双脱氧测序法原理：2',3'-ddNTP与普通dNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基，可以在DNA聚合酶作用下通过其5'三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于没有3'羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的DNA链不可能继续延伸。

核酸模板在核酸聚合酶、引物、4种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管独立的酶反应系统中分别按比例引入4种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。

如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。基本过程：

1）分离待测核酸模板，模板可是DNA，也可是RNA，可是双链，也可是单链。

2）在4只试管中分别加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP，例如32P标记的dATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。

3）与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。

4）用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA3’末端都为同一种双脱氧碱基。

5）放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。如何用PCR法获得点突变DNA分子？

指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。

采用具有互补末端的引物，使产物形成了重叠链从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。该技术主要包括以下几步：设计引物，扩增基因两端，回收两端片段，两端片段退火延伸，扩增全长基因。实验步骤：

1）引物设计：引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配，否则后续实验很难成功），突变点可以设计在Fm或Rm，也可以两条引物上都有突变点；

2）分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对用pfu酶进行PCR；

3）分别用胶准确回收第2步所得两条目的PCR产物带；

4）将第3步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶进行5-10轮PCR。

5）取第4步PCR产物做为模板，加入引物F及R进行PCR扩增出具有突变的全基因。什么是RNAi试述其应用和发展前景。

RNAi(RNAinterference)即RNA干涉，是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。或是RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。应用：

1）RNAi方法在植物遗传及发育等研究领域得到广泛的应用。通过基因敲除来调控某个代谢途径的关键基因，筛选出目的性状改良的个体，如抗病或耐旱植株。Gutterson等敲除了康乃馨的一种激素，使花期延长。多聚半乳糖醛激酶在西红柿成熟时消化细胞壁，Zenera实验室将它敲除后，西红柿可晚一些采摘，味道变得更为鲜美。

2）RNAi是研究候选基因功能、信号转导通路的新方法。从大规模数据库中获得全基因组序列，找到感兴趣基因的序列，据此设计出使该基因沉默的dsRNA，研究该候选基因沉默或下调后的性状表现，从而探讨该候选基因的功能。Clemens等应用RNAi亦研究了果蝇细胞系中胰岛素的信号转导通路。获得一个功能未知的基因克隆后，怎样才能阐述该基因的功能？

提示：对此基因进行定位，运用基因敲除或RNAi技术封闭此基因，寻找蛋白表达的差异和生物体遗传表型的差异，通过研究荧光探针定位此蛋白的分布，通过研究蛋白与蛋白相互作用确定其在细胞中的功能。如果知道某基因的功能及其相应得蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因？

提示：可以通过合成核苷酸探针或设计兼并PCR引物从基因组文库（或cDNA）文库中筛选。或者利用相应的抗体从cDNA表达文库中筛选相应的克隆。常用的基因表达研究技术有哪些？

什么是遗传图谱？

答案1：遗传图又称为连锁图，是指标志基因或DNA在染色体上的相对位置与遗传距离，后者通常以基因或DNA片段在染色体交换过程中的分离频率（厘摩，cM）来表示，cM值越大，两者之间距离越远。遗传图的绘制方法是以染色体上某一点为遗传标记，以与之相伴的遗传特征为对象，经连锁分析，测定遗传距离，将编码该特征的基因定位于染色体特定位置。连锁分析的实质是通过分析同一遗传位点在不同个体中等位基因的不同来研究同一染色体上两个位点之间的相互关系，科学上用减数分裂过程中这两个位点之间的交换或重组频率来表示其遗传学距离。

答案2：通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即每次减数分裂的重组频率为1%)来表示。绘制遗传连锁图的方法有很多，但是在DNA多态性技术未开发时，鉴定的连锁图很少，随着DNA多态性的开发，使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态性标志有RFLP(限制性酶切片段长度多态性)、RAPD(随机引物扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)；80年代后出现的有STR(短串联重复序列，又称微卫星)DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP（单个核苷酸的多态性）分析。什么是物理图谱？

答案1：物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段（序列标签位点，即STS