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不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案核酸提取攻略北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路15号）不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案核酸不同样品RNA提取最适方法RNA纯度与质量考察RNA提取常见问题及解决方案常见样品DNA提取特殊样品DNA提取DNA分离纯化中常见问题分析内容概要不同样品RNA提取最适方法内容概要样品裂解液上层溶液液氮研磨或其他方法处理抽提细胞裂解干燥溶解或洗脱离心洗涤酒精沉淀或介质吸附RNA提取流程样品裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉沉淀法：异丙醇或乙醇介质吸附法：RNA提取常用方法沉淀方法吸附材料原理硅基质高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附并携带RNA沉淀法：异丙醇或乙醇RNA提取常用方法沉淀方法吸附材料异硫氰酸胍/苯酚法在变性剂异硫氰酸胍的作用下，细胞被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。RNA提取常用方法裂解方式胍盐/β-巯基乙醇盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性；β-巯基乙醇变性蛋白异硫氰酸胍/苯酚法RNA提取常用方法裂解方式胍盐/βBioTeke的RNA提取试剂具有明显的优势在经典试剂的基础上，不断升级。多款高品质的RNA提取试剂：Tripure（Trizol）RNApure（Trizol法的升级产品）BioTeke的RNA提取试剂具有明显的优势在经典试剂的基础组织/细胞样品RNA提取材料：

小鼠肝脏组织方法：

BioTeke

RNApure高纯总RNA快速提取试剂盒0.1g样品组织结果：

图：小鼠肝脏组织RNA1234组织/细胞样品RNA提取材料：方法：图：小鼠肝脏组织RNARNApure高纯总RNA快速提取试剂123图片说明：1BioTekeRNAclean2BioTekeTRIpure(TRIzol法)3BioTekeRNApure离心柱型(注：本图实验材料为植物叶片）RNApure高纯总RNA快速提取试剂1同一样品基因组DNA和RNA分提原理：根据基因组DNA和RNA在硅基质膜上的结合条件不同，用两根离心吸附柱分别提取基因组DNA和RNA。同一样品基因组DNA和RNA分提原理：特殊样品RNA提取血液图1全血样品溶解在TRIpureLSReagent试剂后的状态图2泳道1与2，在-80度保存一个月后的提取结果。M泳道：标准的Hela细胞RNA特殊样品RNA提取血液图1全血样品溶解在TRIpur材料：

松针、冬青、香蕉、木菠萝和杨树方法：

通用植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）0.1g样品组织结果：

得率：约35-40μg

纯度：OD260/OD280＝1.82-1.95

12345678910图片说明：1、2杨树；3、4香蕉；5、6松针；7、8冬青；9、10木菠萝

多糖多酚植物样品RNA的提取12345678910试剂盒适用范围：

水稻种子、小麦种子、玉米种子、高粱种子、拟南芥种子、大豆种子、苹果、葡萄、香蕉、棉花、龙眼、荔枝、各种草坪牧草植物、各种树木、各种花卉等绝大多数植物材料：方法：123456图片说明：1、2DNA和大RNA；3、4MicroRNA(材料为小鼠肝脏组织)MicroRNA提取1234提取原理：传统方法：先提取总RNA然后跑胶回收或沉淀MicroRNA。新方法：通过裂解液裂解和酸酚分层后过柱两次，一次去除基因组DNA和大片段RNA，后一次吸附MicroRNA，然后漂洗收集。新方法特点：高效分离小RNA，同时分离总RNA可用于miRNA、siRNA和snRNA的分析适用各种来源的样品提取时间短，约30分钟完成实验图片说明：1、2DNA和大RNA；3、4MicroRNA生物大分子具有共轭双键，在260和280nm波长处有光吸收峰。纯度：紫外分光光度计测定所提总RNA在260nm和280nm波长处的光吸收，以A260/A280的比值来判断总RNA的纯度。质量：甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。RNA纯度与质量考察生物大分子具有共轭双键，在260和280nm波长处有光吸收峰RNA提取常见问题及解决方案RNA的降解OD260/OD280比值偏低电泳带型异常下游实验效果不佳RNA提取常见问题及解决方案RNA的降解新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。RNA的降解新鲜细胞或组织：RNA的降解冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，研磨过程中及时补充液氮。RNA的降解冷冻样品：RNA的保护采集样品的保护：通常用液氮保存样品保护剂RNAfixer,样品浸泡其中可以在37℃保存一天，25℃一周，4℃一个月，-20℃一年左右。环境中RNase的清除：DEPC处理各种实验器具RNAsafe对溶液中RNase进行清除。RNA酶喷雾清除剂，可对固体表面的RNase起到清除的作用，更大程度上避免RNase的污染。RNA的保护采集样品的保护：环境中RNase的清除：蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260/OD280比值偏低蛋白质污染：OD260/OD280比值偏低OD260/OD280比值偏低抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并且彻底去掉75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.10-0.50之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD时，对照及样品稀释液请使用10mMTris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。OD260/OD280比值偏低非变性电泳：上样量超过3μg，电压超过6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致28S和18S条带分不开。变性电泳条带变淡：

EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。电泳条带异常电泳条带异常抽提试剂的残留75%乙醇洗涤样品中杂质的残留多糖等杂质，再次沉淀DNA污染使用RNase-Free的DNaseI消化抽提RNA下游实验效果不佳（RNA降解）下游实验效果不佳（RNA降解）不同样品基因组DNA提取常见样品基因组DNA提取细胞/组织/细菌/血液基因DNA提取植物材料DNA提取特殊样品基因组DNA提取大量血液样品DNA提取环境微生物DNA提取临床样本DNA提取DNA分离纯化中的常见问题分析不同样品基因组DNA提取常见样品基因组DNA提取基因组DNA提取流程基因组DNA提取流程化学方法CTAB法：适用于植物材料等。是一种阳离子去污剂，溶解细胞膜，与核酸结合。在高盐下溶解释放DNA。SDS法：适用于血液，细胞，动物组织，细菌，酵母等物理方法机械剪切，超声波破碎，研磨匀浆等。易造成DNA断裂。酶法

蛋白酶KBioTeke基因组DNA提取系列试剂盒综合利用上述方法基因组DNA提取流程-细胞裂解化学方法基因组DNA提取流程-细胞裂解特点：不需要使用有毒的氯仿、苯酚等试剂多次柱漂洗确保高纯度；长度可达30-50Kb提取原理：组织/细胞/细菌/血液基因组DNA提取特点：提取原理：组织/细胞/细菌/血液基因组DNA提取玉米叶片基因组DNA提取（使用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒）提取原理：植物材料基因组DNA提取玉米叶片基因组DNA提取提取原理：植物材料基因组DNA提取特殊样品基因组DNA提取传统方法适用于所有材料基因组DNA的提取？比如大量血液？比如土壤/粪便中的微生物基因组DNA的提取？比如病毒及其他微量样品DNA的提取？

NO！特殊样品基因组DNA提取传统方法适用于所有材料基因组DNA的中量/大量血液基因组DNA提取传统方法消化后，用酚/氯仿抽提，时间长，损害操作人员健康BioTeke创新

不用蛋白酶消化不用酚/氯仿抽提结果：

得率：约75-250μg/5mL血样纯度：OD260/OD280＝1.87-1.955ml全血基因组DNA提取电泳结果中量/大量血液基因组DNA提取传统方法5ml全血基因组DNA土壤/粪便微生物基因组DNA提取其他品牌试剂盒存在缺点：采用玻璃珠或钢珠破碎，导致基因组断裂严重；必须购买破碎专用设备，增加使用成本；采用包括玻璃奶、离心吸附柱串联的纯化方式，导致DNA大量损失，得率很低，很难真实反映土壤微生物的多样性。BioTeke的技术创新：采用酶法破碎，保证基因组的完整性；用异丙醇沉淀DNA，DNA无损失。厂家破碎方式纯化方式提取时间是否需要专门设备BioTeke酶法破碎基因组完整离心柱吸附杂质纯度高1小时内不需要Q公司钢珠破碎基因组断裂玻璃奶同离心柱结合得率低2小时需要M公司玻璃珠破碎基因组断裂离心柱纯化得率较低2小时需要土壤/粪便微生物基因组DNA提取其他品牌试剂盒存在缺点：厂家临床样品基因组DNA提取病毒基因组DNA提取酵母基因组DNA提取口腔拭子DNA提取微量样品DNA提取石蜡组织DNA提取头发DNA提取临床样品基因组DNA提取病毒基因组DNA提取一步法DNA提取扩增原理：综合微量样品基因组DNA提取和高效的PCR扩增试剂。从毛发、石蜡组织等微量组织中高效提取足够浓度的DNA，然后进行PCR扩增。操作简单、方便，可对大量样品同时进行操作。一步法DNA提取扩增原理：保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存基因组DNA分离纯化中的注意事项保证基因组DNA的完整性和纯度基因组DNA分离纯化中的注意事保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存基因组DNA分离纯化中的注意事项简化操作步骤，缩短操作时间减少物理因素对DNA的降解，震荡、搅拌等减少化学物质对DNA的降解，操作多在pH4-10防止基因组DNA的生物降解：DNase保证基因组DNA的完整性和纯度基因组DNA分离纯化中的注意事保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存基因组DNA分离纯化中的注意事项洗脱液65度预热10分钟洗脱体积不小于30μL洗脱2次或者3次保证基因组DNA的完整性和纯度基因组DNA分离纯化中的注意事保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存基因组DNA分离纯化中的注意事项可长期储存于pH=7.0的ddH2O或TE不易制成干品储存分装低温保存保证基因组DNA的完整性和纯度基因组DNA分离纯化中的注意事如何提高微量核酸提取或回收后的浓度核酸助沉剂的应用微量吸附柱的应用15μl洗脱体系质粒提取胶回收或PCR产物回收微量细胞/组织DNA/RNA提取病毒DNA/RNA提取微量临床样本DNA/RNA提取如何提高微量核酸提取或回收后的浓度核酸助沉剂的应用不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案Real-timeqPCR攻略北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路15号）不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案ReRT-PCR原理Real-timeqPCR原理及应用Real-timeqPCR成功关键Real-timeqPCR数据分析Real-timeqPCR常见问题及解决方案主要内容RT-PCR原理主要内容中心法则与RT、PCRRNADNARTPCR中心法则与RT、PCRRNADNARTPCR逆转录反应可以以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。提取RNA的质量会影响到RT的产量及cDNA的完整性。整个过程要求无RNA酶操作。反转录酶、RNA酶抑制剂都会对产物的质量造成一定的影响。反转录相关因素反转录相关因素SuperM-MLV反转录酶高效的逆转录活性，且无RNaseH活性ThermoM-MLV反转录酶高效的逆转录活性，且无RNaseH活性适合合成长片段的cDNA,有很强的模板兼容性，对高GC含量（75%以上）和结构复杂的模板效果显著在42℃-60℃具有较好的热稳定性。SuperM-MLV反转录酶OnestepRT-PCR模板：使用BioTeke公司的RNApure总RNA提取试剂盒提取的鸡肝脏组织RNA

目的片段：管家基因β-Actin反应体系：

反应程序：

OnestepRT-PCR模板：目的片段：管家基因β-ART-PCR相关产品SuperM-MLV反转录酶，10000u/198元SuperRTKitcDNA第一链合成试剂盒50次，特价490元SuperOne-stepRT-PCRKit一步法RT-PCR试剂盒50次，特价880元Thermo系列产品买二赠一！ThermoM-MLV反转录酶，10000u/580元ThermoRTKitcDNA第一链合成试剂盒50次，价格1200元ThermoOne-stepRT-PCRKit一步法RT-PCR试剂盒50次，价格1400元反转录酶及试剂盒系列产品讲座期间特价优惠！RT-PCR相关产品SuperM-MLV反转录酶，1000RT-PCR原理Real-timeqPCR原理及应用Real-timeqPCR成功关键Real-timeqPCR数据分析Real-timeqPCR常见问题及解决方案RT-PCR原理实时荧光定量PCR技术的应用基因表达差异分析拷贝数分析SNP检测miRNA定量转基因成分定量分析临床诊断、疾病及药物研发等实时荧光定量PCR技术的应用基因表达差异分析Real-timeqPCR原理如何对初始模板定量荧光信号如何产生？Real-timeqPCR原理如何对初始模板定量Real-TimeqPCR主要概念实时定量PCR非探针化学原理探针两个重要图形扩增曲线熔解曲线Real-TimeqPCR主要概念实时定量PCR非探针化学Real-TimeqPCR曲线的意义扩增曲线熔解曲线图片为：首都医科大学演示实验结果材料：小鼠肝脏基因：β-actinReal-TimeqPCR曲线的意义扩增曲线熔解曲线图片为实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种。非探针类则是利用荧光染料（如SYBRGreenI）或者特殊设计的引物(如LUXPrimers)来指示扩增的增加。探针类(TaqMan探针和

分子信标)是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。后者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但前者则简便易行。荧光染料和荧光探针实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种。荧SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI是LUX(lightuponextention)引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物3’

端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。LUX引物工作原理LUX(lightuponextention)引物是TaqMan探针工作原理FQPrimerFQPrimerDegradationofTaqManprobebyDNApolymeraseFQReporterQuencherSuppressionoffluorescenceTaqMan探针工作原理FQPrimerFQPrimerDe分子信标（molecularbeacon）工作原理分子信标：一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子（图5）。分子信标（molecularbeacon）工作原理分子荧光阈值(Threshold)CtCt值是扩增DNA的量达到阈值时候的循环次数。荧光阈值(Threshold)CtCt值是扩增DNA的量达Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。Ct值Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板Real-timeqPCR流程Real-timeqPCR流程一步法两步法优点节省时间稳定性好减少污染灵敏度高定量相对准确缺点灵敏度稍差稳定性稍差操作稍复杂一步法和两步法优缺点比较根据自己需求，选择合适的方法！一步法两步法优点节省时间稳定性好减少污染灵敏度高定量相对准确RT-PCR原理Real-timeqPCR原理及应用Real-timeqPCR成功关键Real-timeqPCR数据分析Real-timeqPCR常见问题及解决方案RT-PCR原理Real-timeqPCR成功因素引物设计：

3’末端尽量不是A；18－24bp；扩增产物80-150bp;设计在基因保守区内

Taqman探针：尽量靠在上游引物；长度30－45bp，Tm比引物高至少5℃；5’端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量RNA质量和定量

比较好，2条主带可见（28s和18s）；定量准确内标（housekeepinggene）正确选择18srRNA,ß-actin,GAPDH等

标准曲线的准确制作R2＝0.99Real-timeqPCR成功因素引物设计：反应体系：模板浓度不要太高，反转录最多1µg总RNA，PCR一般1µL反转录产物；引物浓度一般100nM-1mM；根据kit要摸索最佳反应条件小心操作：每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样，即使是混合液！每个样品至少要做3个平行孔。每组实验最好有3个重复，做统计分析。Real-timeqPCR成功因素做real-timeqRT-PCR前，做个普通的PCR，检测您的反应条件！反应体系：Real-timeqPCR成功因素做real-tRT-PCR原理Real-timeqPCR原理及应用Real-timeqPCR成功关键Real-timeqPCR数据分析Real-timeqPCR常见问题及解决方案RT-PCR原理Real-timeqPCR数据分析基线（baseline）通常是3－15个循环的荧光信号同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线阈值（threshold)自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。Ct值:与起始浓度的对数成线性关系分析定量时候一般取Ct:15-35.太大或者太小都会导致定量的不准确。Real-timeqPCR数据分析基线（baseline）统计分析方法绝对定量：此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。

相对定量：通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,一般是

2-Ct。或者是考虑扩增效率的Pfaffl法。统计分析方法绝对定量：绝对定量绝对定量相对定量MarisaL.WongandJuanF.Medrano:BioTechniquesJuly2005相对定量MarisaL.WongandJuanF.相对定量相对定量实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高（Taqman）精确定量Real-timeqRT-PCR优点实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测Real-timeRT-PCR原理Real-timeqPCR原理及应用Real-timeqPCR成功关键Real-timeqPCR数据分析Real-timeqPCR常见问题及解决方案RT-PCR原理特异性

重复性

灵敏度其他问题常见问题讨论特异性常见问题讨论扩增的特异性引物？Tm，重新设计引物，优化条件Tm扩增的特异性引物？Tm，重新设计引物，优化条件Tm重复性判断实验优劣的重要指标判断指标：主要为标准差（SD）和变异系数（CV）影响重复性的因素：PCR反应扩增的效率：优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率。目的基因的初始浓度：使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔。标准曲线的影响：不少于5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围；理想的标准品应与样本具有高同源性，质粒DNA或是体外合成、转录的RNA。重复性判断实验优劣的重要指标影响灵敏度的因素反应体系中形成的引物二聚体的影响

可以用水解探针代替SYBRGreenI，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBRGreenI高出10倍。可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶要尽可能地优化引物设计如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。循环数

Mg2＋的浓度

影响灵敏度的因素反应体系中形成的引物二聚体的影响Q1:无Ct值（信号）出现可能性不大检测荧光信号的步骤有误:一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。Q1:无Ct值（信号）出现可能性不大检测荧光信号的步骤有误:Q2:Ct值出现过晚（Ct＞38）扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。Q2:Ct值出现过晚（Ct＞38）扩增效率低:反应条件Q3:标准曲线的线性关系不佳加样存在误差:

使得标准品不呈梯度。标准品出现降解:应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针模板中存在抑制物，或模板浓度过高。Q3:标准曲线的线性关系不佳加样存在误差:使得标准品不Q4:阴性对照也出现明显的起飞反应mix或水被污染。引物二聚体的出现：用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。反应过程中探针的降解：用PAGE电泳对探针进行检测。ROX校正的问题：如果使用了，则可能是ROX的降解所造成。Q4:阴性对照也出现明显的起飞反应mix或水被污染。Q5:熔解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。Q5:熔解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体Q6:扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。Q6:扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。Q7:同样的试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何比较？判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性Q7:同样的试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何比较BioTeke产品—从根本上解决您的实验问题荧光定量PCR试剂盒系列产品讲座期间特价优惠！2×SYBRreal-timePCRpremixture荧光定量PCR试剂盒200次，特价890元2×SYBRreal-timeRT-PCRpremixture反转录荧光定量PCR试剂盒50次，特价1090元One-stepSYBRreal-timeRT-PCRKit一步法荧光定量试剂盒50次，特价1200元BioTeke产品—从根本上解决您的实验问题荧光定量PCR试BioTekeReal-timeqPCR产品可用于各种仪器ABI:PRISM7000/7700/7900HT,7300/7500Bio-Rad:DNAEngineOption/DNAEngineOption2/Chromo4RealtimeSystem,iCyclerIQ/MyiQ/iQ5Stratagene:Mx3000P/Mx3005PRoche:LightcyclerBioer:Line-Gene其他各种real-timeqPCR扩增仪ROX参考染料：在荧光检测中标准化非PCR相关的震荡；在qPCR中提供一个稳定的基线BioTekeReal-timeqPCR产品可用于各种仪BioTekeReal-timeqPCR产品反应程序两步扩增反应Real-timeqPCR:循环数Step温度时间检测说明1195℃2minOff起始模板预变性35-45195℃15secOff模板变性260-68℃20-60secOn退火/延伸三步扩增反应Real-timeqPCR:循环数Step温度时间检测说明1195℃2minOff起始模板预变性35-45195℃10-20secOff模板变性255-65℃10-20secOff退火372℃20-60secOn延伸BioTekeReal-timeqPCR产品反应程序两步溶解程序：（dissociationprogram),扩增反应完成后的最后一步，检测扩增反应的特异性。不同仪器要求的程序稍微不同。ABI7000的溶解程序：BioTekeReal-timeqPCR产品反应程序循环数Step温度时间检测1End55-65℃10-20secOnEnd95℃10-20secOff溶解程序：（dissociationprogram),扩增BioTeke产品应用实例最权威的声音来源于实践目前应用最广泛的主流仪器：ABI系列及Bio-Rad系列。来自Bio-Rad系列的检验报告。来自ABI系列的检验报告。我们都做得很好，我们一直在不断创新，力求解决您的实验需求。BioTeke产品应用实例最权威的声音来源于实践目前应不同公司荧光定量试剂比较T公司BioTeke不同公司荧光定量试剂比较T公司BioTeke不同样品核酸提取扩增荧光定量PCR完美解决方案不同样品核酸提取扩增荧光定量PCR完美解决方案不同样品核酸提取扩增荧光定量PCR完美解决方案不同样品核酸提取扩增荧光定量PCR完美解决方案不同样品核酸提取扩增荧光定量PCR完美解决方案不同样品核酸提取扩增荧光定量PCR完美解决方案不同样品核酸提取扩增荧光定量PCR完美解决方案不同样品核酸提取扩增荧光定量PCR完美解决方案百泰克让您的实验更完美选择BioTeke，选择信任与回馈百泰克让您的实验更完美选择BioTeke，选择信任与回馈

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小鼠肝脏组织方法：

BioTeke

RNApure高纯总RNA快速提取试剂盒0.1g样品组织结果：

图：小鼠肝脏组织RNA1234组织/细胞样品RNA提取材料：方法：图：小鼠肝脏组织RNARNApure高纯总RNA快速提取试剂123图片说明：1BioTekeRNAclean2BioTekeTRIpure(TRIzol法)3BioTekeRNApure离心柱型(注：本图实验材料为植物叶片）RNApure高纯总RNA快速提取试剂1同一样品基因组DNA和RNA分提原理：根据基因组DNA和RNA在硅基质膜上的结合条件不同，用两根离心吸附柱分别提取基因组DNA和RNA。同一样品基因组DNA和RNA分提原理：特殊样品RNA提取血液图1全血样品溶解在TRIpureLSReagent试剂后的状态图2泳道1与2，在-80度保存一个月后的提取结果。M泳道：标准的Hela细胞RNA特殊样品RNA提取血液图1全血样品溶解在TRIpur材料：

松针、冬青、香蕉、木菠萝和杨树方法：

通用植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）0.1g样品组织结果：

得率：约35-40μg

纯度：OD260/OD280＝1.82-1.95

12345678910图片说明：1、2杨树；3、4香蕉；5、6松针；7、8冬青；9、10木菠萝

多糖多酚植物样品RNA的提取12345678910试剂盒适用范围：

水稻种子、小麦种子、玉米种子、高粱种子、拟南芥种子、大豆种子、苹果、葡萄、香蕉、棉花、龙眼、荔枝、各种草坪牧草植物、各种树木、各种花卉等绝大多数植物材料：方法：123456图片说明：1、2DNA和大RNA；3、4MicroRNA(材料为小鼠肝脏组织)MicroRNA提取1234提取原理：传统方法：先提取总RNA然后跑胶回收或沉淀MicroRNA。新方法：通过裂解液裂解和酸酚分层后过柱两次，一次去除基因组DNA和大片段RNA，后一次吸附MicroRNA，然后漂洗收集。新方法特点：高效分离小RNA，同时分离总RNA可用于miRNA、siRNA和snRNA的分析适用各种来源的样品提取时间短，约30分钟完成实验图片说明：1、2DNA和大RNA；3、4MicroRNA生物大分子具有共轭双键，在260和280nm波长处有光吸收峰。纯度：紫外分光光度计测定所提总RNA在260nm和280nm波长处的光吸收，以A260/A280的比值来判断总RNA的纯度。质量：甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。RNA纯度与质量考察生物大分子具有共轭双键，在260和280nm波长处有光吸收峰RNA提取常见问题及解决方案RNA的降解OD260/OD280比值偏低电泳带型异常下游实验效果不佳RNA提取常见问题及解决方案RNA的降解新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。RNA的降解新鲜细胞或组织：RNA的降解冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，研磨过程中及时补充液氮。RNA的降解冷冻样品：RNA的保护采集样品的保护：通常用液氮保存样品保护剂RNAfixer,样品浸泡其中可以在37℃保存一天，25℃一周，4℃一个月，-20℃一年左右。环境中RNase的清除：DEPC处理各种实验器具RNAsafe对溶液中RNase进行清除。RNA酶喷雾清除剂，可对固体表面的RNase起到清除的作用，更大程度上避免RNase的污染。RNA的保护采集样品的保护：环境中RNase的清除：蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260/OD280比值偏低蛋白质污染：OD260/OD280比值偏低OD260/OD280比值偏低抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并且彻底去掉75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.10-0.50之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD时，对照及样品稀释液请使用10mMTris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。OD260/OD280比值偏低非变性电泳：上样量超过3μg，电压超过6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致28S和18S条带分不开。变性电泳条带变淡：

EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。电泳条带异常电泳条带异常抽提试剂的残留75%乙醇洗涤样品中杂质的残留多糖等杂质，再次沉淀DNA污染使用RNase-Free的DNaseI消化抽提RNA下游实验效果不佳（RNA降解）下游实验效果不佳（RNA降解）不同样品基因组DNA提取常见样品基因组DNA提取细胞/组织/细菌/血液基因DNA提取植物材料DNA提取特殊样品基因组DNA提取大量血液样品DNA提取环境微生物DNA提取临床样本DNA提取DNA分离纯化中的常见问题分析不同样品基因组DNA提取常见样品基因组DNA提取基因组DNA提取流程基因组DNA提取流程化学方法CTAB法：适用于植物材料等。是一种阳离子去污剂，溶解细胞膜，与核酸结合。在高盐下溶解释放DNA。SDS法：适用于血液，细胞，动物组织，细菌，酵母等物理方法机械剪切，超声波破碎，研磨匀浆等。易造成DNA断裂。酶法

蛋白酶KBioTeke基因组DNA提取系列试剂盒综合利用上述方法基因组DNA提取流程-细胞裂解化学方法基因组DNA提取流程-细胞裂解特点：不需要使用有毒的氯仿、苯酚等试剂多次柱漂洗确保高纯度；长度可达30-50Kb提取原理：组织/细胞/细菌/血液基因组DNA提取特点：提取原理：组织/细胞/细菌/血液基因组DNA提取玉米叶片基因组DNA提取（使用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒）提取原理：植物材料基因组DNA提取玉米叶片基因组DNA提取提取原理：植物材料基因组DNA提取特殊样品基因组DNA提取传统方法适用于所有材料基因组DNA的提取？比如大量血液？比如土壤/粪便中的微生物基因组DNA的提取？比如病毒及其他微量样品DNA的提取？

NO！特殊样品基因组DNA提取传统方法适用于所有材料基因组DNA的中量/大量血液基因组DNA提取传统方法消化后，用酚/氯仿抽提，时间长，损害操作人员健康BioTeke创新

不用蛋白酶消化不用酚/氯仿抽提结果：

得率：约75-250μg/5mL血样纯度：OD260/OD280＝1.87-1.955ml全血基因组DNA提取电泳结果中量/大量血液基因组DNA提取传统方法5ml全血基因组DNA土壤/粪便微生物基因组DNA提取其他品牌试剂盒存在缺点：采用玻璃珠或钢珠破碎，导致基因组断裂严重；必须购买破碎专用设备，增加使用成本；采用包括玻璃奶、离心吸附柱串联的纯化方式，导致DNA大量损失，得率很低，很难真实反映土壤微生物的多样性。BioTeke的技术创新：采用酶法破碎，保证基因组的完整性；用异丙醇沉淀DNA，DNA无损失。厂家破碎方式纯化方式提取时间是否需要专门设备BioTeke酶法破碎基因组完整离心柱吸附杂质纯度高1小时内不需要Q公司钢珠破碎基因组断裂玻璃奶同离心柱结合得率低2小时需要M公司玻璃珠破碎基因组断裂离心柱纯化得率较低2小时需要土壤/粪便微生物基因组DNA提取其他品牌试剂盒存在缺点：厂家临床样品基因组DNA提取病毒基因组DNA提取酵母基因组DNA提取口腔拭子DNA提取微量样品DNA提取石蜡组织DNA提取头发DNA提取临床样品基因组DNA提取病毒基因组DNA提取一步法DNA提取扩增原理：综合微量样品基因组DNA提取和高效的PCR扩增试剂。从毛发、石蜡组织等微量组织中高效提取足够浓度的DNA，然后进行PCR扩增。操作简单、方便，可对大量样品同时进行操作。一步法DNA提取扩增原理：保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存基因组DNA分离纯化中的注意事项保证基因组DNA的完整性和纯度基因组DNA分离纯化中的注意事保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存基因组DNA分离纯化中的注意事项简化操作步骤，缩短操作时间减少物理因素对DNA的降解，震荡、搅拌等减少化学物质对DNA的降解，操作多在pH4-10防止基因组DNA的生物降解：DNase保证基因组DNA的完整性和纯度基因组DNA分离纯化中的注意事保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存基因组DNA分离纯化中的注意事项洗脱液65度预热10分钟洗脱体积不小于30μL洗脱2次或者3次保证基因组DNA的完整性和纯度基因组DNA分离纯化中的注意事保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存基因组DNA分离纯化中的注意事项可长期储存于pH=7.0的ddH2O或TE不易制成干品储存分装低温保存保证基因组DNA的完整性和纯度基因组DNA分离纯化中的注意事如何提高微量核酸提取或回收后的浓度核酸助沉剂的应用微量吸附柱的应用15μl洗脱体系质粒提取胶回收或PCR产物回收微量细胞/组织DNA/RNA提取病毒DNA/RNA提取微量临床样本DNA/RNA提取如何提高微量核酸提取或回收后的浓度核酸助沉剂的应用不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案Real-timeqPCR攻略北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路15号）不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案ReRT-PCR原理Real-timeqPCR原理及应用Real-timeqPCR成功关键Real-timeqPCR数据分析Real-timeqPCR常见问题及解决方案主要内容RT-PCR原理主要内容中心法则与RT、PCRRNADNARTPCR中心法则与RT、PCRRNADNARTPCR逆转录反应可以以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。提取RNA的质量会影响到RT的产量及cDNA的完整性。整个过程要求无RNA酶操作。反转录酶、RNA酶抑制剂都会对产物的质量造成一定的影响。反转录相关因素反转录相关因素SuperM-MLV反转录酶高效的逆转录活性，且无RNaseH活性ThermoM-MLV反转录酶高效的逆转录活性，且无RNaseH活性适合合成长片段的cDNA,有很强的模板兼容性，对高GC含量（75%以上）和结构复杂的模板效果显著在42℃-60℃具有较好的热稳定性。SuperM-MLV反转录酶OnestepRT-PCR模板：使用BioTeke公司的RNApure总RNA提取试剂盒提取的鸡肝脏组织RNA

目的片段：管家基因β-Actin反应体系：

反应程序：

OnestepRT-PCR模板：目的片段：管家基因β-ART-PCR相关产品SuperM-MLV反转录酶，10000u/198元SuperRTKitcDNA第一链合成试剂盒50次，特价490元SuperOne-stepRT-PCRKit一步法RT-PCR试剂盒50次，特价880元Thermo系列产品买二赠一！ThermoM-MLV反转录酶，10000u/580元ThermoRTKitcDNA第一链合成试剂盒50次，价格1200元ThermoOne-stepRT-PCRKit一步法RT-PCR试剂盒50次，价格1400元反转录酶及试剂盒系列产品讲座期间特价优惠！RT-PCR相关产品SuperM-MLV反转录酶，1000RT-PCR原理Real-timeqPCR原理及应用Real-timeqPCR成功关键Real-timeqPCR数据分析Real-timeqPCR常见问题及解决方案RT-PCR原理实时荧光定量PCR技术的应用基因表达差异分析拷贝数分析SNP检测miRNA定量转基因成分定量分析临床诊断、疾病及药物研发等实时荧光定量PCR技术的应用基因表达差异分析Real-timeqPCR原理如何对初始模板定量荧光信号如何产生？Real-timeqPCR原理如何对初始模板定量Real-TimeqPCR主要概念实时定量PCR非探针化学原理探针两个重要图形扩增曲线熔解曲线Real-TimeqPCR主要概念实时定量PCR非探针化学Real-TimeqPCR曲线的意义扩增曲线熔解曲线图片为：首都医科大学演示实验结果材料：小鼠肝脏基因：β-actinReal-TimeqPCR曲线的意义扩增曲线熔解曲线图片为实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种。非探针类则是利用荧光染料（如SYBRGreenI）或者特殊设计的引物(如LUXPrimers)来指示扩增的增加。探针类(TaqMan探针和

分子信标)是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。后者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但前者则简便易行。荧光染料和荧光探针实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种。荧SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI是LUX(lightuponextention)引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物3’

端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。LUX引物工作原理LUX(lightuponextention)引物是TaqMan探针工作原理FQPrimerFQPrimerDegradationofTaqManprobebyDNApolymeraseFQReporterQuencherSuppressionoffluorescenceTaqMan探针工作原理FQPrimerFQPrimerDe分子信标（molecularbeacon）工作原理分子信标：一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子（图5）。分子信标（molecularbeacon）工作原理分子荧光阈值(Threshold)CtCt值是扩增DNA的量达到阈值时候的循环次数。荧光阈值(Threshold)CtCt值是扩增DNA的量达Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。Ct值Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板Real-timeqPCR流程Real-timeqPCR流程一步法两步法优点节省时间稳定性好减少污染灵敏度高定量相对准确缺点灵敏度稍差稳定性稍差操作稍复杂一步法和两步法优缺点比较根据自己需求，选择合适的方法！一步法两步法优点节省时间稳定性好减少污染灵敏度高定量相对准确RT-PCR原理Real-timeqPCR原理及应用Real-timeqPCR成功关键Real-timeqPCR数据分析Real-timeqPCR常见问题及解决方案RT-PCR原理Real-timeqPCR成功因素引物设计：

3’末端尽量不是A；18－24bp；扩增产物80-150bp;设计在基因保守区内

Taqman探针：尽量靠在上游引物；长度30－45bp，Tm比引物高至少5℃；5’端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量RNA质量和定量

比较好，2条主带可见（28s和18s）；定量准确内标（housekeepinggene）正确选择18srRNA,ß-actin,GAPDH等

标准曲线的准确制作R2＝0.99Real-timeqPCR成功因素引物设计：反应体系：模板浓度不要太高，反转录最多1µg总RNA，PCR一般1µL反转录产物；引物浓度一般100nM-1mM；根据kit要摸索最佳反应条件小心操作：每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样，即使是混合液！每个样品至少要做3个平行孔。每组实验最好有3个重复，做统计分析。Real-timeqPCR成功因素做real-timeqRT-PCR前，做个普通的PCR，检测您的反应条件！反应体系：Real-timeqPCR成功因素做real-tRT-PCR原理Real-timeqPCR原理及应用Real-timeqPCR成功关键Real-timeqPCR数据分析Real-timeqPCR常见问题及解决方案RT-PCR原理Real-timeqPCR数据分析基线（baseline）通常是3－15个循环的荧光信号同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线阈值（threshold)自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。Ct值:与起始浓度的对数成线性关系分析定量时候一般取Ct:15-35.太大或者太小都会导致定量的不准确。Real-timeqPCR数据分析基线（baseline）统计分析方法绝对定量：此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。

相对定量：通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,一般是

2-Ct。或者是考虑扩增效率的Pfaffl法。统计分析方法绝对定量：绝对定量绝对定量相对定量MarisaL.WongandJuanF.Medrano:BioTechniquesJuly2005相对定量MarisaL.WongandJuanF.相对定量相对定量实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高（Taqman）精确定量Real-timeqRT-PCR优点实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测Real-timeRT-PCR原理Real-timeqPCR原理及应用Real-timeqPCR成功关键Real-timeqPCR数据分析Real-timeqPCR常见问题及解决方案RT-PCR原理特异性

重复性

灵敏度其他问题常见问题讨论特异性常见问题讨论扩增的特异性引物？Tm，重新设计引物，优化条件Tm扩增的特异性引物？Tm，重新设计引物，优化条件Tm重复性判断实验优劣的重要指标判断指标：主要为标准差（SD）和变异系数（CV）影响重复性的因素：PCR反应扩增的效率：优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率。目的基因的初始浓度：使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔。标准曲线的影响：不少于5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围；理想的标准品应与样本具有高同源性，质粒DNA或是体外合成、转录的RNA。重复性判断实验优劣的重要指标影响灵敏度的因素反应体系中形成的引物二聚体的影响

可以用水解探针代替SYBRGreenI，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBRGreenI高出10倍。可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶要尽可能地优化引物设计如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。循环数

Mg2＋的浓度