《微生物检验技术》学习指南

第29页共29页《微生物检验技术》学习指南项目一：血液标本采集一、项目分析二、学习指导采集血液标本进行细菌培养是微生物检验常用的技术之一，适用于临床菌血症、败血症、脓毒血症等的病原学检查，严格无菌操作是获得真实病原体的必要保证。微生物检验人员在接收到医生开出的检验申请单后，多数情况下是同时接受护理人员送来的血培养标本，直接进行验收、登记、培养即可。门诊病人、临床血液采集困难病人则由检验科人员采集，首先选择适宜的培养基，一般情况下选择普通和厌氧增菌培养基，然后进行抽血，最常用抽血部位是肘正中静脉，特殊情况下可用股静脉和颈静脉，新生儿可用后囟采血。抽血前在采血部位先用碘酒再用酒精由内向外擦拭消毒，待消毒部位干燥后用一次性注射器刺入血管抽取血液，抽血量与培养基量之比约1：10，成人一般采集5～10ml，婴幼儿一般采集1～5ml，迅速注入培养基内，轻轻混匀，将培养瓶上的条形码撕下贴于申请单上，送入细菌室再行编号、登记、培养。

项目二：脓液、痰液标本采集项目分析二、学习指导脓液、痰液细菌培养的标本一般由临床医护人员采集送往微生物检验室。门诊病人的标本采集则由微生物检验工作人员负责。首先接收到医生开出的申请单后依据申请内容采集标本。封闭性脓肿用注射器抽取脓液送检标本；开放性脓肿用棉签或无菌纱布采集脓液放置无菌器皿中送检标本。痰液标本一般需要采集晨痰，采集前嘱咐病人用清水漱口三次，然后用力咳出气管深部痰液，置于无菌容器内送检。接收或采集的痰液标本需做性合格评价，一般低倍镜下每个视野上皮细胞数＜25个，白细胞数＞10个为合格，可进行微生物的分离培养，反之则拒收或重新采集。对接收和拒收的标本均应进行处理意见和基本信息的登记。

项目三：尿液、粪便标本采集一、项目分析二、学习指导尿液为无菌体液标本的一种，泌尿系统感染时尿液培养可确定病原菌，有利于临床针对性治疗。据培养目的不同可以采集中段尿、肾盂尿、膀胱穿刺尿、24h尿标本，细菌培养最常用中段尿标本。中断尿采集时首先清洗外阴，然后排除阴唇、包皮干扰连续排尿，接取中段尿10～20ml于无菌容器内快速送检。粪便标本为含丰富正常菌群的材料，但是肠道致病菌也可以出现在肠道感染的患者粪便中，选择培养病原菌是诊断肠道感染的常用技术。粪便标本采集方法有自然排便采集法和直肠拭子采集法。自然排便采集法是在自然排便后，挑取有脓血、粘液部分的粪便2～3g或液状粪便中的絮状物1～2ml盛于无菌的容器内快速送检，不能及时送检的标本可以选择适当的保存液（50%甘油盐水）或增菌培养基中送检；直肠拭子采集后置于无菌试管中快速送检，不能及时送检应放入卡-布运送培养基或pH7.0的磷酸盐甘油缓冲液中运送或保存。接收到标本后，应该及时对标本进行评价，尿沉渣涂片染色镜检无杂菌（2种以上），即尿标本采集质量合格，检出单种细菌对临床有初步诊断价值。合格粪便标本应该新鲜、不干燥，带有病理成分的标本为好。最后登记病人信息和处理意见。

项目四：细菌形态结构辨认一、项目分析二、学习指导学会使用显微镜油镜观察细菌的形态结构是微生物检验的基本技术，显微镜油镜是微生物检验不可缺少的工具。。细菌个体微小（几个微米），只有放大一千倍才能看到，因此必须使用油镜才能观察到细菌的形态和结构。显微镜油镜头由于焦距短、孔径小，总透光量少，为了减少折射光损失而使用密度与玻片密度相近的香柏油做介质。观察标本时先用低倍镜调节光路、调节焦距找到物象，再将香柏油滴在标本片上，转换油镜头，聚光器调至高点，光圈完全打开，缓慢调节细调节器直到物象清晰为止。细菌基本形态有球形、杆形和螺旋形。染色标本可见革兰阳性葡萄球菌、链球菌、双球菌，革兰阴性杆菌、弧菌、双球菌。特殊结构可见荚膜、鞭毛、芽胞等。

项目五：细菌革兰染色一、项目分析二、学习指导革兰染色是微生物检验中最常用的染色技术，是病原学检查不可缺少的基本技术。该技术包含三个阶段：制片、染色、镜检。制片是染色前的标本准备，包括涂片、干燥、固定三个步骤，每个步骤的实施都直接影响染色结果，正确进行涂片、干燥、固定是染色技术的质量保障。一般取被检材料少许，涂成1～1.5cm的涂膜，自然干燥或置于酒精灯上方

项目六：细菌抗酸染色一、项目分析二、学习指导抗酸染色技术是检查分枝杆菌属细菌的基本技术，也是临床结核病病原学检查的最常用方法。该技术包含制片、染色、镜检三个阶段。制片材料可以是痰液、尿液、粪便、脑脊液、胸腹水等标本。制片包含三个步骤：涂片、干燥、固定。取处理后的待检标本三环涂成厚涂片，在火焰上方温热环境中缓慢干燥，连续三次通过火焰外焰进行固定，然后进行染色。染色方法有加热助染法和冷染法，学生学习时常用冷染技术。染色包括初染、脱色、复染三个步骤，首先用石碳酸复红对标本进行初染，加染液后放置20分钟，用流动的清水冲去染液，其次用盐酸酒精脱色，直到无红色液体流下为止，用清水冲洗标本片后再用碱性美兰复染1分钟，用流动的清水冲去染液待干镜检。镜检阶段重点掌握认识标本中的抗酸菌形态和报告方式，抗酸菌为细长略弯的红色细菌，其他细菌和细胞均被染成蓝色。报告方式：不低于4分钟观察时间，镜下计数100个视野，未发现抗酸菌，继续观察300个视野未发现抗酸菌者，报告（—），计数100～300个视野找到抗酸菌1～2条，报告（±），100个视野内找到抗酸菌3～9条，报告（＋），10个视野内找到抗酸菌1～9条，报告（＋＋），每个视野内找到抗酸菌1～9条，报告（＋＋＋），每个视野内找到抗酸菌9条以上，报告（＋＋＋＋）。

项目七：痰液洗净与液化一、项目分析二、学习指导痰液标本合格性评价（涂片低倍镜下每视野：上皮细胞＜25，白细胞＞10）通过后，接种前需对标本进行处理，其目的一是为了减少口腔正常菌，二是为了去除粘液的干扰，提高致病菌的检出率。痰标本的处理方法有洗净和液化两种。对一般痰标本做洗净处理即可，用大试管装10～20ml的无菌生理盐水备用，将评价合格的痰液标本转入大试管中，塞紧管塞剧烈震荡5～10秒后，取底部脓痰再移入新的大试管中，如此反复洗2次，用第三管底部的脓痰接种。也可将脓痰置于无菌平皿内，用20～30ml的无菌生理盐水充分搅动洗涤后取脓痰接种痰液的液化通常用于粘稠性很高的标本处理，用洗净法无法得到可用的痰片时使用。在装有痰标本的盛器内，加入等量的pH7.6的10%胰酶溶液，37℃

项目八：常用培养基制备一、项目分析二、学习指导培养基是人工配制供细菌生长繁殖所需的营养基质。培养基按物理性状分固体、液体、半固体培养基三种，按用途可分基础、营养、选择、鉴别、厌氧培养基。不同的培养基的营养成分不同，故配制培养基需依据不同的要求进行。培养基的制备程序一般是：称量→溶化→校正pH→分装→灭菌→检定→保存等步骤。称量就是按照所配制培养基的要求称量营养物质，通常使用普通天平即可。溶化可用电炉加热溶化混合营养物质，但要注意不能焦糊，以免营养水平下降，影响培养基质量。溶化好的培养基需要矫正pH值，测pH值可用石蕊试纸法和酸度计法。石蕊试纸适用于小量培养基的pH校正，酸度计法用于大批量培养基pH校正，一般校正培养基pH值到7.4～7.6即可。校正好的培养基按要求进行分装，增菌培养基分装到小三角烧瓶中，生化试验用培养基分装到小试管中，斜面固体培养基分装到大试管中，包扎后高压灭菌。根据培养基营养成分不同选择不同条件进行高压灭菌。eq\o\ac(○,1)常用培养基选择103.4kPa，121.3℃，15～30min的灭菌条件。eq\o\ac(○,2)含糖、明胶的培养基选择68.45kPa，15min的灭菌条件。灭菌完毕的培养基检定后方可保存使用。无菌试验是将灭菌后的培养基放入35℃18～24h，无菌生长为合格。合格培养基一般用保鲜袋包装，注明日期、名称，放4℃冰箱保存。

项目九：细菌接种技术一、项目分析二、学习指导细菌接种技术是微生物检验的关键技术，直接关系到微生物检验的质量，正确掌握细菌接种技术是微生物检验工作的基本保障。常用细菌接种技术包括：穿刺接种技术、液体接种技术、斜面接种技术、分段划线接种技术等。液体培养基接种常用于增菌、生化培养，接种工具为接种环或接种针。半固体培养基接种常用于检查细菌动力和保存菌种，接种工具为接种针。斜面培养基接种常用于大量增菌或鉴别培养基接种，接种工具为接种环或接种针。平板分段划线主要用于从临床标本中或增菌阳性标本中分离纯种菌，接种工具为接种环，接种时首先用酒精灯外焰灭菌接种环，待冷却后挑取标本少许，左手掌托住平板皿底，拇指推开皿盖约450角，将标本均匀涂布接种于培养基边缘部分，约占培养基表面的1/4，即第一区，灼烧灭菌接种环后，将培养基转动一定角度从第一区通过3～4次连续划线不重叠占培养基面积1/4，即第二区，依次划3、4区。盖好皿盖，做好标记，灭菌接种环放回原处，即完成接种。

项目十：细菌培养技术一、项目分析二、学习指导依据检测目的不同选择不同的培养方法，是微生物检验工作人员应该具备的职业素质，是准确分离出病原体的前提。常用细菌培养方法有：普通培养、二氧化碳培养和厌氧培养等。普通培养是最常用的方法，一般欲从临床标本中分离病原菌均行此法培养，常用培养基有血平板、选择培养基、生化鉴别培养基等，常用工具为普通35℃孵育箱，通常孵育18～24二氧化碳培养临床应用也较频繁，一般从生殖道分泌物、尿液、脑脊液中分离奈瑟菌和从痰液中分离嗜血杆菌、肺炎链球菌时使用此培养方法。常用培养基为血平板、普通或万古巧克力平板。常用工具为：二氧化碳培养箱、烛缸、重碳酸盐—盐酸反应皿等。厌氧培养是从临床脑脊液、脓、痰、尿标本、创伤分泌物、穿刺尿、牙周分泌物、穿刺脓液等标本中分离厌氧菌的方法。所用培养基有强化血平板、各种选择培养基和培养厌氧芽胞梭菌的疱肉培养基。厌氧培养工具有：厌氧手套箱、厌氧罐、厌氧气袋等。

项目十一：标本的分离培养一、项目分析二、学习指导从不同的临床标本中分离病原菌，选择合适的培养基和使用恰当的培养方法，是正确保证微生物检验结果准确的重要保障。临床血液标本一般需要先增菌，故抽取的标本直接注入血培养瓶，包括普通增菌培养瓶和厌氧增菌培养瓶，进行普通和厌氧培养。脓液标本首先需要分离细菌，一般用血平板进行普通培养。封闭脓肿或申请厌氧培养的标本行厌氧培养。痰液标本处理后首先进分离培养，一般用血平板和万古巧克力平板各一个，接种标本后，血平板行普通培养，巧克力平板行二氧化碳培养。尿液标本直接分离接种血平板、MAC平板、巧克力平板，血平板、MAC平板行普通培养，巧克力平板行二氧化碳培养。膀胱穿刺尿标本接种强化血平板行厌氧培养。粪便标本直接分离接种SS、MAC平板进行普通培养。

项目十二：形态学检查一、项目分析二、学习指导细菌形态学检查是微生物检验中经常运用的技术，常用细菌形态学检查方法包括：不染色标本检查和染色标本检查。不染色标本的检查主要用于细菌的动力检查，包括压滴法和悬滴法。压滴法是将待检菌液一环涂在洁净的玻片中央，覆盖一洁净的盖玻片后置显微镜下观察细菌的动力。悬滴法是将待检菌液一环涂在洁净的盖玻片中央，用一洁净的凹玻片在凹陷周围涂上凡士林，凹面对准菌液覆盖在盖玻片上，迅速翻转后使菌液悬挂在盖玻片上，置显微镜下观察细菌的动力，有鞭毛的细菌会在镜下看到运动现象。染色标本检查法是用于临床细菌检查必不可少的方法，依据使用染液的种类多少分单染和复染色法。单染法就是用一种染料对标本进行染色的方法，复染色方法就是用两种以上的染料对标本进行染色的方法，临床最常用的复染色法有革兰染色和抗酸染色两种方法。

项目十三：生物化学试验一、项目分析二、学习指导细菌因含有不同的酶故表现出不同的生化特点，依据其生化反应不同可以鉴定细菌。细菌生化反应种类众多，归纳起来有：糖类代谢试验、蛋白质和氨基酸代谢试验、呼吸酶类试验和其他生化试验。这些试验可以鉴别出不同种类的细菌。糖类代谢试验包括O/F试验、MR试验、VP试验等，如：肠杆菌科细菌O/F试验均为阳性，而非发酵菌只能氧化分解葡萄糖，不能发酵葡萄糖。蛋白质和氨基酸代谢试验包括吲哚试验、硫化氢试验、尿素酶试验等，如吲哚试验就能鉴别大肠埃希菌和沙门氏菌。呼吸酶类试验包括氧化酶试验、触酶试验、硝酸盐还原试验等，如氧化酶试验能鉴别奈瑟菌和不动杆菌。另外有些细菌可以在组合生化培养基上表现出不同的生化反应现象，帮助临床鉴定细菌如KIA试验、MIU试验等，如大肠埃希菌KIA试验结果为：+/eq\o\ac(○,+)，志贺氏菌KIA试验结果为：－/+。根据细菌的结构不同表现特点不同，也可以进行特殊的生化试验，如拉丝试验。G+菌阴性，G—菌阳性。

项目十四：病原性球菌鉴定一、项目分析二、学习指导病原性球菌是临床标本分离培养中常见细菌，包括葡萄球菌属、链球菌属、奈瑟菌属等细菌。对其鉴定因素包括生长现象、形态染色和生化反应。葡萄球菌属的细菌在血平板上可形成圆形、光滑、湿润、凸起、有色素、有的有溶血现象的菌落。链球菌属的细菌在血平板上可形成圆形、光滑、湿润、凸起、灰白色、有α、β、γ溶血现象的小菌落。奈瑟菌属的细菌在巧克力培养基上形成光滑、湿润、扁平、半透明菌落。具有相应的生长现象，染色形态检查为G+菌的细菌，继续做触酶试验，触酶试验（+）为葡萄球菌，触酶试验（—）为链球菌。染色形态检查为G-球菌的继续做氧化酶试验，氧化酶试验（+）为奈瑟菌，氧化酶试验（-）为不动杆菌。不动杆菌虽不是球菌，但其形态染色与奈瑟菌易混淆，故需鉴别。鉴定到属的细菌再做相应生化试验鉴定到种。如金葡菌鉴定除了分属试验外，还需观察生长现象，血平板上应该具有溶血的生长现象，菌落特征符合，另需要做甘露醇试验（+）、血浆凝固酶试验（+）等生化试验进行鉴别。

项目十五：肠杆菌科细菌鉴定一、项目分析二、学习指导肠杆菌科的细菌是临床标本分离培养中常见细菌，包含30多个菌属，120多个菌种，生物学性状相近，因普通染色镜检均为革兰阴性杆菌，所以不能通过染色形态学检查鉴别。对其鉴别的主要手段为生化反应和血清学试验。从粪便标本中分离的肠道杆菌，主要进行致病性的鉴别，肠道致病菌与非致病菌的鉴别要点是乳糖分解试验，乳糖分解试验阳性的是肠道非致病菌；乳糖分解试验阴性的是肠道致病菌。从其他临床标本中分离出的肠道杆菌有致病意义。对其鉴别程序一般为分科鉴定，肠杆菌科的细菌生化特征为OX：—；O/F：+。分属鉴定包括苯丙氨酸脱氨酶、葡萄糖酸盐、H2S、鸟氨酸、枸橼酸盐利用、动力试验、山梨醇发酵试验、棉子糖发酵试验、DNA酶试验、赖氨酸脱羧酶试验、枸橼酸盐利用试验、吲哚试验等。种的鉴定则有多种生化试验和血清学试验。

项目十六：非发酵菌的鉴定一、项目分析二、学习指导非发酵菌是指不能发酵葡萄糖的一大群革兰阴性杆菌，其普通染色形态不易与肠道杆菌区别，但其主要生化反应明显与肠道杆菌不同。非发酵菌临床标本分离培养中常见细菌种类有假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属等。假单胞菌属的代表菌种为铜绿假单胞菌，其典型特征是产生水溶性绿色色素并有生姜味，生化反应典型：OX:＋,O/F:O/－,精氨酸双水解酶：＋。不动杆菌的代表菌种是醋酸钙不动杆菌，典型生化反应为：OX:—,O/F:O/－,精氨酸双水解酶：＋。产碱杆菌属的代表菌种是粪产碱杆菌，典型生化反应为：OX:＋,O/F:K/K。其他非发酵菌的鉴定一般选择生化编码鉴定系统，该系统是将不同的生化试验分组进行组合，每个组合不同的结果将由不同的数据表示。在规定的组合试验中产生的数据，通过编码本查出相应的菌种名称，临床使用的主要有API微量快速鉴定系统、非发酵菌编码鉴定系统等。

项目十七：厌氧菌的鉴定一、项目分析二、学习指导厌氧菌分为厌氧芽胞梭菌和无芽胞厌氧菌，厌氧芽胞梭菌主要引起创伤感染，无芽胞厌氧菌多数是人体正常菌群。厌氧芽胞梭菌的感染，临床主要通过症状诊断，需要查找病原菌时主要通过形态学检查，芽胞的位置是鉴定的主要依据。破伤风芽胞位于菌体的顶端，呈球形，菌体细长，形似火柴棒。产气荚膜芽胞梭菌芽胞位于菌体中央，并不宽于菌体，繁殖体可见荚膜。肉毒梭菌芽胞位于菌体次级端宽于菌体，菌体形似汤勺。分离厌氧芽胞梭菌常用疱肉培养基，在此培养基上破伤风梭菌和肉毒梭菌消化肉渣产生黑色，并有腐败恶臭。产气荚膜梭菌在此培养基上不消化肉渣，肉渣为粉红色，但在牛乳培养基上有“汹涌发酵”现象，此为其主要特征。血平板上破伤风梭菌能形成典型的羽毛状菌落，产气荚膜梭菌则能形成双溶血环现象。无芽胞厌氧菌的鉴定依据包括在选择培养基上的生长情况、菌落形态、色素、溶血现象，菌落多为单个，革兰染色配合拉丝试验，结合抗生素敏感试验，生化试验，气相色谱分析等进行鉴别。

项目十八：分枝杆菌鉴定一、项目分析二、学习指导分枝杆菌属的细菌因细菌分裂有分支趋势而得名，这一菌属的细菌普通染色着色不均，因其含有分枝菌酸故对酸性脱色剂有较强的抵抗力，故抗酸染色为阳性，也称抗酸菌。临床最常见的抗酸菌是结核分枝杆菌，此菌致病性、传染性均较强，临床常见疾病是肺结核，故鉴定环境生物安全要求较高，从接到标本开始到鉴定结束，都要按具有较强传染性的过程防范，一般实验室不做分离培养，某些专门实验室可以进行分离培养。细菌的生长现象就是该菌的鉴定依据之一，结核分枝杆菌生长速度慢，其他分枝杆菌生长速度快。菌落特征各种分枝杆菌差异不大，多为颗粒状、粗糙型菌落，光产色现象多为阴性，37℃、24℃、42℃培养温度生长情况也是鉴定依据。另外尚可做烟酸试验、硝酸盐还原试验、冷热触媒试验等生化试验鉴定分枝杆菌。一般实验室常做的是标本直接染色镜检。故该菌痰涂片染色镜检是最常用鉴定方法。无论是进行分离培养还是染色镜检，均需对标本进行前处理，因该菌对强酸碱有抵抗力，故可用40g/L的

项目十九：病原性真菌鉴定一、项目分析二、学习指导从临床标本中检出真菌的几率逐年增高。真菌的鉴定包括生长现象、形态结构特点和一些特异性的试验方法。临床常见真菌包括引起皮肤感染的皮肤癣真菌和引起组织感染的条件致病性真菌。真菌分多细胞真菌和单细胞真菌两种。多细胞真菌由菌丝和孢子组成，不同形态的菌丝或孢子是鉴定真菌的主要依据。单细胞真菌只有孢子而无菌丝。皮肤癣真菌是引起皮肤、毛发、指甲病变的感染菌，一般都是多细胞真菌，对此类疾病诊断通常直接采集皮屑标本透明镜检，查到菌丝或孢子均可诊断真菌感染。引起组织感染的条件致病性真菌多为白假丝酵母菌和新型隐球菌，可从临床标本中分离出来，对此类真菌可以用生化试验、芽管形成试验、厚膜孢子形成试验、墨汁负染色检查鉴定。生化试验的糖同化试验可以鉴定酵母菌，芽管形成试验、厚膜孢子形成试验是白假丝酵母菌的鉴定试验，墨汁负染色有利于观察新型隐球菌的典型荚膜形态，为其主要鉴定试验。

项目二十：扩散法药敏试验一、项目分析二、学习指导药敏试验是测定分离出的病原菌抗菌谱，为临床抗菌治疗疾病提供指导性意见的重要试验。临床常用药敏试验的方法有扩散法（K-B法）和稀释法。扩散法是一种半定量的方法，此法简便、易掌握，被临床广泛使用，我国以NCCLS标准规范此试验。K-B法试验步骤首先配制合格的菌液，将分离好的细菌以接种环挑取4～5个菌落接种于3～5mlM-H肉汤中，制备成0.5麦氏单位浓度的菌液，以无菌棉拭蘸取菌液，在管壁上挤去多余的液体，均匀涂布接种到M-H琼脂平板表面，共三次每次转动60°角，最后沿内缘涂抹一周，M-H琼脂为4mm厚，90mm直径的平板。3～5分钟后用无菌镊子或纸片分配器将药敏纸片贴于琼脂平板表面，各纸片中心距离不小于24mm，纸片