《植物生理学实验》教学大纲

《植物生理学实验》教学大纲课程名称：植物生理学实验实验学时：32学分：1学分适应专业：本科生物科学专业一、实验的地位、目的植物生理学实验是生物科学本科专业重要的专业基础课和必修课，独立设置课程，单独考核。通过做实验加深学生对植物生理学基础理论的理解，掌握植物生理学研究中一些基本的实验方法和实验技术，更重要的是训练同学们操作技能，锻炼学生的动手能力，培养学生的观察能力、综合能力和创新能力，增强学生分析问题和解决问题的能力，促进创造性思维的形成。二、实验教材与指导书实验教材：《植物生理学实验》，赵世杰等编著，中国农业出版社，2015年版；教学参考书：《现代植物生理学实验指南》，中国科学院上海植物生理研究所，科学出版社，1999；《植物生理学实验指导》，张志良,瞿伟菁主编，高等教育出版社，2003三、考核方式及成绩评定1、考核方式：综合考核实验成绩，包括实验报告成绩、笔试成绩和平时成绩2、期末考试形式、时间及分值考试形式：技能测试；考试时间：100分钟。3、成绩组成：平时成绩占50%，其中出勤考核占10%，上课表现占10%，实验报告成绩占30%；期末课程考核成绩占50%四、实验项目开设表共有10个实验，其中选8个实验必做序号实验项目实验学时每组人数实验类别实验类型实验要求主要内容、主要仪器设备1实验室的安全教育22专业综合必做1.对学生在实验课程中需要注意的事项进行说明，强调在实验课程中的操作规范，培养学生良好的实验操作习惯；打扫实验室卫生，整理实验室本学期所用教学材料2植物组织水势的测定必做液体交换法测定植物水势，掌握测定方法的原理和操作方法。3植物根系活力的测定必做采用TTC法测定。4叶绿素的提取分离及理化性质选做练习叶绿体色素的提取方法，验证理化性质。5叶绿素的定量测定必做用分光光度计定量测定叶绿素a、b和类胡萝卜素含量，掌握叶绿素计的测定原理和使用方法。6植物组织中可溶性蛋白质含量的测定必做考马斯亮蓝染色法测定植物组织中蛋白质的含量。7生长素对植物的影响必做利用幼苗芽鞘的生长可被生长素特异地诱导这一特性可用以测定生长素类物质，掌握生长素物质的生物特性及其与植物生长的关系8植物组织逆境伤害程度的测定（MDA含量）必做利用电导仪测定处理液电导度的变化，确定各种逆境对植物的伤害程度，并了解细胞膜透性与受伤害程度的关系9植物组织中过氧化物酶活性的测定必做通过测定植物过氧化物酶活性，了解某一组织其再植物体内的带些变化，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。10综合性设计实验选做由学生查阅资料，自己设计实验项目，种植、管理实验材料，进行实验处理等。实验结束，总结实验结果，写出实验报告，并在班级中汇报交流实验结果五、综合性、设计性实验简介实验一实验室安全教育【实验目的】1.组织学生收拾打扫实验室，对学生在实验课程中需要注意的事项进行说明，强调在实验课程中的操作规范，培养学生良好的实验操作习惯。2.介绍本学期实验安排：【实验仪器与材料】无【实验内容】实验室的安全培训打扫实验室卫生【基本实验技能及考核要点】实验室安全注意事项实验二植物组织水势的测定——液体交换法测定植物组织水势(2学时)【实验目的】通过实验，掌握用小液流法测定植物组织水势的原理和方法。【实验仪器与材料】1.材料：植物叶片；2.仪器设备：试管；小瓶；小塞子；打孔器(直径0.5㎝)；尖头镊子；移液管（1ml、5ml、10ml）；注射针钩头滴管；刀片。3.试剂：CaCl2溶液。【实验内容】1.掌握液体交换法测定植物组织水势的原理2.不同浓度CaCl2溶液的配制3.植物组织水势计算【实验步骤】不同浓度CaCl2溶液配制→取样及测定→结果记录→水势计算【基本实验技能及考核要点】1.不同浓度CaCl2溶液配制2.将测得的等渗浓度值代入以下公式计算出植物组织的水势：公式中：ψW=ψл=－iCRT（MPa）ψW—植物组织水势,单位：Mpa（兆帕）ψл—溶液的渗透势（即溶液的水势）C—等渗浓度（mol·L－1）R—气体常数（0.0083L·MPa·mol－1·K－1）T—热力学温度（273+t℃）i—解离系数（蔗糖=1；CaCl2=2.60）实验三植物根系活力的测定(2学时)【实验目的】通过实验掌握氯化三苯基四氮唑（TTC）测定根系活力的基本原理和方法。【实验仪器与材料】实验材料：小麦、玉米等幼苗根系；仪器：分光光度计、恒温箱，研磨钵，100ml三角瓶，漏斗，10ml、2ml、0.5ml移液管，20刻度试管，10ml容量瓶，小培养皿，试管架，药匙，石英砂；试剂：乙酸乙酯，连二亚硫酸钠；磷酸缓冲液，氯化三苯基四氮唑（TTC）【实验内容】1掌握氯化三苯基四氮唑（TTC）测定根系活力的基本原理2试剂配制3结果计算【实验步骤】1.定性测定

1）配制反应液把1％TTC溶液、0.4mol／L的琥珀酸和磷酸缓冲液按1:5:4比例混合。

2）把根仔细洗净，把地上部分从茎基部切除。将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37℃左右暗处放1～3h，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。2.定量测定

1）TTC标准曲线的制作取0.4％TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲攒。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲攒25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

2）称取根尖样品0.5g，放入10ml烧杯中，加入0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸与根样品，10分钟以后再加其他药品，操作同上）。

3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲攒。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。3.结果计算四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/h）＝四氮唑还原量（mg）/[根重（g）×时间(h)]【基本实验技能及考核要点】1.

为什么要测定根系活力?植物的根与地上部分有何关系?实验四叶绿素的提取分离及理化性质(2学时)【实验目的】了解溶剂提取法的原理及方法了解叶绿素中含有的色素以及分离方法掌握薄层层析法和柱层析法的原理、方法及操作事项【实验仪器与材料】仪器：半微量玻璃仪器一箱，小烧杯，层析缸(槽)，载玻片(100mm×25mm)干燥器，电吹风，毛细管，移液管，研钵，布氏漏斗，抽滤装置。试剂：硅胶，1％CMC，石油醚（60~90℃），乙醇，丙酮，乙醚，饱和NaCl溶液，无水Na2SO4【实验内容】溶剂萃取法:根据原料中被提取成分的极性、共存杂质的理化特性遵循相似相溶的原则，使有效成分从原料固体表面或组织内部向溶剂中转移的传质过程。即溶剂从溶剂主体传递至固体或组织表面，溶剂扩散渗入固体内部和内部微空隙内，化学成分溶解进入溶剂，通过固体微空隙通道中溶液扩散至表面，成分从固体表面传递至溶剂主体。薄层色谱法：又叫薄层层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固—液吸附色谱。一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的质。此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。例如在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。

薄层色谱是在被洗涤干净的玻板（10×3cm左右）上均匀的涂一层吸附剂或支持剂，带干燥、活化后将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起点线上，凉干或吹干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5cm。待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将色谱板取出，干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色。试样中各组分的分离效果可用比移值来衡量。比移值Rf：一次层析二次层析：在薄层层析时通过两次不同方向的流动相展开，以期获得样品的进一步分离的方法。一般是在第一次层析分离后，变换90°方向用相同或不同的溶剂系统进行第二次层析。柱层析法：柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。其原理是利用吸附剂对混合试样各组分的吸附力不同而使各组分分离。当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱【实验步骤】1.薄层板的制备（提前完成）：硅胶板和氧化铝板各4块，小的3块，大的1块。1%羧甲基纤维素钠配制（注意：羧甲基纤维素钠不好溶解在水中，所以溶解的过程中需要加热和搅拌，但是搅拌力度要掌握，溶液中尽量避免不要有气泡）；12ml1%羧甲基纤维素钠与10g中性氧化铝或硅胶混于烧杯中，调成糊状；取干净的载玻片，将上述糊状物倒于其上，振抖载玻片，使中性氧化铝或硅胶均匀涂于载玻片上，放平，阴干（要求表面要平整均匀，不能有裂痕）。2.色素的提取及浓缩取5g新鲜的绿叶洗净擦干后，用剪刀剪碎后于研钵中捣烂，过程中加入少许的乙醇，促使细胞壁破裂，依次用10ml乙醇、5ml×2石油醚提取，将合并的提取液放到50ml的分液漏斗中，用10ml×2水洗，弃去水层，石油醚层用少量的无水硫酸钠干燥，然后将石油醚层转移到带支管的试管内，用水浴加热，浓缩到0.5ml，盖上瓶塞。注意石油醚很容易挥发，如果浓缩量太少，样品容易干。3.薄层层析点样：使用在前100度烘箱烘1h（活化薄层板？）；在薄层板一端1cm处用铅笔轻轻划一道线；用细的毛细管蘸取混合液，点在线上，滴点时要小而圆，不可破坏薄层板。层析：三个层次缸中分别装入少量的展开剂，苯/丙酮＝7/3，石油醚/乙酸乙酯＝6/4，石油醚/乙酸乙酯/二乙胺＝58/30/12，展开剂装入高度约0.5cm（不要让展开剂溅起落到混样上）盖上缸盖；观察展开剂前沿上升，当到离板上端约1cm处时，取出。尽快用铅笔在前沿处划上一记号。晾干；计算各纯样的Rf值。双向层析：在薄层板上（7.5cm×7.5cm）距底边和左侧皆为1cm处点样，操作同上，展开剂到达离上端1。5cm处时，取出，在空气中完全干燥后，再以所显现的色点为样品点，进行二次展开，两次的展开剂都为苯/丙酮＝7/3。4．柱层析装柱：层析柱垂直放置，用25ml锥形瓶作洗脱液的接收器。将中性氧化铝粉末通过长颈漏斗加到色谱管的1/3处，再从上口倒入一干燥的烧杯中，加入适量的流动相（根据薄层层析选择合适的），调节其稠度；向柱中加入流动相至１/4处，打开活塞，控制流出速度为1滴每秒，此时从柱上端通过一干燥漏斗，慢慢加入调好的氧化铝和流动相混合物，用玻棒轻轻敲打柱身，使其装填均匀。整个过程保持流动相面要高于氧化铝。装完柱后剪一直经与色谱柱相当的滤纸片，用玻棒轻轻将其覆盖在氧化铝上，中间不能有空气；整个过程一直保持流速不变，液面不能低于氧化铝的上面。分离：当溶剂液面刚好流至滤纸面时，立即沿柱壁加入2滴混合样，当混合样流近滤纸面时，立即沿柱壁慢慢加入5ml流动相，注意不能溅起氧化铝，当溶剂液面刚好流至滤纸面时，立即沿柱壁再加入溶剂，如此反复，直至洗净为止。【基本实验技能及考核要点】1．制板时用注意使板上硅胶厚度尽量一致。2．植物叶片不要研成糊状，否则会给分离造成困难实验五叶绿素的定量测定(2学时)【实验目的】根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。【实验仪器与材料】（一）材料新鲜（或烘干）的植物叶片。

（二）仪器设备1.分光光度计；2.电子顶载天平（感量0.01g）；3.研钵；4.棕色容量瓶；5.小漏斗；6.定量滤纸；7.吸水纸；8.擦境纸；9.滴管。

（三）试剂1.96％乙醇（或80％丙酮）。2.石英砂。3.碳酸钙粉。

【实验内容】根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。已知叶绿素a、叶绿素b的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm处。已知在波长663nm下叶绿素a、叶绿素b在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据加和性原则列出以下关系式：A663=82.04Ca+9.27Cb（1）A645=16.76Ca+45.60Cb（2）式（1）（2）A663nm和A645nm为叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，CaCb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度，以mg/L为单位。解方程（1）（2）组得Ca=12.72A663—2.59A645(3)Cb=22.88A645—4.67A663(4)将Ca+Cb相加即得叶绿素总量CTCT＝Ca十Cb＝20.29A645—8.05A663(5)从公式（3）、（4）、（5）可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度另外，由于叶绿素a叶绿素b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）而求出叶绿素a、叶绿素b总量所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算：CT＝(6)有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。Licht-enthaler等对Arnon进行了修正，提出了80%丙酮提取液中3种色素含量的计算公式：Ca＝12.21A663—2.59A646(7)Cb=20.13A646—5.03A663(8)Cx.c＝(9)式中：CaCb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度；Cx.c为类胡萝卜素的总浓度；A663A646A470分别为叶绿素提取液在波长663nm646nm470nm下的吸光度。由于叶绿素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。绿素a、叶绿素b在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm,类胡萝卜素为470nm,可据此列出以下关系式；Ca＝13.95A665—6.8A649(10)Cb=24.96A649—7.32A665(11)Cx.c＝(12)【实验步骤】1.取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。

【基本实验技能及考核要点】按公式(10)、(11)、(12)（如用80%丙酮，按公式7、8、9）分别计算绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度（mg/L）。(10)、(11)式相加即得叶绿素总浓度。求得色素的浓度后再按下式计算组织中个色素的含量（mg/L鲜质量或干质量表示）：叶绿素含量（mg/g）=式中：C为色素含量(mg/L);V为提取液体积(mL)；N为稀释倍数；W为样品鲜质量或干质量(g)；1000即1L=1000ml。实验六植物组织中可溶性蛋白质含量的测定(2学时)【实验目的】衰老是植物在长期进化和自然选择中形成的一种生物学现象，它可以在植物的细胞、器官和整体等不同水平上表现出来。植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少。另外自由基代谢失调并在体内积累也是植物衰老的机理之一。本实验主要是测定植物衰老过程中叶片蛋白质的变化，掌握植物体内可溶性蛋白的测定原理及方法。【实验仪器与材料】1.材料：植物叶片2.仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴；研钵（或组织捣碎机）；试管；移液管；洗耳球等；3.试剂及配制提取液（50mmol·L－1Tris－HCl，pH7.8，含0.5mmol·L－1MgCl2，1mmol·L－1EDTA，1mmol·L－1二硫苏糖醇,缩写：DTT）。考马斯亮蓝溶液配制：称取考马斯亮蓝G－250100mg，加95％乙醇50ml，和85％磷酸100ml，然后定容至1000ml。0.15mol·L－1NaCl溶液牛血清蛋白标准母液配制:用0.15mol·L－1NaCl溶液配成100μg·ml－1牛血清蛋白标准【实验内容】植物材料经Tris－HCl缓冲液研磨、离心后，可溶性蛋白质溶于上清液中，非可溶性蛋白则存在于沉淀部分。将沉淀用碱水解，则会得到非可溶性蛋白的提取液。蛋白质提取液与考马斯亮蓝G－250反应呈蓝色。在一定范围内，蛋白质的含量与反应液在595nm波长的吸光度呈正比，由此可求出蛋白质的含量。【实验步骤】1.牛血清蛋白标准曲线的制作1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～100μg的牛血清蛋白标准液。试剂管号012345100μg·ml－1牛血清蛋白标准液（ml）Tris缓冲液（ml）考马斯亮蓝溶液（ml）0150.20.850.40.650.60.405每管牛血清蛋白含量（μg）020406080100加入表中试剂后，摇匀，以0号管为空白对照，在595nm波长处测定其吸光度（A）值。1.2标准曲线绘制以牛血清蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。2.蛋白质的提取称取叶片0.3～0.5g，剪碎于冷冻过的研钵中加提取液3ml，加少量石英砂，在冰浴中快速研磨成匀浆，匀浆倒入离心管中，再用5ml提取液（分两次）将研钵中匀浆洗入离心管，然后在10000r/min，4℃条件下离心20min将离心所得的沉淀加3ml1mol·L－1NaOH溶液，在90℃恒温水浴中加热20min后，在4000r/min，4℃条件下离心3.测定上述两种上清液各取0.1ml分别放入2支试管中，每管再加Tris缓冲液0.9ml，空白对照管加Tris缓冲液1ml，然后各管分别再加入考马斯亮蓝染色液5ml，摇匀，在595nm波长处测定吸光度（A）值。【基本实验技能及考核要点】根据所测得的样品液吸光度值，从标准曲线查出蛋白质含量，按下公式计算可溶性蛋白质和非可溶性蛋白质含量。标准曲线上查得蛋白质含量（μg）×提取液量（ml）可溶性蛋白质的含量＝————————————————————————（μg·g－1·Fw）样品鲜重（g）×测定时提取液用量（ml）实验七生长素对绿豆苗发根的影响(2学时)【实验目的】通过实验，了解生长素诱导植物不定根形成的原理和方法。【实验仪器与材料】1.材料：绿豆种子。2.设备：光照培养箱；100ml容量瓶；50ml烧杯；瓷盘；剪刀；木尺。3.试剂及配制：100μg·ml－1IAA母液：准确称取10mgIAA于小烧杯中，加几滴95﹪乙醇溶解后加蒸馏水稀释，然后倒入100ml容量瓶中定容至刻度。【实验内容】生长素不但能促进细胞的伸长与长大，而且能促进细胞的分裂与分化，用适宜浓度的生长素处理绿豆苗的下胚轴，可诱导不定根的发生。在一定浓度范围内，发生的根数与生长素浓度呈正相关。【实验步骤】1.绿豆苗的培养精选绿豆种，浸种后播入装有砂粒的瓷盘中，用砂粒复盖种子，在光照处25℃左右培养至长出22.系列IAA浓度溶液配制：用100μg·ml－1IAA母液稀释成10、1、0.1、0.01μg·ml－1的系列浓度溶液。3.诱导绿豆苗发根的培养3.1选取长势一致的砂培绿豆幼苗（2片初生叶和一心）60株，从子叶节起保留3cm下胚轴，其余下胚轴一起切除，并除去残留子叶。3.2取6个干净的50ml烧杯，编号，分别加入100、10、1、0.1、0.01μg·ml－1的IAA溶液20ml，对照（CK）加20ml蒸馏水。然后每个处理放10株。3.3将各处理放在透光良好的地方培养，观察发根时间及发根数。（要随时注意烧杯中的培养液位基本不变，如因蒸发减少时，用蒸馏水补充到原来液位。【基本实验技能及考核要点】培养10天左右，按下表格内容测量实验结果。不同生长素（IAA）浓度处理对绿豆幼苗发根的影响生长素浓度平均株高/株平均发根数/株平均根长度/株根粗细根鲜重/10株（μg·ml－1）（cm）(条)（cm）(－、+、++)（mg）（CK）0.010.11.10.100注：－表示根细、+表示根较粗、++示根粗壮实验八植物组织逆境伤害程度的测定——丙二醛含量的测定(2学时)【实验目的】通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。【实验仪器与材料】1.材料：植物叶片。2.仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。3.试剂：10％三氯乙酸；0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。【实验内容】丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100－300μg·g－1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5nmol·L－1。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。【实验步骤】1.丙二醛的提取称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片1g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。2.显色反应及测定取4支干净试管，编号，3支为样品管（三个重复），各加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。【基本实验技能及考核要点】毫摩尔吸收系数分别是7.4×10－3和155×10－3。532nm非特异性吸光值可以600nm波长处的吸光值代表。按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组即可求出MDA及可溶性糖浓度。方程组：A450=（85.4×10－3）·C糖（A532－A600）=（155×10－3）·CMDA+（7.4×10－3）·C糖解得：A450C糖=——————=11.71A450（mmol·L－1）85.4×10－3CMDA=6.45（A532－A600）－0.56A450-（μmol·L－1）公式中：A450—在450nm波长下测得的吸光度值A532—在532nm波长下测得的吸光度值A600—在600nm波长下测得的吸光度值﹡—1.55×105为摩尔比吸收系数C糖、CMDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。1.

按下式计算提取液中MDA浓度反应液体积（ml）CMDA×—————————1000提取液中MDA浓度（μmol·ml－1）=———————————————测定时提取液用量（ml）2.

按下式计算样品中MDA含量