实验-两对半的检测课件

ELISA检测“乙肝二对半”

(EnzymelinkedimmunosorbentAssay

ELISA)

酶免疫技术分类

酶免疫组化

酶免疫测定

固相酶免疫测定

液相酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定ELISA的概念酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）酶联：抗原或抗体的酶标记。免疫：以抗原抗体特异性反应为基础。吸附：抗原或抗体包被于固相载体表面。

在固相载体表面实现抗原抗体的反应，通过酶标记的手段，酶催化底物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色的深浅与标本中的抗原或抗体的量直接相关。

ELISA技术的应用检测抗原的方法：双抗体夹心法竞争法检测抗体的方法：双抗原夹心法间接法竞争法捕获法实验目的掌握ELISA法检测“乙肝二对半”的原理、操作步骤及注意事项。掌握检测“乙肝二对半”的临床意义。

什么是“乙肝二对半”？“乙肝两对半”是指：表面抗原（HBsAg）、表面抗体（HBsAb）、e抗原（HBeAg）、e抗体（HBeAb）、核心抗体（HBcAb）HBsAg本身不具有传染性，只具有抗原性保护性抗体：HBsAb传染性指标：HBeAg，HBcAgHBeAb，HBcAb不是保护性抗体，而是反映曾被HBV感染的重要指标。为什么不检测核心抗原（HBcAg）HBcAg主要位于病毒颗粒中，只有少数游离。机体免疫系统对HBcAg很敏感，易产生高滴度的HBcAb,与HBcAg形成免疫复合物。血清中，HBcAg可丢失部分氨基酸。双抗原（体）夹心法测抗体（原）包被抗原*酶标抗原待测抗体包被抗体*酶标抗体待测抗原Anti-HIV,Anti-HBs双抗体夹心法双抗原夹心法HBsAg,HCVcoreAg,HBeAg,HBVpreS1,PreS2竞争抑制法测抗体包被抗原待测抗体*酶标抗体

Anti-HBcAnti-HBe试剂盒组成包被反应板：固相的抗原或抗体酶结合物：酶标记的抗原或抗体显色剂：分A、B二瓶终止液对照：阳性对照，阴性对照浓缩洗涤液中和试剂（只有检测HBeAb的试剂盒才有）实验准备配制洗涤液：用蒸馏水按1：20稀释浓缩洗涤液。为节省试验时间，除检测核心抗体（HBcAb）组外，其余组可在加样后的温育时间中才配制洗涤液。实验操作1、加样：第一、二孔为阴、阳对照孔，分别加入阴、阳对照50ul。其余各孔为样品孔，各加入待测标本50ul（检测HBcAb时，待测标本需用稀释后的洗涤液做1：30稀释）。2、加中和试剂（只有检测HBeAb时才需要）：每孔50ul3、加酶结合物：每孔50ul4、温育：封板→充分混匀后置37°C水浴30分钟5、洗涤：弃去反应条孔内液体，用洗涤液注満每孔，放置或振荡1分钟，弃去拍干→反复5次（注意：最后一次一定要拍干）6、显色：每孔先加显色剂A50ul，再加显色剂B50ul，混匀后置37°C水浴10分钟7、中止显色：每孔加入中止液50ul8、判断结果：①目测法：HBsAg，HBsAb，HBeAg

HBeAb，HBcAbELISA的注意事项标本：内源性（RF、补体、嗜异性抗体等）外源性因素（溶血、细菌污染、保存不当、凝集不全、防腐剂NaN3等）（P229）试剂：试剂质量、批号、是否失效（冰箱温度）、平衡（37度°C30分钟）、摇匀加样：加样准确、不可太快，避免加在上部和产生气泡。温育：温度（定期观察与登记）、时间、湿度、封片（不可重复用）洗板：洗涤液用蒸馏水或去离子水现配、防止洗板机堵塞、洗完要拍板。显色：加试剂时不可重复加和漏加，或加在两孔之间，不要产生气泡，及时终止。比色：建议用双波长（可排除标本浓度、干扰色、电路干扰、板底部划痕的影响）。结果判定：反应终止后10分钟内质量控制：内对照、室内质控、室间质