酶联免疫吸附测定吴砂110407课件

4.13中午12：00将实验报告按学号整理好交到本楼3楼教师休息室基础医学院免疫学教研室酶联免疫吸附测定

（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）免疫学教研室操作步骤包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜→→→洗涤：3次，1min/次加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37℃

15min洗涤：3次，1min/次封闭：5%脱脂奶粉，37℃20min加待检抗体：倍比稀释的兔抗鼠IgG抗血清，37℃15min加底物液显色→洗涤：3次，1min/次→终止液50ul 空白对照无显色待测样品显色明显EEEE底物液50ulA,B两排同样操作，每孔加１００ul!基础医学院免疫学教研室免疫荧光技术基础医学院免疫学教研室放射元素标记技术基础医学院免疫学教研室用FITC-抗IgM单抗计数B细胞免疫荧光技术基础医学院免疫学教研室课程内容ELISA的原理ELISA的分类间接ELISA的具体操作ELISA在医学中的应用实例基础医学院免疫学教研室间接ELISA实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价实验材料：包被抗原：小鼠血清待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG聚苯乙烯酶标板水浴箱

移液器枪头包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液

封闭液/

封：5%脱脂奶粉(ALB)稀释液/稀：pH7.40.05M的PBS（磷酸盐缓冲液）

洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20）

显色液：OPD（邻苯二胺）

终止液/终：2M硫酸鼠IgG(抗原)兔抗小鼠IgG(一抗)HRP-驴抗兔IgG(二抗)免疫Fc段基础医学院免疫学教研室A,B排上样完全相同：复孔AB

123456789101112

2-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入200uL一抗，从１号孔吸取100uL加到２号孔中，混匀，从２号孔吸取100uL加到３号孔中，混匀，．．．．．１１号孔吸取１００uL，丢弃！每孔终体积100uL无Ab,仅稀释液基础医学院免疫学教研室直接ELISA酶标一抗基础医学院免疫学教研室间接法的原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。可用于传染病的诊断。（二）间接法（测抗体）酶标二抗一抗AgwashBSAwashwashTMB基础医学院免疫学教研室（三）双抗体夹心法（测抗原）只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。包被Ab酶标AbAgTMBwashwashwash基础医学院免疫学教研室（四）竞争法（HBcAb

）

当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb，HBcAb；

小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

washTMB标准HBcAg标准酶标HBcAbwash待检HBcAb基础医学院免疫学教研室操作步骤包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜→→→洗涤：3次，1min/次加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37℃

15min洗涤：3次，1min/次封闭：5%脱脂奶粉，37℃20min加待检抗体：倍比稀释的兔抗鼠IgG抗血清，37℃15min加底物液显色→洗涤：3次，1min/次→终止液50ul 空白对照无显色待测样品显色明显EEEE底物液50ulA,B两排同样操作，每孔加１００ul!基础医学院免疫学教研室ELISA在其他相关领域中的应用科研服务食品安全……环境卫生基础医学院免疫学教研室DH2+H2O2

D+2H2ODH2为供氢体，H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。酶催化底物液显色E基础医学院免疫学教研室Ag-AbReaction1015202530终止液30-50min基础医学院免疫学教研室结果的判定肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。各组各人独立观察记录。测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔OD值2倍为阳性。基础医学院免疫学教研室定量方法：标准曲线待检样本基础医学院免疫学教研室注意事项对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照）倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高浓度方向进行终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准2MH2SO4具有腐蚀性，操作过程中