武汉大学临医免疫学试验课

2013年临床医学专业免疫学实验课一、间接免疫荧光（写实验报告）二、ELISA法检测HBs-Ab（写实验报告）三、凋亡细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳分析（写实验报告）第二次

实验课内容免疫标记技术

免疫标记技术是指用酶、荧光素、同位素等标记分子标记Ab或Ag，通过酶联比色仪、荧光显微镜或放射测定来定量检测AgAb反应。免疫标记技术不改变标记的Ag或Ab的性质，不改变包被的Ag或Ab的性质，不影响AgAb反应的特异性。该技术具有灵敏性高及特异性强，既能定性、定量，又能定位检测的特点。免疫标记技术包括免疫酶技术（如酶联免疫吸附试验）、免疫荧光技术、放射免疫测定等方法。

免疫荧光技术

是利用荧光素标记的抗体来分析或定位相应抗原，以测定细胞相应抗原的存在。广泛应用于免疫学中的一种荧光素是异硫氰酸荧光素（FITC），当在荧光显微镜下用紫外线照射时，发出可见的黄绿色荧光。另一个广泛应用的荧光素是藻红蛋白（PE），发出可见的红色荧光。免疫荧光技术分为直接法、间接法和补体法等。免疫荧光技术-直接法免疫荧光技术-间接法免疫荧光技术-补体法补体法

实验三间接免疫荧光[原理]间接免疫荧光法是用荧光素标记二抗以检测Ag或Ab的一种实验技术。其原理是Ag首先与一抗结合，然后一抗再与荧光素标记的二抗结合，形成一个Ag-Ab1-荧光素标记Ab2的三分子复合物，在荧光显微镜下呈现荧光。实验材料：抗原：分离人PBMC一抗：兔抗人白细胞血清二抗：FITC-抗兔单克隆抗体已划好标记圈的标本片洗脱液（PBS）间接免疫荧光法操作步骤：一、分离新鲜人血清中的PBMC

外周血单个核细胞分离

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葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法[原理]外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重为1.077左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。[材料]1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为1.077±0.001g/L）2、Hank’s液或者RPMI-1640培养基3、试管、吸管、水平离心机等[方法]1、无菌采集静脉血2-3ml，注入盛有肝素的抗凝试管中，混匀。2、吸取淋巴细胞分层液3ml加入离心管中，再将稀释抗凝血液2ml（剩余的抗凝血离心取血浆作检测HBsAb用)小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。（关键）3、室温2000r／min离心20min。管内可分为四层。4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加入到1.5ml的EP管中作细胞抗原备用。

（淡黄色）（乳白色）（无色）（白色）（红色）二、涂细胞抗原片将PBMC用适量PBS稀释，取10μl左右液体滴加到标本片黑色圈圈背面中央。静止5-10分钟，待PBMC干燥。固定。三、加入一抗将稀释好的一抗约15μl滴加到涂有细胞的标本片处（可看到一小薄层圆圈），37℃，湿盒孵育30分钟。四、漂洗阶段。甩干标本片上液体，小心擦去圆圈周围的残余液体，于圆圈中央滴加洗脱液1滴，水平来回震荡，静置5分钟，再甩去液体。重复上述步骤，洗涤5次。五、加入荧光二抗（整个实验过程需关闭强烈光源，避光！）将二抗约15μl滴加到涂有细胞的标本片上（可看到一小薄层圆圈）。37℃，湿盒避光孵育30分钟。

六、漂洗阶段。同步骤4，洗涤5次。

七、镜检。将干燥后标本片移至荧光显微镜下观察结果。FITC为绿色荧光。结果观察：荧光显微镜观察：暗背景中有绿色荧光细胞实验四

酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。由于Ab

或Ag与酶连接后，仍保持免疫活性和酶活性，当相应Ag、Ab特异性结合后，其分子上的酶作用相应底物时，可引起底物水解显色，根据颜色的有无和深浅来检测Ab或Ag。常用ELISA检测方法有：间接法、抗原竞争法、夹心法（双抗体夹心法、双抗原夹心法）和其他方法。间接法

基本原理与类型

双抗体夹心法

竟争法

实验条件选择：

固体载相：纤维素、聚苯乙烯板

底物：价廉、安全、本身无色、酶解后出现颜色

终止反应：强酸、强碱，以保持实验时间不需太长

终点测定：目测、分光光度计酶：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）

底物：分解后颜色溶解度

邻苯二胺（OPD）深桔黄色大3,3,5,5,-四甲基联苯胺（TMB）蓝绿色大

碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)底物：分解后颜色溶解度萘酚（AS-mx）、快蓝（FB）蓝色小快红（FR）红色小ELISA（双抗原夹心法）查HBs-Ab

[原理]

采用纯化HBsAg包被酶标板，加入待测标本，同时加入酶标抗原（HBsAg-HRP），当标本中存在抗HBsAg的抗体HBsAb时，HBsAb与包被HBsAg结合并与HBsAg-HRP结合形成HBsAg－HBsAb-HBsAg-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。[材料]1、HBsAg包被酶标板2、酶标抗原（HBsAg-HRP）3、阳性对照（HBsAb+）4、阴性对照（HBsAb-）5、待测标本（血浆）6、洗涤液7、显色剂A+显色剂B（TMB底物）8、终止液[方法]1、在已包被抗原的酶标反应板的每孔中加入待测标本50μl，设阴性对照、阳性对照各两孔。孔内均加相应的试剂一滴。并设空白对照孔1孔。2、

每孔加入酶标抗原一滴（空白对照孔除外），充分混匀，封板，37℃孵育30分钟。3、洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复五次后拍干。4、

每孔加入显色剂A、显色剂B各一滴，充分混匀，封板，37℃孵育15分钟。（蓝绿色）5、每孔加入终止液一滴，混匀。（黄色）6、观察各孔颜色变化。思考题：为什么标记一种抗抗体能检测多对抗原抗体系统？附：乙肝病毒（hepatitisBvirus，HBV）抗原：抗体1、表面Ag（HBsAg）HBsAb2、核心抗原（HBcAg）HBcAb3、e抗原（HBeAg）HBeAb两对半：HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb

HBV-Ag、Ab检测结果临床分析HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb+----HBV感染/无症状携带者+-+--急性/慢性乙肝/无症状携带者+-+-+

急性/慢性乙肝（传染性强，大三阳）

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+

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急性感染趋向恢复（小三阳）-+-+

+

既往感染恢复期-+--+

既往感染恢复期---+-既往感染或“窗口期”-+---既往感染或接种过疫苗12345

实验五凋亡细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳分析

【原理】本实验是利用琼脂糖凝胶电泳分析小鼠胸腺淋巴细胞在地塞米松诱导下细胞的凋亡现象。细胞在凋亡过程中有一系列特征性的形态学的改变，其中最重要和最具有特征性的改变是Ca2+/Mg2+依赖性的核酸内切酶的激活而导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，降解为180~200bp的片段或其整倍数的片段，通过琼脂糖凝胶电泳可形成典型的“梯状带”。

【材料】昆明小鼠RPMI-1640培养基小牛血清地塞米松基因组DNA抽提试剂盒10mg/mlRNA酶TE缓冲液(pH8.0)50×TAE电泳缓冲液DNAladder分子量标准品6×凝胶加样缓冲液眼科剪、眼科镊、不锈钢网、250目尼龙滤布、台式高速离心机、恒温水浴、琼脂糖凝胶电泳装置、紫外透射仪等

【方法】一、1％琼脂糖凝胶的制备称取1g琼脂糖粉溶于100ml1×TAE缓冲液中，隔水煮沸溶解(或微波炉中溶解）。取15ml上述1％琼脂糖制成凝胶板备用。

二、胸腺细胞的制备：眼球摘除放血颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取胸腺，置入含5%小牛血清的预冷RPMI-1640培养液中，先用不锈钢网研磨，再将研磨好的细胞悬液用250目尼龙滤布过滤，1000rpm离心4min，调整细胞浓度为1x107/ml。取上述1x107/ml浓度的胸腺细胞加入终浓度为1x10－5M的地塞米松，培养5h即为凋亡阳性细胞，不加地塞米松为对照组。（去上清，沉淀细胞加1ml1640混匀备用）。三、小鼠胸腺细胞DNA快速提取小鼠胸腺细胞（细胞浓度107/ml）（诱导组和未诱导组）EP管(1.5ml)弃上清充分混匀后，55℃温浴20分钟。12000转/分，10秒20mlA液和100mlL液加入10μl3MNaAc和1250μlB液充分振荡混匀后离心12000转3分钟期间颠倒EP管五次移取700ml至吸附柱中,静止1分钟，离心30s。弃去收集管中的液体，重复上述操作。加入600μlW液离心30s。弃去收集管中的液体，重复上述操作，再离心1次将吸附柱移入一个干净的EP管中(1.5ml)中。在吸附膜的